实时荧光定量PCR检测lncRNA干扰效果论文_刘海柏12 ,王丹琪, 刘慧1(通讯作者)

1长沙医学院 湖南 长沙410000

2石家庄医学高等专科学校 050000

[摘要] 目的:探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)干扰后,在人支气管上皮细胞(the human bronchial epithelial cells,16HBE)中的表达情况。方法:应用real-timePCR方法检验lncRNA- ENST00000414355干扰效果。结果: 正常16HBE细胞中ENST00000414355干扰48h后,三条阳性序列的实验组ENST00000414355表达均下降,都具有统计学意义P值均<0.0001;在氯化镉转化16HBE成瘤细胞中ENST00000414355干扰后,第一条阳性序列转染下达到沉默效果,且具有统计学意义P<0.0001;在氯化镉转化16HBE第35代细胞在ENST00000414355三条阳性序列转染下没有出现沉默效果所示。结论:ENST00000414355在正常16HBE细胞中干扰效果最明显,在氯化镉转化16HBE成瘤细胞中只有一条序列有干扰效果。

[关键词] 实时荧光定量PCR,LncRNA,16HBE

镉(Cadmium,Cd)是一种毒性极强的重金属元素,在自然界中广泛存在[1]。镉具有广泛的毒理学效应,镉及其化合物可通过呼吸道和消化道进入机体,从而对机体产生毒性损害,长期摄入低剂量的镉会引起机体慢性中毒,对肾脏、骨骼、生殖、呼吸及免疫系统都有毒副作用,甚至导致多种癌症的发生。近年来的研究表明,lncRNA以RNA的形式调控蛋白编码基因在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种层面的表达水平[1] 。并且,lncRNA参与了X染色体沉默,基因组印记现象以及染色质修饰、转录激活、转录干扰,及转录后调控、核内运输、调节原癌基因活化等多种重要的调控过程[2-3],本次课题旨在研究LncRNA在镉恶性转化16HBE细胞中的沉默表达。

1.材料和方法

1.1试验材料

1.1.1细胞 正常人支气管上皮细胞(the human bronchial epithelial cells,16HBE), 氯化镉(CdCl2)诱发16HBE细胞恶性转化至第5代细胞、氯化镉诱发16HBE细胞恶性转化至第15代细胞、氯化镉诱发16HBE细胞恶性转化至第35代细胞、氯化镉诱发16HBE细胞恶性转化成瘤细胞[1]均用含胎牛血清10%( V/ V) 的MEM培养液, 在37℃、5% CO2、饱和湿度环境中培养。

1.1.2试剂、仪器 MEM培养基(Hyclone,USA)、胎牛血清(Hyclone,USA)、反转录试剂盒(Fermentas K1622) (Fermentas,canada)、RT-PCR试剂盒Fermentas k0222 (Fermentas,canada) 、超净工作台(MOV-13BSU,SANYO,Japan)

高压蒸汽灭菌器(MLS-3750,Sanyo,Japan)、高速低温离心机(AllegraTM X22R,Beckman,USA)、低速离心机(Model-LSY,Beijing,China)、微型离心机(MSE, Sanyo,Japan)、PCR仪器(ABI Stepone Plus,USA)

1.2试验方法

1.2.1 siRNA干扰

为了达到干扰效果,lncRNA-ENST00000414355[2]设计三个阳性干扰序列使lncRNA在正常16HBE细胞、氯化镉转化16HBE第35代细胞和氯化镉转化16HBE成瘤细胞中沉默掉。实验分3组:目的质粒转染组、对照siRNA干扰转染组和未转染组。lncRNA- ENST00000414355干扰设计的三组阳性序列为实验组,siRNA-NC为对照组:

1.2.2 细胞转染

1)转染前一天,培养基换成不含抗生素的培养基;

2)转染当天,细胞汇合率达到70%以上;

3)吸去旧的培养基,用PBS轻洗2次,每孔加入1.6ml 无血清培养基,置于5% CO2、37℃培养箱中;

4)取浓度为20μM的siRNA/microRNA 2μl, 加入400μL无血清培养基中,混匀后,加入4μL Turbofect siRNA transfection reagent,混匀后在室温下孵育15-20min。

5)每孔加入上述(4)中孵育好的转染复合液400μl,置于5% CO2、37℃培养箱中培养4-6h后换成正常的完全培养基。

6) 转染后48h,检测RNA表达水平。

1.2.3 Real-time PCR反应

ABI Stepone Plus仪器上进行lncRNA-ENST00000414355在正常16HBE细胞,镉处理16HBE细胞35代龄和恶性转化细胞接种裸鼠成瘤细胞中的定量PCR,用于确定siRNA干扰沉默效果。引物为ENST00000414355之前设计好的引物。

1.3结果与分析

正常16HBE细胞中ENST00000414355干扰48h后,三条阳性序列的实验组ENST00000414355表达均下降,都具有统计学意义P值均<0.0001(如图1);在氯化镉转化16HBE成瘤细胞中ENST00000414355干扰后,第一条阳性序列转染下达到沉默效果,且具有统计学意义P<0.0001(如图2);在氯化镉转化16HBE第35代细胞在ENST00000414355三条阳性序列转染下没有出现沉默效果(如图3)所示。

1.4讨论

随着LncRNA不断被发现,研究人员越来越关注LncRNA在各种生物学过程以及疾病中的功能。为了更好地研究LncRNA的功能,在差异高标达的LncRNA中选取了在16HBE细胞中及转化细胞中表达趋势最明显且表达水平具有统计学意义的LncRNA-ENST00000414355进行进一步研究,将LncRNA-ENST00000414355在16HBE细胞沉默,通过Real-time PCR验证沉默效果验证,其结果差异有统计学意义。

[参考文献]

[1] Miao Sun,W. Lee Kraus. From Discovery to Function: The Expanding Roles of Long NonCoding RNAs in Physiology and Disease[J].Endocr Rev,2015 , 36(1): 25–64.

[2] Francesco P. Marchese, Ivan Raimondi,Maite Huarte.The multidimensional mechanisms of long noncoding RNA function [J].Genome Biol,2017; 18: 206.

[3] Jeremy Ew.Hongjae S.David LS.Long non coding RNAs:functional surprises from the RNA world [J].Genes Dev,2009,23(13):1494-1504.

论文作者:刘海柏12 ,王丹琪, 刘慧1(通讯作者)

论文发表刊物:《航空军医》2019年第03期

论文发表时间:2019/5/15

标签:;  ;  ;  ;  ;  ;  ;  ;  

实时荧光定量PCR检测lncRNA干扰效果论文_刘海柏12 ,王丹琪, 刘慧1(通讯作者)
下载Doc文档

猜你喜欢