山东省济南市中医医院 250000
摘要：目的 研究双氢青蒿素（dihydroartemisinin， DHA）对人胶质瘤细胞增殖和侵袭的作用及对 Notch信号通路关键基因和蛋白表达的影响。方法 体外培养人胶质瘤U87细胞，加入不同浓度的DHA，采用MTT比色法检测不同浓度DHA对人胶质瘤U87细胞增殖的影响；采用Transwell小室和基质渗透率测定试验检测DHA对人胶质瘤U87细胞迁移和侵袭的影响；采用Real-time PCR和 Western blot检测不同浓度DHA后人胶质瘤U87细胞Notch信号通路关键基因和蛋白表达的变化。结果 不同浓度的DHA处理后， 人胶质瘤U87细胞的增殖、迁移和侵袭均明显受到抑制（P＜0.01或P＜0.05）；随着DHA浓度的增加，人胶质瘤U87细胞内Notch信号通路关键基因和蛋白的表达逐渐下降（均P＜0.01或P＜0.05）。结论 DHA可能通过下调Notch信号通路的表达抑制人胶质瘤U87细胞的增殖、迁移和侵袭。
关键词：双氢青蒿素；神经胶质瘤细胞；Notch通路
Abstract：Objective To investigate the effects of DHA on the proliferation and invasion properties of glioma cells and on the expression of mRNA and protein with Notch signal pathway. Methods Human U87cells were cultured and treated with different concentration of DHA. MTT assay was used to evaluate the effects of different concentration of DHA on the proliferation of U87cells. Transwell shuttle and Matrix penetration assays were used to measure the effects of DHA on migration and invasion of U87cells. Real-time PCR and Western blot analysis were used to detect the expression of mRNA and protein related to Notch signal pathway. Results The proliferation， migration and invasion of U87cells was significantly inhibited by different concentration of DHA（P＜0.01或P＜0.05）. The expression levels of mRNA and protein with Notch signaling in U87cells were down-regulated with the increased DHA concentration（P＜0.01或P＜0.05）. Conclusion DHA can suppress the proliferation， migration and invasion of human U87cells by down-regulating the expression of Notch signal pathway.
Key words dihydroartemisinin；glioma cells；Notch signal pathway
神经胶质瘤是成人最常见的原发性恶性脑肿瘤。尽管其发病率相对较低，但病程进展迅速，预后较差，平均生存期少于1年。最近有报道证明， Notch 信号通路在中枢系统发育过程中起着关键作用，抑制Notch信号通路可抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭［1，2］。双氢青蒿素（dihydroartemisinin， DHA）是抗疟药物青蒿素的重要衍生物，近年来的研究表明其对神经胶质瘤具有抑制作用。本研究主要探讨DHA对神经胶质瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用及其对Notch信号通路的调控作用。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和抗体
DMEM购于Invitrogen公司，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶－EDTA购于Gibco公司，DHA、MTT购于Sigma公司，DMSO购于Amresco公司，兔抗人多克隆Notch1、Notch2、Jagged1、Hes1、DLL1等抗体购于Abcam公司，β-actin和HRP标记的二抗购自Santa Cruz公司，Trizol总RNA提取试剂、cDNA逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司，Notch1、Notch2、Jagged1、Hes1、Delta-like1、GAPDH等PCR引物由Invitrogen公司设计并合成。
1.2 方法
1.2.1 药物配制 称取适量的DHA，以DMSO充分溶解，超声波助溶配制成100 mmol/L的储存液，4℃避光保存。使用前，用DMEM培养液稀释至所需浓度（DMSO 终体积分数＜0.1%）。
1.2.2 细胞培养 U87人神经胶质细胞瘤细胞株购于ATCC，以含10%FBS和100 U/mL青、链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2、湿度95%的恒温培养箱孵育培养，0.25%胰蛋白酶－EDTA消化传代，隔天换液，至细胞融合度达到80%左右时按1：3传代培养。
1.2.3 细胞增殖检测 取对数生长期的单层贴壁U87细胞，以10%FBS的DMEM培养液，调整细胞浓度为每毫升l×105个接种于96孔板中，每孔加入100 μl细胞悬液。将细胞孵育过夜，PBS冲洗后，加入含不同浓度DHA（0、5、10、20、40、80和160μmol/L）的完全培养基共同孵育。之后分别在加药后的24、48和72小时进行MTT检测， 每孔加入5 g/L MTT 20μl， 放入CO2培养箱中孵育4小时后，在酶联免疫检测仪上于490 nm处测定各孔的吸光度（OD值），并绘制细胞生长曲线及生长抑制曲线。此实验重复3次。
1.2.4 细胞迁移和侵袭实验 将Matrigel 基质胶放入BIOCOAT小室的上室模拟基质层后，取对数生长期的U87细胞，调整细胞密度为1× 105 /ml，取细胞200μl接种于含聚碳酸酯过滤膜的Transwell系统的上室内；其中不含Matrigel基质胶的部分用于Transwell迁移测定，而涂有Matrigel基质胶的部分用于Transwell基质穿透测定，37℃孵育24小时。迁移和侵袭的细胞用含4%多聚甲醛的PBS固定，PBS漂洗三次，然后用0.1%结晶紫染色5分钟。200倍光学显微镜下随机选择膜上下左右4个不同视野的穿过膜细胞数，求平均值。
1.2.5 Real-time PCR检测 取对数生长期的细胞，按照操作说明采用Trizol试剂盒提取各组细胞总RNA，并用核酸蛋白测定仪测定其浓度，然后用逆转录试剂盒合成cDNA，逆转录条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s；再以cDNA为模板，采用ABI 7500HT fast real time PCR system进行PCR扩增。所检测的各基因引物序列如下：
Notch1：forward，5′-TCTGTGTGGATGAGGGAGATAA-3′
Reverse，5′-AGCCGCCGAGATAGTCAGT-3′
Notch2：forward，5′-GTGGATGGGGTCAACACTTACA-3′
Reverse， 5′-CACTCCAGCCGTTGACACATAC-3′
Jagged1：forward，5′-CTGTCAGGTTGAACGGTGTC-3′
Reverse，5′-CTTCAACCTCAAGGCCAGC--3′
Hes1：forward，5′-TCAACACGACACCGGACAAAC-3′
Reverse，5′-ATGCCGGGAGCTATCTTTCTT-3′
DLL1：forward，5′-GGGAGCGTGGGGAGAAAGT-3′
Reverse，5′-CAGCCTGGATAGCGGATACACT-3′
GAPDH：forward，5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′
Reverse，5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′
PCR扩增条件为：95℃10min，95℃ 20s、 60℃ 30s、 72℃ 30s共40个循环，72℃时采集荧光。根据仪器读取的CT值，采用2-ΔΔCT法进行分析。每组实验重复 3 次，结果取平均值。
1.2.6 Western blot实验 将U87细胞接种于六孔板，加入DHA处理24小时后，收集细胞，PBS漂洗后，每孔加入200μl RIPA裂解液以提取蛋白。在收集的蛋白样品中加入适量的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，置于沸水浴中10 min，使蛋白充分变性，然后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将蛋白转移到PVDF膜上，然后加入含0.1%牛奶的PBST室温封闭1h，再加入一抗4℃孵育过夜，PBST漂洗后，加入HRP标记的二抗室温孵育1h，以β-actin为内参，实验重复3次，拍照并记录。
1.3 统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行统计分析，数据以均数±标准差表示，不同组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DHA抑制胶质瘤细胞的增殖
不同浓度的DHA作用于人胶质瘤U87细胞24 h后，MTT比色法结果如图1所示，与对照组相比，随着药物浓度的增加，DHA处理组的细胞增殖活性明显降低；结晶紫染色结果显示，DHA处理组较对照组的细胞数量明显减少，DHA的浓度达到40μmol/L时，效果最为明显。同时，相差显微镜下可见到DHA处理组的神经胶质瘤细胞，细胞皱缩，边缘形成褶皱，并且起泡。由于不同浓度的DHA对增殖有轻微或显著的影响，因此选取20和40μmol/L的DHA用于随后的实验。
2.2 DHA抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭
采用Transwell小室和基质渗透率测定试验来研究DHA处理的细胞的迁移和侵袭能力。与DMSO处理的对照组细胞相比，20和40μmol/L的DHA处理组的细胞的迁移速度显著降低；此外，两组DHA 均能显着抑制细胞的侵袭（P＜0.01或P＜0.05，见图2）。
2.3 DHA对胶质瘤细胞Notch信号通路表达的影响
采用Real-time PCR和Western blot检测DHA处理后的各组U87细胞中Notch1、Notch2、Jagged1、Hes1、DLL1 mRNA和蛋白的表达。结果表明，Notch1、Notch2、Jagged1、Hes1、DLL1 mRNA和蛋白在人胶质瘤U87细胞中存在着高表达；20和40μmol/L的DHA处理组的U87细胞中Notch1、Notch2、Jagged1、Hes1、DLL1 mRNA和蛋白的表达均显著降低，与对照组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05，见图3和图4），表明DHA对Notch信号通路具有抑制作用。
3 讨论
目前，神经胶质瘤的推荐疗法是以“手术+化疗”为主的联合治疗，由于胶质瘤具有侵袭生长的特性，即便患者按照标准流程进行治疗其预后仍较差［3，4］。因此，寻找新的药物和治疗靶点是目前该领域研究的热点。DHA是青蒿素在人体内的重要活性代谢产物，研究表明，DHA可显著抑制神经胶质瘤细胞的生长，但其作用机制尚未完全阐明［5］。
Notch信号通路是生物进化过程中高度保守的信号通路，对控制细胞分化、增殖、上皮-间质转化和迁移等起着重要作用［6，7］。Notch信号通路在肿瘤中的作 用也越来越被重视。许多研究发现，Notch信号通路在脑胶质瘤中的异常表达， 与人脑胶质瘤的发生、发展、侵袭性以及血管形成等都有密切关系［8］。因此，深入研究脑胶质瘤中Notch通路的调控作用及其机制对开发以该信号通路为靶向的治疗药物将具有重大意义。
本研究发现，用DHA处理人脑胶质瘤U87细胞24 h后，U87细胞的活性显著降低，表明DHA对人脑胶质瘤U87细胞的增殖具有明显的抑制作用；且随着DHA药物浓度的增大，细胞增值率也逐渐降低，表明DHA对U87细胞的增殖具有明显的药物-浓度依赖性。Transwell穿梭实验和人工基质胶侵袭实验结果显示，DHA处理组的细胞的迁移和侵袭速度均显著降低，表明DHA能抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。Real-time PCR和 Western blot结果显示，不同浓度DHA处理后的处理后的U87细胞Notch信号通路关键基因和蛋白的表达均下调，表明DHA可能通过调控Notch信号通路从而抑制胶质细胞瘤的增殖、迁移和侵袭。
参考文献：
[1]Stockhausen MT， Kristoffersen K， Poulsen HS. The functional role of Notch signaling in human gliomas. Neuro Oncol.，2010，12（2）：199-211.
[2]Hovinga KE1， Shimizu F， Wang R， et al.Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells，2010，28（6）：1019-1029.
[3]王晖，冯华，陈图南，等．细胞外ATP对U87胶质瘤细胞生长和侵袭的作用．第三军医大学学报，2012，34（7）：589－592．
[4]Wen P Y， Kesari S．Malignant gliomas in adults．N Engl J Med，2008， 359（ 5）：492－507．
[5]Chen XR， Lin H， Wen J， et al. Dihydroartemisinin suppresses cell proliferation， invasion， and angiogenesis in human glioma U87 cells. Afr J Pharm Pharmcol. 2012，6（32）：2433-2440.
[6]Kopan R， Ilagan MX.The canonical Notch signaling pathway：unfolding the activation mechanism. Cell， 2009，137（2）：216-233.
[7]Leong KG， Karsan. A Recent insights into the role of Notch signaling in tumorigenesis. Blood，2006，107（6）：2223-2233.
[8]钱春发，尤永平．Notch信号通路在脑胶质瘤中的研究进展．国际神经病学神经外科学杂志，2008，35（6）：564－567．
论文作者:高睿
论文发表刊物:《健康世界》2016年第16期
论文发表时间:2016/9/23
标签：细胞论文; 胶质瘤论文; 浓度论文; 信号论文; 蛋白论文; 抑制论文; 基质论文; 《健康世界》2016年第16期论文;