陆云[1]2001年在《昆明稀毛小鼠突变基因的染色体定位及病理研究》文中指出脱发或称秃发是一种常见的人类疾病，在人群中发病率为20％-24％，常见的为男性型脱发（Androgenetic alopecia），斑秃（Alopecia areata），先天性秃发（Congenital alopecia），静止期头发猝落（Telogen effluvium）等。脱发既有先天遗传性又受后天因素影响，例如：压力，饮食，自律神经失调等。但引起脱发的具体原因仍所知甚少。所以无毛和稀毛突变小鼠成为研究毛发生长的良好实验室模型。 自发和诱发毛发突变小鼠是研究哺乳动物相关基因及其功能的重要实验材料，也是人类头发与皮肤遗传疾病研究的理想动物模型。随着人类基因组计划的完善与发展，基因定位的方法也越趋简便与精确。现在在人与小鼠基因定位上最常用的方法为以微卫星DNA为遗传标记的全基因组扫描法。本实验用这种方法将引起昆明稀毛小鼠突变的基因定位于第19号染色体，同时还建立了用AFLP定位的方法体系，并把这两种定位方法进行比较，认为对于品系间多态性相差较小的小鼠其染色体定位用全基因组扫描法比用AFLP法更为经济有效。 近几年来，已发现的影响小鼠被毛结构的基因几乎遍布其所有染色体，在第19号染色体也有影响皮肤和被毛多少的候选基因。本实验用一种新型自发突变稀毛小鼠（由北京大学实验动物部提供）与B10Sn和DBA的回交F2代为样本，以158个微卫星DNA为遗传标记设计引物，用Genotyping技术对小鼠进行全基因组扫描。发现在第19号染色体的41.0cM至47.0cM区高度连锁，在此区域有Chuk，Scdl，Fgf8，Sgl等稀毛候选基因。本实验把这种稀毛小鼠突变基因定位于第19号染色体后半部的6cM区域，为该基因的精确定位以及进一步的功能研究提供了可能。此外本实验还在组织学水平对突变小鼠进行研究，发现突变小鼠的 甩明稀毛小凤贝叉篡因的具色体泛位及厂理研贝q文打婴皮脂腺和毛囊都发育异常，说明本实验小鼠是一种少有的伴有皮脂腺异常的被毛突变小鼠模型，为研究皮肤附属物在毛发发育中的作用及相互关系提供了良好的实验动物模型。
茅慧华[2]2007年在《snthr～（-1Bao）稀毛小鼠生物学特性的研究、突变基因精确定位和毛发调节基因的QTL定位》文中指出小鼠(Mus musculus, mouse)是生物医学中应用最广泛的实验动物之一,随着现代生物医学的不断发展,基因功能的比较研究、人类疾病发生机制的研究及药物开发等需要越来越多不同类型的模型动物。小鼠因其与人类的基因组序列、生化代谢及生理特点的相似性而成为研究人类基因功能和疾病最理想的模式动物。小鼠模型的获得有自然突变、诱变、基因陷阱、转基因或基因敲除等多种方式。snthr-1Bao稀毛小鼠(注:本稀毛小鼠由The Jackson Lab专家指导命名,尚未递交到MGI(Mouse Genomic Informatics))是本实验室2002年通过ENU(乙酰基亚硝基脲)诱变获得的一种呈隐性遗传的突变种,背景品系为DBA/2,最显着的可见表型为被毛稀疏。我们通过遗传学手段,采用基因组扫描的办法将snthr-1Bao小鼠突变基因初步定位于第9号染色体,距着丝粒71cM处。被毛突变小鼠是皮肤科学研究的绝好材料,定位、克隆被毛突变基因能够揭示被毛脱落的分子机制。更为重要的是,通过同源检索可以找到人类的相关基因,为人类疾病的研究提供新的思路,探询药物治疗的新靶点。本文对snthr-1Bao稀毛小鼠的生物学特性进行了较为详细的研究,精确定位了稀毛突变基因以及对该稀毛小鼠毛发调节基因的QTL(quantitative trait loci,数量性状基因座)进行了初步定位。我们的工作分为四个部分:1. snthr-1Bao稀毛小鼠的生物学特性对稀毛小鼠snthr-1Bao和对照组DBA/2小鼠的生长情况、繁殖性能、形态学、大体解剖学和血液生理指标进行了观察。从两种品系仔鼠初生起每周称取仔鼠的重量直至12周龄,比较它们的生长情况并观察稀毛小鼠snthr-1Bao和对照组DBA/2小鼠每窝的产子情况。分别取25只2月龄snthr-1Bao小鼠和对照组DBA/2小鼠称重后脱颈椎处死,解剖观察各内脏器官的位置和形态结构,取它们的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、脑、生殖器官等脏器去淤血后称重,比较脏器的绝对重量和脏器系数。分别取20只(公母各10只)2月龄snthr-1Bao小鼠和对照组DBA/2小鼠眶静脉采血,大约300μl置于加有抗凝剂的指形管中,用于生理指标的分析。结果snthr-1Bao小鼠初生重比对照组DBA/2小鼠轻,四周前每周体重较DBA/2小鼠亦轻,4周龄后公鼠体重与对照差异不大,雌鼠直至成年均较背景品系轻,表明snthr-1Bao小鼠的生长发育较DBA/2小鼠迟缓,而且被毛异常,呈稀疏状。在繁殖学特性方面,snthr-1Bao小鼠与DBA/2小鼠相比雄性睾丸组织绝对重量和脏器系数均比DBA/2小,差异呈极显着性(p﹤0.01);雌性子宫卵巢的脏器系数较DBA/2母鼠小,差异均呈极显着性(p﹤0.01);断奶仔数比DBA/2小鼠少,差异呈极显着性(p﹤0.01)。对大体解剖学特性的观察表明,两种品系小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、脑、生殖器官等脏器的位置、形态结构间无差异,但有些脏器的绝对重量和脏器系数存在品系间差异(p﹤0.05或p﹤0.01)。血液生理指标方面两种品系小鼠相比在白细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜碱细胞的数量上存在差异(p﹤0.01)。因此,该突变不仅影响snthr-1Bao小鼠被毛的正常生长,还影响小鼠的生长发育、脏器的绝对重量和脏器系数、繁殖性能及血液生理指标。2. snthr-1Bao小鼠各组织的病理变化及皮肤的生长发育分别取2月龄snthr-1Bao稀毛小鼠和正常DBA/2小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、淋巴结、胸腺、睾丸附睾、卵巢子宫、肠组织、肠淋巴结等脏器,用10%福尔马林固定、脱水、包埋后行石蜡切片,HE染色,观察snthr-1Bao稀毛小鼠各脏器的病理变化。分别取snthr-1Bao稀毛小鼠和DBA/2小鼠胚胎期18.5天、初生、1周龄、2周龄、1月龄、2月龄时期的背部皮肤,同样用10%福尔马林固定、脱水、包埋后行石蜡切片,HE染色,观察snthr-1Bao稀毛小鼠皮肤的发育情况及病理变化。观察组织病理切片,snthr-1Bao稀毛小鼠除皮肤外其它内脏器官均无明显病理变化。发现初生到1周龄前两种小鼠的皮肤无较大差异,部分毛囊开始发育,皮下脂肪和皮脂腺开始出现,皮肤结构未见异常。1周龄到2周龄时,snthr-1Bao小鼠表皮及真皮层较厚,表皮及毛囊角化显着,皮脂腺增多。毛根排列不规则,部分毛发出现卷曲,不能长出皮肤表面。真皮内成纤维细胞增多,处于瘢痕形成阶段。随着年龄的增加,snthr-1Bao小鼠皮肤病变加重。1月龄时,snthr-1Bao小鼠皮肤棘细胞层肥厚,与对照比明显增加数倍,表皮及毛囊角化显着。部分毛发在皮内卷曲、横生,未能穿出皮肤,仍有部分毛发尚正常生长。皮下纤维细胞显着增多,排列紊乱,呈陈旧疤痕状。虽然随着小鼠年龄的增加,皮肤厚度变薄,皮脂腺数量增加,但与对照DBA/2小鼠相比snthr-1Bao小鼠的皮肤厚度仍然显着增加,皮脂腺数量增加得更多。因此snthr-1Bao小鼠皮肤组织病变始发于出生后1～2周,随年龄增长,病变加重。皮肤的原发病变是棘层肥厚、角化过度及部分毛发结构有缺陷。继发病变则包括毛发皮内卷曲,皮肤损伤并引发局部非感染性炎症,继而导致疤痕形成。3. snthr-1Bao小鼠突变基因的精确定位及候选基因提出先前的研究中,我们利用145只F2小鼠[(C57BL/6J×DBA/2)F1]互交及D9Mit18将突变基因定位于小鼠第9号染色体距着丝粒71cM处。为了进一步更精确定位该突变基因,需要扩大繁殖F2代小鼠、选择更多靠近突变基因的基因组标记。我们共繁殖F2小鼠4500余只,其中筛查到具有稀毛表型的F2小鼠1100只,提取这部分小鼠基因组DNA,PCR扩增后分析基因型。并在D9Mit18(距着丝粒119987Kb)两端共选取了16个STS、2个微卫星、35个SSR及3个SNP标记,设计合成引物,PCR扩增后电泳,筛选在DBA/2和C57BL/6JJ间呈多态性的标记。结果筛选到D9Mit151 (据着丝粒121180Kb )、SSR NC_000075_60440_61095(据着丝粒119129Kb)、2个SNP rs8254361(据着丝粒119332Kb)和rs30195705(据着丝粒117761Kb)共4个基因组标记在DBA/2和C57BL/6J间呈多态性的标记,PCR产物经电泳后可将DBA/2和C57BL/6J区分开。经过对1100只F2小鼠的检测,突变基因与D9Mit18有10例交换,与D9Mit151间有28例交换,与rs8254361间共出现3例交换,与NC_000075_60440_61095间也有3例交换,而与rs30195705有15例交换。由于使用了1100只F2小鼠,实际能够反映2200例染色体交换情况,定位精度已在100/2200=0.05cM左右。经计算突变基因在距着丝粒117762Kb～119129Kb间,大约1.3Mb。搜索小鼠基因组数据库,发现期间共有已发现的基因15个,其中Itga9、Golga4、Azi2、Dlec1、Oxsr1、2010110K16RiK、Ctdspl、Vill、Plcd1、Acaa1b共10个基因在皮肤有表达。用FQ-PCR检测这10个基因在snthr-1Bao小鼠和DBA/2小鼠皮肤中的表达量,发现基因Itga9高表达,基因Azi2和Plcd1低表达。但对Itga9测序未发现突变。查询资料发现Plcd1基因敲除小鼠与snthr-1Bao小鼠表型及其相似。综合生物学特征研究、精确定位、FQ-PCR检测及数据库资料,我们确定Plcd1为snthr-1Bao小鼠的强力候选基因。本研究为克隆稀毛突变基因打下了坚实的基础。4. snthr-1Bao小鼠毛发调节基因的QTL定位观察到snthr-1Bao小鼠与C57BL/6J杂交后的F1代再互交得到的F2代小鼠的稀毛表型不同于亲代snthr-1Bao小鼠,其稀毛表型可以分为叁种:多毛发型、少毛发型和毛发数量处于中间的中间型。我们的猜测是,在对突变基因定位交配的过程中可能有相关基因从C57BL/6J介入到F2小鼠中,调节了本来突变基因的功能。基于这一设想,我们设计了一个新的QTL位点的基因定位策略来寻找这些相关基因:将F2稀毛小鼠按照毛发疏密的程度取其2个极端类型:多毛发型和少毛发型,提取这些小鼠的基因组DNA;并在小鼠19条常染色体上选取了35个微卫星对70个多毛发型F2样本和57个少毛发型样本进行了全基因组扫描,分析每个样本在每个位点上的基因型,计算基因频率。然后利用R/qtl1.04-53软件,通过线性回归模式和Logistic回归分析,以染色体位点显着性水平的阈值p为0.63且LOD值超过2为标准分析可能存在的QTL,发现D4Mit17、D11Mit258、D12Mit136、D14Mit50和D15Mit34五个位点可作为候选QTL。接着进行QTL的单基因效应分析,分别计算这5个候选位点与毛发疏密之间的效应关系,发现D4Mit17和D15Mit34两个位点有使毛发增加的效应,而D11Mit258、D12Mit136和D14Mit50叁个位点则有使毛发变稀少的效应。在这些分析结果的基础上,针对这5个候选QTL详细比较分析他们之间的可能的互作效应。经过叁次运算,我们发现D11Mit258、D14Mit50和D15Mit35相互间有相互作用的关系,且统计学效应十分显着,p值均小于0.01,LOD值都在2.3以上。本实验成功发现了分别导致F2代小鼠毛发增加的D15Mit34位点和毛发减少的D11Mit258和D14Mit50两个位点。这些调节位点附近的基因与snthr-1Bao极有可能在同一分子信号过程中相互作用,调节毛发的生长发育。这对进一步研究snthr-1Bao稀毛小鼠的表型分子机制及寻找药物靶点提供了极好的线索。
茅慧华[3]2004年在《ENU诱变获得两例新的稀毛小鼠及其突变基因的染色体定位》文中进行了进一步梳理脱发或秃发是一种常见的人类疾病，在人群中有一定的发病率。脱发有先天遗传性或受后天外部因素影响而形成，如压力、饮食习惯、神经混乱、X光照射、药物引起等。但目前对于脱发的原因知之甚少，由于小鼠和人类基因组的高度同源，因此被毛突变小鼠是研究毛发生长和秃发机理的难得的动物模型，如无毛小鼠和稀毛小鼠。此类突变小鼠通常由自发或诱发突变得来。本文即用ENU诱变获得了两例新的稀毛小鼠并对突变基因进行了染色体定位。本论文的工作由叁部分组成。 1．ENU诱变获得两例新的被毛突变小鼠 用DNU(100mg／Kg)腹腔注射18只8-10周龄的雄性DBA／2小鼠(G_0)，每周一次共叁次；与同品系小鼠配种，在后代小鼠中针对可见表型筛查突变个体。将在后代小鼠(G_1)筛查到的突变个体与同品系配种，若异常表型传代则可能为显性突变；选择表型正常的G_1雄鼠与C57BL／6J配种得F_1，将F1随机互交得到F_2，依据F_2是否有突变鼠出现确定可能存在的隐性突变。结果表明，在352只G_1小鼠中，14只出现异常表型，但均未传代；对30只G_1雄鼠的隐性遗传试验获得2只稀毛突变小鼠，均表现为被毛稀疏、幼鼠生长缓慢；命名为snthr~(-1Bao)及snthr~(-2Bao)。 2．两例新的稀毛小鼠组织学结构的初步研究 分别取稀毛小鼠和正常DBA／2小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、淋巴结、胸腺和皮肤等脏器，用10％甲醛固定，行石蜡切片，HE染色，观察稀毛小鼠的组织学结构有无异常。结果发现稀毛小鼠除了皮肤比正常小鼠的薄，毛囊数量少，毛囊有角化现象外，其它各脏器均无异常。3.两例新的稀毛小鼠突变基因的染色体定位 用连锁分析法对ENU诱变获得的两例稀毛小鼠(s nthLr-’“aO及:nihr-z‘)的突变基因进行定位。选择平均分布于小鼠常染色体且在C57BL/6J和DB刀2间有差异的39个微卫星对B6DZFI互交得到的稀毛F:进行基因组扫描。当扫描了9个微卫星后发现sn廿『l“aO突变基因与DgMit243的LoD值为7.73。突变基因被定位于9号染色体。在此基础上又选择了DgMit355和DgMitls两个微卫星进行检测，并扩大F2的数量至145只。结果，sn廿甘~l“aO与DgMitls间无1例重组，稀毛突变基因与该微卫星紧密连锁，距着丝点71。M。同理，将sn止Lr-ZBaO突变基因也定位于9号染色体，与snuir.l腼相近的区域。检索发现sn廿ir，，“aO是一尚未克隆的新基因。 综上，本研究的结果为开发我国被毛突变小鼠品系打下了基础，提供了依据，为克隆该突变的稀毛提供了必要的研究基础.
邓巧凤[4]2012年在《采用基因导入法培育3种被毛稀疏小鼠》文中提出基因导入法是培育小鼠动物模型的有效手段,本文分别以微卫星标记及斑秃表型为选择标准,通过反复交配的策略,将目标基因组片段导入新的遗传背景中,获得了新的被毛稀疏小鼠。1以微卫星为标记培育2种Plcd1修饰基因导入系小鼠前期工作发现在C57BL/6J(简称B6)小鼠基因组上有4个位点对DBA/2J背景的snthr-1Bao小鼠被毛疏密程度有显着的调节作用。本实验首先在4个具有调节效应的基因组区域内选择微卫星为标记,在第2号染色体上32-68cM范围内选择D2Mit156, D2Mit249, D2Mit62;第5号染色体上24-84cM范围内选择D5Mit356, D5it314, D5Mit409;第742.7-52.7cM范围内选择D15Mit71,D15Mit29,D15Mit171。随后将C57BL/6J小鼠与snthr-1Bao小鼠配种,并通过微卫星标记在后代小鼠中选择带有C57BL/6J相应基因组片段的后代,互交其后代,并将互交后得到的后代继续与snthr-1Bao小鼠回交配种,经过连续6次回交,最后互交及选择,获得了2种分别携带C57BL/6J小鼠第2号、第15号染色体具有调节效应基因组片段的snthr-1Bao稀毛小鼠,并证实来自C57BL/6J小鼠第2号染色体上的修饰位点可加重斑秃症状、导致被毛减少,第15号染色体上的修饰位点可减轻斑秃症状、导致被毛增多。而第5号、第7号染色体上的修饰基因在导入过程中小鼠未能成功繁殖后代。本实验为相关基因的相互作用机制研究及化妆品评价提供新的模型。2一种C57BL/6J背景斑秃基因导入系小鼠的培育斑秃样小鼠AAtj是在昆明种小鼠生产繁殖过程中被发现培育而成的一个突变品系,突变基因呈单基因隐性遗传。该小鼠幼年时被毛正常,随着年龄增长,背部毛发局灶性稀疏,并缓慢进展,最后几乎全身无毛,这与人类疾病斑秃的临床症状较为相似。由于该斑秃样小鼠遗传背景复杂,为了定位、鉴定斑秃突变基因及研究资料的对比,需要“纯化”其遗传背景。本实验将AAtj斑秃样小鼠与C57BL/6J、鼠交配繁殖得到F1代小鼠。F1代含有突变基因但无斑秃表型,F1进行互交得到F2,F2中纯合子即表现为斑秃,再将F2代的斑秃样小鼠与C57BL/6J小鼠交配,得到F3代,F3代互交得到F4代小鼠,如此反复,一直进行到第8代,取F8代中的斑秃样小鼠互交,保种。建立了同源导入近交系斑秃样小鼠。在此基础上对F6代2月龄斑秃基因导入系小鼠的主要脏器、免疫器官及不同发育阶段的皮肤组织(从初生至8周,每周一次)行组织病理学检查,发现斑秃突变小鼠4周龄以后毛囊数量逐渐减少,皮肤厚度较野生型显着增加,免疫组化显示皮肤毛囊周围CD8阳性细胞浸润。本实验纯化了斑秃模型小鼠的遗传背景,为模型价值评估及对突变基因的定位鉴定奠定了基础。
李彦红[5]2012年在《昆明（KM）突变小鼠慢性炎症性皮肤病模型的研究》文中认为背景KM突变小鼠是我所KM封闭群小鼠繁殖过程中出现的一例自发突变小鼠,表型异常,全身被毛稀少,表皮增厚有皱褶。为进一步育种研究,于SPF级动物房内进行近交化培育保种,其突变表型可稳定遗传。该KM突变小鼠初生时与野生型KM小鼠间表型无差异,至一周左右被毛生长后即可与野生型相区分,其被毛稀疏,至离乳仍可见粉红色皮肤,成年后皮肤明显松弛褶皱,表面干燥,部分动物有皮屑脱落,部分动物出现皮肤溃破,类似于人类的慢性炎症性皮肤病病变表现。因此我们对KM突变小鼠进行近交系培育,以期发现其突变的遗传规律并对突变基因进行定位；同时,研究中主要对该突变小鼠的生物学特性进行观察分析,检测其在生物学特性方面与野生小鼠间的差异；根据突变小鼠的表型,观察其皮肤的病理改变及免疫细胞和分子改变,检测免疫器官脾脏和淋巴结淋巴细胞的改变等,目的在于了解KM突变小鼠的系统表型特点、遗传规律等,为其后的基因定位和机制研究奠定基础,以期开发新的疾病动物模型。方法选用同胞杂交、测交等方法近交培育的KM突变小鼠和对照野生小鼠作为研究对象,观察其遗传规律；电子摄像动态观察表型；对不同月龄,不同性别小鼠进行体重、脏器系数、代谢率、体温、及血液学常规、生化检测；通过常规HE病理组织学、免疫组织化学及特殊染色对3月龄、6月龄KM突变小鼠和野生KM小鼠皮肤炎症细胞及细胞因子进行检测比较及脂肪组织脂肪因子瘦素检测比较；对不同年龄段的小鼠皮肤组织、脾脏及淋巴结细胞的凋亡与增殖以及脾脏、淋巴结组织T、B细胞数量进行检测比较。结果KM突变小鼠近交培育至第10代,突变表型稳定遗传,通过观察突变表型外显率,基本符合孟德尔基因分离规律,且与性别无关,推测为单基因控制的常染色体隐性遗传突变；突变表型为皮肤稀毛、皮屑、皮皱等；KM突变小鼠的体重与同龄野生小鼠比较明显降低,且生长缓慢,但除胸腺及腹腔脂肪脏器系数比KM野生小鼠低之外,其它主要脏器重量系数均高于野生KM小鼠；体温高,平均日饮水量大；外周血白细胞、淋巴细胞百分比比同龄野生小鼠多,粒细胞百分比随年龄增长下降；单核细胞百分比呈明显增高的趋势；血糖、总胆固醇、甘油叁酯及高密度脂蛋白低、低密度脂蛋白高；皮肤组织病理表现为表皮细胞坏死,上皮角化过度或不全,颗粒层增厚,基底细胞层水肿,真皮浅层血管扩张,结缔组织炎细胞浸润等；皮肤真皮层T细胞、巨噬细胞、肥大细胞浸润,炎症因子IL-6、IL-22、TNF-α、IFN-γ表达增多；脂肪组织瘦素表达增多；表皮细胞凋亡增多,毛囊及皮脂腺细胞增殖减少；脾脏及淋巴结细胞凋亡相对增多,3月龄、6月龄KM突变小鼠增殖增加,9月龄突变小鼠脾脏增殖下降；3月龄、6月龄KM突变小鼠脾脏及淋巴结内T、B淋巴细胞均相对增多,9月龄时脾脏及淋巴结B细胞下降,T细胞增多。结论此次发现的KM自发突变小鼠突变表型主要为皮肤组织自发慢性炎症病变,全身系统性炎症改变,与人类慢性炎症性皮肤病变有相类似的病理改变和细胞分子改变,且表型能稳定遗传。继续深入研究并定位突变基因有望培育成为一种新的慢性炎症性皮肤病的动物模型。
参考文献：
[1]. 昆明稀毛小鼠突变基因的染色体定位及病理研究[D]. 陆云. 沈阳药科大学. 2001
[2]. snthr～（-1Bao）稀毛小鼠生物学特性的研究、突变基因精确定位和毛发调节基因的QTL定位[D]. 茅慧华. 扬州大学. 2007
[3]. ENU诱变获得两例新的稀毛小鼠及其突变基因的染色体定位[D]. 茅慧华. 扬州大学. 2004
[4]. 采用基因导入法培育3种被毛稀疏小鼠[D]. 邓巧凤. 扬州大学. 2012
[5]. 昆明（KM）突变小鼠慢性炎症性皮肤病模型的研究[D]. 李彦红. 北京协和医学院. 2012
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