前言：由于原质量标准中VD3含量测定方法，含量检测受辅料干扰比较大，而且结果平行性不好，通过新的检测方法检测，发现对含量检测干扰比较小，且平行性较好，回收率高，故建立VD3含量新方法，并对该方法进行方法学验证。
1.验证内容
本次方法学验证包括以下几个方面：方法系统适用性，准确度，精密度，检测限，定量限，线性试验，专属性等。
2.仪器及试药
2.1仪器：Agilent1100
2.2试药：样品：空白辅料（碳酸钙：大豆油=6：4），钙加维生素D软胶囊
对照品：维生素D3（批号10061-0206，中检所）
含量100.0%
试剂：没食子酸（化学试剂）、氢氧化钾（分析纯），无水硫酸钠
石油醚（色谱纯，沸程30℃～60℃），甲醇（色谱级），纯化水
3.方法概述
3.1 色谱条件：
流动相：甲醇：水=92：8
进样量：20μl
检测波长：265nm
柱温：30℃
色谱柱：C18 4.6×250mm 5μm
3.2测定法：
焦性没食子酸的乙醇溶液：15g/L
氢氧化钾溶液：质量比为50：50
3.2.1样品处理
准确称取10g样品内容物，置于250ml平底烧瓶中，加30ml蒸馏水。
3.2.2测定液的准备
3.3.2.1于上述处理的样品溶液中加入100ml的没食子酸溶液，充分混匀后加50ml氢氧化钾溶液，在蒸汽浴上连续回流30min后，立即冷却到室温。
3.2.2.2将皂化液转入一500ml分液漏斗中，用100ml水分几次冲洗平底烧瓶，洗涤液并入分液漏斗中。
3.2.2.3于上述分液漏斗中，加入100ml石油醚，盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1min。在振摇过程中，注意释放瓶内压力。静置分层，将水相放入另一500ml分液漏斗中。重复上述萃取过程二次，合并石油醚到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近干（绝不允许蒸干）后，加石油醚适量，用氮气将瓶中石油醚吹干，精密加入甲醇10ml，超声助溶，0.45μm偏氟膜滤过，即得样品溶液。
3.2.3对照品溶液制备：
精密称取维生素D3对照品25mg于100ml量瓶中，用甲醇溶解至刻度，摇匀；精密移取1ml该溶液于100ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀；作为对照品溶液。
4.系统适应性
4.1标准：连续进样的相对标准偏差应不大于2.0%。
4.2操作步骤：取对照品溶液连续进样5次，记录色谱图，计算相对标准偏差。
结果见下表：
结论：系统适应性试验结果符合规定。
5.方法专属性
5.1 对照品溶液：精密称取VD3对照品约25mg于100ml量瓶中，加甲醇适量使之溶解，定容至刻度，精密移取1ml于100ml量瓶中，甲醇定容至刻度。取20μl进样。
5.2 空白：取20μl甲醇进样。
5.3 空白辅料：同样品同步处理，取20μl进样。
5.4 光破坏：取该溶液适量，于日光下照射破坏，取20μl进样。
5.5 热破坏：取该溶液适量，于100℃水浴中破坏，取20μl进样。
5.6 VD2溶液：精密称取VD2对照品约25mg于100ml量瓶中，加甲醇适量使之溶解，定容至刻度，精密移取1ml于100ml量瓶中，甲醇定容至刻度。摇匀，取20μl进样。
5.7 结论：专属性试验图谱见附图2。
6.方法精密度
6.1精密度试验
取供试品溶液连续进样6针，以峰面积计算，RSD%≤2.0%。
结论：供试品溶液精密度试验结果符合规定。样品重现性良好。
7.方法准确度
7.1回收率试验
精密称取维生素D3对照品20mg，25mg，30mg各3份于100ml容量瓶中，加甲醇适量使之溶解，定容至刻度，得对照液（1）；精密移取1ml于100ml量瓶中，甲醇定容至刻度，得对照液（2）。
测试液制备：精密称取空白辅料约10g，置250ml平底烧瓶中，精密加入10ml对照液（2），加30ml蒸馏水。再加入100ml的没食子酸溶液，充分混匀后加50ml氢氧化钾溶液，在蒸汽浴上连续回流30min后，立即冷却到室温。将皂化液转入一500ml分液漏斗中，用100ml水分几次冲洗平底烧瓶，洗涤液并入分液漏斗中。于上述分液漏斗中，加入100ml石油醚，盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1min。在振摇过程中，注意释放瓶内压力。静置分层，将水相放入另一500ml分液漏斗中。重复上述萃取过程二次，合并石油醚到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近干（绝不允许蒸干）后，加石油醚适量，用氮气将瓶中石油醚吹干，精密加入甲醇10ml，超声助溶，0.45μm偏氟膜滤过，即得样品溶液。
结果下表：
结论：含量结果符合规定。
8.线性及范围
溶液配制：精密称取维生素D3对照品约25mg于200ml量瓶中，加甲醇适量使之溶解，定容至刻度。分别移取该溶液1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.0ml，，于100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；分别精密量取上述溶液各20μl注入色谱仪，记录色谱图。结果以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）作回归方程如下：
结果：维生素D3在1.25～3.75μg/ml范围内峰面积（mAU）与浓度（μg/ml）线性关系良好，回归方程为Y=57.082X+0.516，相关系数r=0.9992。
9.检测限和定量限
9.1检测限
9.1.1标准：信噪比>3
9.1.2操作步骤：取标准溶液逐步稀释至一定体积，测定每种溶剂的最小检测限。当峰高为基线噪音的3倍时的浓度，即为检测限。
9.2定量限
9.2.1标准：信噪比>10
9.2.2操作步骤：取标准溶液逐步稀释至一定体积，测定每种溶剂的最小定量限。当峰高为基线噪音的10倍时的浓度，即为定量限。
9.3结果：测得维生素D3检测限浓度为0.0375μg/ml，定量限浓度为0.15μg/ml。（图谱见附图7）
10.讨论
验证方案中建立的钙加维生素D3中维生素D3含量的测定方法，辅料干扰小，方法重现性好，回收率符合规定，专属性强，可作为该制剂质量控制方法。
作者简介：乐嘉平 男 1981年7月12日 杭州民生药业有限公司 工程师 药物制剂方向
论文作者:乐嘉平
论文发表刊物:《健康世界》2016年第18期
论文发表时间:2016/10/24
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