（新疆和硕县气象局，新疆 巴音郭楞蒙古自治州 841200）
摘要：本研究在构建（陆地棉×黄褐棉）BC1种间群体基础上，利用第11、21染色体的1012对SSR引物，对陆地棉品种中棉所35与黄褐棉进行多态性筛选，共获得212对多态性引物，多态性引物比例为20.7%。以多态引物检测群体92个单株基因型，共获得53个SSR标记位点。利用这些新获得的标记位点与实验室前期定位到第11和21染色体的标记进行遗传连锁分析，构建（陆地棉×黄褐棉）BC1种间群体第11、21染色体新的遗传图谱。新的加密后的第11染色体共有111个标记位点，新增位点36个，覆盖长度为190.4 cM，标记间的平均距离为1.7cM；第21染色体共有141个标记位点，新增位点81个，覆盖长度为194.2cM，标记间的平均距离为1.4cM。遗传图谱上的141个标记位点中有3个标记位点偏离孟德尔1:1分离比例(P<0.05)，偏分离标记占标记位点总数的2.1%。本研究结果为构建（中棉所35×黄褐棉）BC1群体高密度遗传图谱奠定了基础。
关键词：陆地棉；黄褐棉；SSR标记；遗传连锁图谱
1 材料与方法
1.1实验材料
中棉所35号是中国农业科学院棉花研究所育成的陆地棉栽培品种，具有高抗、高产、早熟等特性。黄褐棉是野生棉，具有抗黄萎病、抗虫和纤维品质变异丰富等特性。2017年夏天，在重庆，以棉所35号为母本，黄褐棉为父本进行杂交，在海南种植F1代，并与棉所35号进行回交，得到BC1代种子。2017年夏天，在重庆西南大学棉花育种基地种植两个亲本及BC1代群体，随机选择92个单株作为构图群体。
1.2群体及亲本的DNA提取
2017年6月，在棉花生长的旺盛时期，清晨采取亲本及BC1群体单株5g左右的幼嫩叶片，放入事先编号的信封中，随后带回实验室放于4℃冰箱待用。采用Zhang等改良的CTAB法提取基因组DNA。
1.3 SSR标记检测
1.3.1 SSR引物来源
本研究遗传连锁图谱构建所采用的CCRI引物和NAU引物是由上海英骏生物公司合成的。其序列来源于棉花标记公共数据库。引物的选取是根据实验室前期构建的海陆种间遗传图谱上的标记以及已发表陆地棉种间遗传图谱上的标记。
1.3.2 SSR标记PCR扩增
PCR扩增的具体操作步骤参照Zhang等方法，PCR反应结束后，在PCR板中每DNA样孔中加入2μL缓冲液（0.25%溴酚蓝＋40%蔗糖水溶液＋0.25%二甲苯青），4℃冷藏保存，待电泳检测使用。
1.3.3PCR产物电泳
电泳采用的方法是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，所需要的主要试剂及配制方法如下：(1)上样缓冲液：二甲苯青2.5 g、溴酚蓝25 g、蔗糖400 g，一定的去离子水溶解，再定容到1000 ml，放于4 ℃冷藏待用。(2)30%丙烯酰胺凝胶电泳：N，N’-亚甲基双丙烯酰胺10 g、丙烯酰胺290 g以及一定量去离子水溶解，再定容至1000 ml，放于4 ℃冷藏待用。(3)10%丙烯酰胺凝胶溶液：N，N’-亚甲基双丙烯酰胺15 g、丙烯酰胺285 g 以及一定量去离子水溶解，再定容至1000 ml，放于4 ℃冷藏待用。(4)TBE缓冲液：0.5 mol/L EDTA (pH=8.0) 20 mL、硼酸27.5 g、Tris54 g以及一定量去离子水溶解，再定容至1 L。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆(5)固定液； (6)银染液； (7)显色液。
电泳的具体操作步骤如下：安装电泳槽—灌胶—点样—电泳—固定—银染—漂洗—显色—洗胶—拍照：将清洗干净的凝胶整齐有序地平铺于灯箱，拍照保存。
1.4遗传连锁图谱构建
1.4.1亲本间多态性引物筛选与BC1群体标记基因型检测
利用棉花SSR引物对中棉所35、达尔文氏棉、黄褐棉、毛棉四个亲本进行引物的多态性筛选。筛选出的多态性引物用于BC1群体92个单株的标记基因型检测，并将结果记录下来。群体中带型与轮回亲本中棉所35一致的单株用b表示，与F1代带型一致的单株用h表示。在回交群体中，SSR引物表现出的差异相同，则只记为一个位点；若表现出的差异不相同，则多个位点均需记录，位点的命名方法一般是引物的名称加小写的字母a、b、c等，多态性片段分子量从小到大，字母命名排序也从a到后面的字母，无法辨别或缺失的读u。
1.4.2标记位点的偏分离检测
使用JoinMap4.0对标记基因型进行卡方检验，判断标记的基因型分离比有无显著偏分离于孟德尔分离比(P=0.05)，即本实验中b:h是否等于1:1。在遗传连锁图谱上若出现3个以上（包括3个）相邻的显著偏分离区域，该区域称为偏分离区域(segregation distortion region，SDR)。
1.4.3黄褐棉与陆地棉种间BC1群体遗传连锁图谱构建
利用Joinmap4.0作图软件，以LOD =5.0，Kosambi作图函数(Kosambi，1944)对读取的标记进行连锁分析，以已构建的海陆棉花的遗传连锁图谱上的标记位置为标准确定各个连锁群所在的染色体以及各标记的染色体位置，最后操作绘图软件MapChart 2.2绘制异源四倍体黄褐棉与陆地棉的种间遗传连锁图谱。
2结果分析
2.1 SSR引物的开发及其多态性
利用1012对CCRI引物和NAU引物，对亲本黄褐棉和中棉所35进行引物多态性筛选，共获得212 对多态性引物，多态性引物占筛选引物总数的比例为20.7%。
2.2标记基因型检测
利用筛选出的212对多态性引物对群体的92个单株进行标记基因型检测，共获得53个标记位点，有6个多态性引物有2个多态
2.3遗传连锁图谱加密
利用本研究获得的53个标记位点与实验室前期定位到第11和21染色体的标记进行遗传连锁分析，构建新的第11和21染色体遗传图谱。加密后的第11染色体共有111个标记位点，新增位点36个，覆盖长度为190.4 cM，标记间的平均距离为1.7cM；第21染色体共有141个标记位点，新增位点81个，覆盖长度为194.2 cM，标记间的平均距离为1.4cM。该对同源染色体之间共有10个SSR重复标记位点。
2.4标记位点的偏分离检测
卡方检测结果表明，第11染色体的111个SSR标记位点中，有0个标记偏离，；第21染色体的141个SSR标记位点中，有3个标记偏离孟德尔1:1分离比例(P<0.05)，偏分离标记占标记位点总数的2.1％。
3结论
3.1亲本间引物多态性筛选
利用212对SSR引物，对亲本中棉所35和黄褐棉进行多态性筛选，共获得47对多态性引物，多态性引物比例为20.7%。
3.2 陆地棉与黄褐棉回交群体遗传图谱的加密
加密后的异源四倍体黄褐棉与陆地棉种间第11和21染色体的遗传连锁图谱中，第11染色体共有111个标记位点，新增位点36个，覆盖长度为190.4cM，标记间的平均距离为1.7 cM；第21染色体共有141个标记位点，新增位点81个，覆盖长度为194.2cM，标记间的平均距离为1.4 cM。
3.3偏分离标记
本研究加密后的图谱上的141个标记位点中有3个标记偏离孟德尔1:1分离比例(P<0．05)，偏分离标记占标记位点总数的2.1％。
参考文献
[1] 蔡彩平. 四倍体栽培棉种高密度遗传图谱的构建及应用[D].南京农业大学,2009.
[2] 王文文.陆海种间图谱揭示的棉花染色体结构变.西南大学，2017.
作者简介:艾米热古丽·阿克木（1993-）女，维吾尔族，新疆吐鲁番人，本科学历，助理工程师，从事气象预报工作。
论文作者:艾米热古丽·阿克木
论文发表刊物:《科技新时代》2018年9期
论文发表时间:2018/11/15
标签：引物论文; 标记论文; 黄褐论文; 多态性论文; 染色体论文; 图谱论文; 位点论文; 《科技新时代》2018年9期论文;