1南华大学附属第一医院妇产科；2南华大学医学院病原生物学研究所 特殊病原体防控湖南省重点实验室 湖南衡阳 421001
【摘 要】目的 构建小鼠肺炎型沙眼衣原体生殖道感染模型，观察炎性细胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表达。方法 用1×104 IFUs MoPn 经阴道感染雌性C57BL/6J 野生型小鼠，每组一半小鼠于原发感染后，生殖道拭子MoPn检测为阴性后2周，再次感染相同剂量的MoPn。每隔3~4d取小鼠生殖道分泌物及子宫颈、子宫角及输卵管组织于500μl SPG中，冰浴超声，系列稀释后，感染HeLa细胞，测定其中衣原体包涵体，并对小鼠生殖道分泌物中细胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α进行ELISA 检测与分析。结果 生殖道、子宫颈、子宫角及输卵管组织中均检测到沙眼衣原体MoPn感染；且 ELISA 测定小鼠外周血中的 TNF-α、IL-1β、IL-8 水平结果显示：与正常组和对照组比，感染组的小鼠阴道分泌物 TNF-α、IL-1β、IL-8 水平显著高于正常组（P﹤0.05）和对照组（P﹤0.05）差异有统计学意义。结论 成功构建小鼠MoPn生殖道感染模型，且MoPn在体内对炎症因子IL-1β、IL-8和TNF-α有诱生作用。
【关键词】沙眼衣原体；生殖道；感染模型
沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是性病病原体之一，主要引起女性宫颈炎、子宫内膜炎、输卵管炎及盆腔炎，并可导致异位妊娠、不孕、不育等严重并发症，还可促进宫颈癌、卵巢癌的发生和HIV的感染[1-2]。但迄今为止，Ct确切的致病机制及机体的抗感染免疫机制仍不十分清楚，尚无有效的疫苗来预防。因此，阐明Ct的致病及免疫机制，对预防、控制Ct感染具有十分重要的意义。本研究试图建立小鼠肺炎型沙眼衣原体（Mouse pneumonitis，MoPn）生殖道感染模型，观察炎性细胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表达，为了解Ｃt感染的致病机与疫苗研制提供实验依据。
1.材料与方法
1.1材料 雌性C57BL/6J 野生型小鼠（wild type，WT，stock number 000664），购自The Jackson Laboratory（Bar Harbor，Maine，USA），C. muridarum（MoPn，Nigg株），由加拿大马尼托巴大学Dr. Brunham教授惠赠，南华大学病原生物学研究所实验室传代保存。HeLa细胞，购自美国标准菌株保存中心DMEM培养基、无支原体胎牛血清购自GIBCO公司（Grand Island，NY，USA）。小鼠IL-1α、IL-6、和TNF-α ELISA 试剂盒购于Ｒ＆D公司。
1.2方法
1.2.1 MoPn扩大培养 将1：500稀释后的衣原体MoPn株感染液加入单层细胞中，37℃孵育2h。每间隔20min轻轻晃动细胞培养瓶使衣原体充分接触单层细胞；2h后弃去衣原体感染液，加入适量预温的含2μg/mL放线菌酮的D10培养基（T50 5ml或 6孔板/孔 2ml）继续培养所需要的时间。
1.2.2 小鼠生殖道衣原体感染模型的构建 54只C57BL/6J wt分为三组。感染组、对照组和正常组，感染组18只小鼠经阴道接种含1×104包涵体形成单位（inclusion forming unit，IFU）MoPn的SPG。其中一半小鼠在初次感染后54天，再次感染相同剂量的MoPn，80天后处死小鼠。小鼠初次和再次感染前5天均皮下注射2.5 mg Depo-provera以增加小鼠对衣原体感染的敏感性。而正常组18只小鼠未经任何处理，对照组18只小鼠仅前5天均皮下注射2.5 mg Depo-provera。
1.2.3 小鼠生殖道组织与分泌物中衣原体检测
1）生殖道分泌物中衣原体检测 小鼠经生殖道感染MoPn后，每隔3 ~ 4d取生殖道分泌物于500 μL SPG中，然后超声、稀释，取合适稀释度的稀释液感染HeLa单层细胞，于CO2培养箱中培养24 h后，进行荧光抗体染色。
2）小鼠子宫颈、子宫角、输卵管组织中衣原体检测 处死小鼠后，无菌分离生殖道，将其分为三部分：子宫颈、子宫角、输卵管（包括卵巢）。将每一部分组织匀浆于400 μl SPG中，冰浴超声，使衣原体释放出来。然后将各类标本系列稀释，取合适稀释度接种于HeLa细胞单层，用含2 μg/ml放线菌酮和10%小牛血清的DMEM，37°C培养24 h，按上述方法进行进行荧光抗体染色。
1.2.4 小鼠生殖道分泌物中细胞因子检测 取每只小鼠生殖道拭子于500 μl SPG中，冰上超声，一部分如前述用来测定其中包涵体数量，剩余的保存于-80 °C 冰箱。从冰箱中取出，充分溶解并混匀，进行合适稀释后，取原液或倍比稀释液，ELISA法测定其中IL-1β、IL-8和TNF-α含量。
1.2.5 统计学分析 所有实验数据都以均数±标准差（Mean±SD）表示。统计学方法则采用单因素方差分析和 LSD-t检验，以SPSS18.0统计软件进行结果分析，P<0.05被认为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1 大体变化
MoPn感染后80天，处死小鼠，分离生殖道组织，进行病理检测。MoPn感染后引起小鼠生殖道的病理表现主要为：输卵管壶腹部、峡部肿胀，管壁血管扩张充血，管腔内充满透明液体，输卵管周围结缔组织粘连，炎症细胞浸润，炎症引起的输卵管或子宫角积水以及积水导致的管腔扩张。
2.2 生殖道组织中衣原体计数 取第7d生殖道分泌物于500 μL SPG中，然后超声、系列稀释，取合适稀释度的稀释液感染HeLa单层细胞，于CO2培养箱中培养24 h后，进行荧光抗体染色，在显微镜下观察到细胞呈兰色，包涵体黄绿色（见图 1）。
3.讨论
虽然目前认为衣原体感染后引起的炎症反应是导致衣原体性疾病的主要原因[3]，但确切的致病机制尚不太清楚，也没有有效的疫苗上市。建立Ct人型株的小鼠生殖道感染模型是研究沙眼衣原体致输卵管炎性阻塞的理想模型。
Ct人型株经阴道感染小鼠后，仅引起轻微的下生殖道炎症反应，只有高剂量直接接种至子宫角或卵巢囊时，才能引起明显的小鼠生殖道组织的病理损伤，因此大大降低了其应用价值。由于MoPn基因组的组成及排列顺序与引起人类生殖道感染最常见的Ct D型株呈现高度的相似性，基因组同源性超过90%（只有一个可变区不同），提示这两种Ct在致病因子、病理机制及抗原结构等方面可能类似，甚至相同[4]。而且，实验发现小鼠感染MoPn后出现的泌尿生殖道病理反应与人类Ct性泌尿生殖道感染极其相似，均出现以子宫内膜炎和输卵管水肿为主要特征的病理表现[5]。因此，目前常用MoPn鼠生殖道感染模型来研究Ct的免疫保护和病理损伤机制[6]。本研究经阴道接种含1×104包涵体形成单位IFUMoPn的SPG，在初次感染后54d，再次感染相同剂量的MoPn，80天后处死小鼠。通过小鼠生殖道组织与分泌物中衣原体检测证实成功构建MoPn鼠生殖道感染模型。
炎症反应是 Ct 致病的基础，有探究表明TNF-α、IL-1β具有协同诱导作用，且都能诱导IL-8的产生。TNF-α在炎症早期可以募集更多的免疫细胞到达炎症部位对抗入侵的病原菌，主要参与炎症反应的级联过程，发挥多种生物学活性[6]。为探讨 Ct 在体内对炎症因子有诱生作用，本实验将小鼠感染MoPn后，获其阴道分泌物，测定它们的 TNF-α、IL-1β和IL-6 水平，结果发现：现小鼠感染MoPn后的阴道分泌物细胞培养上清中均存在高水平的TNF-α、IL-1β 和 IL-8等炎症细胞因子，且较对照组和正常组相比差异均有统计学意义。说明 TNF-α、IL-1β 和 IL-8 是重要的促炎介质，介导机体的炎症反应和免疫调节等。
参考文献
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基金项目：国家自然科学基金（81102230）；2014年度湖南省医药卫生科研计划课题项目（湘卫科教发[2014]1号，课题编号：B2014-050）。
作者简介：何璐，女，硕士，主治医师，研究方向为妇产科感染与肿瘤。
通信作者：陈忠东
论文作者:何璐1,刘良专2,游晓星2,李忠玉2,董巍蕾1,周
论文发表刊物:《航空军医》2016年第20期
论文发表时间:2016/11/16
标签：小鼠论文; 衣原体论文; 生殖道论文; 炎症论文; 输卵管论文; 沙眼论文; 分泌物论文; 《航空军医》2016年第20期论文;