胡泽锴 毛腾霄
(成都市食品药品检验研究院 610000)
【摘要】 目的：建立氧化锌洗剂的微生物限度检查方法。方法：采用常规法、薄膜过滤法对氧化锌洗剂的微生物限度检查进行试验。结果：供试品5种试验菌回收率均>70%，控制菌能正常检出。结论：应采用薄膜过滤法对细菌数和金黄色葡萄球菌控制菌进行检查；采用常规法对霉菌和酵母菌数以及铜绿假单胞菌控制菌进行检查。
【关键词】 氧化锌洗剂；微生物限度检查法；薄膜过滤法
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）25-0356-03
Erification of the Microbial Limit Test for the Zinc Oxide Lotion
Hu Zekai， Mao Tengxiao
(Institute for Food and Drug control of Chengdu,Chengdu 610000)
【Abstract】 Objective: To establish a method of microbial limit tests for Acne Zinc Oxide lotion. Methods Routine method and membrane filtration method were used for the test of the Zinc Oxide lotion. Results The recoveries were more than 70 % and the quality of control germ check was credible. Conclusion Bacteria and Clostridium sporogenes and Pseudomonas aeruginosa were tested by membrane filtration method.Molds and yeasts were tested by the routine method.
【Key words】 Zinc Oxide lotion;Microbial limit tests; Membrane filtration
氧化锌洗剂为外用制剂，主要成分为氧化锌、薄荷脑，具有抗菌消炎作用。按《中国药典》2010年版二部附录微生物限度检查法标准规定，细菌数应不得过100cfu/ml，霉菌和酵母菌数应不得过100cfu/ml，金黄色葡萄球菌每1ml不得检出，铜绿假单胞菌每1ml不得检出。本品在进行微生物限度检查时，应建立适合于本品的方法，确保方法的有效性，我们按药典要求进行了方法验证实验。
方法验证
1. 仪器、样品、菌种及培养基
1.1 实验样品
氧化锌洗剂（由空军总医院提供）
规格：100 ml/瓶 批号：140325 131213 140401（以下简称1、2、3批）
1.2 菌种 大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均来源于中国药品生物制品检定所，均为第4代培养物。
1.3 仪器
洁净工作台（苏净集团安泰公司） 编号：02180009
隔水式恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司） 编号：02210051
LRH 250 生化培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司） 编号：02210053
STV3无菌检查薄膜滤器（浙江宁海白石药检仪器厂）编号：02260080
1.4 培养基
营养肉汤培养基 批号：121023 营养琼脂培养基 批号：130522
玫瑰红钠琼脂培养基 批号： 1305292 甘露醇氯化钠琼脂培养基 批号：110713
胆盐乳糖培养基 批号：130410 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 批号：1302052
1.5 稀释液
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：130422），以上均由北京三药科技开发公司生产，按标签说明进行配制。
2.方法
2.1 细菌数、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2.1.1 常规法测定细菌、霉菌及酵母菌数的方法验证
2.1.1.1 菌液制备[1]
按《中国药典》2010年版二部要求，制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌50-100 cfu/ml的菌悬液；制备白色念珠菌50-100 cfu/ml的菌悬液，黑曲霉50-100cfu/ml的孢子悬液作活菌计数用；
2.1.1.2 供试液制备[2]
取本品10ml，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，振摇混匀，500转/分离心3min，取上清液，得1:10 供试液。
2.1.1.3 回收率测定
2.1.1.3.1 供试品组
取1:10供试液1mL，平行制备2个平板，测定供试品本底细菌数；
取1:10供试液1mL，平行制备2个平板，测定供试品本底霉菌和酵母菌数。
2.1.1.3.2 菌液组
分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液1mL，注入平皿，每株试验菌平行制备2个平皿，倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置35℃培养3天，测定所加的试验菌数。
取白色念珠菌试验菌悬液1 mL，注入平皿，平行制备2个平皿，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置25℃培养4天，测定所加的试验菌数。
取黑曲霉菌悬液1mL，注入平皿，平行制备2个平皿，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置25℃培养4天，测定所加的试验菌数。
2.1.1.3.3 试验组
取1:10供试液1mL和大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液1mL，分别注入平皿
中，倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，35℃培养3天，计数；
取1:10供试液1 mL和白色念珠菌、黑曲霉菌悬液1 ml倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，25℃培养5天，计数。
2.1.1.4 结果
试验组菌回收率：(试验组菌数-供试品本底菌数)/菌液组菌数×100%。结果如表1所示。
表1 常规法菌落计数验证结果（单位：cfu）
如表1所示，本品采用常规法检查，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种试验菌的回收率均为0，说明本品对细菌具有较强的抑菌作用；供试品对白色念珠菌、黑曲霉的回收率均高于70%，说明可采用常规法进行细菌、霉菌和酵母菌的检查。
2.1.2 稀释法测定细菌数的方法验证
2.1.2.1 菌液制备 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种试验菌的制备见2.1.1.1
2.1.2.2 供试液制备 见2.1.1.2
2.1.2.3 回收率测定
2.1.2.3.1 供试品组
取1:10供试液1ml，等量注入5个平皿中，每皿0.2mL，平行重复2次，测定供试品本底细菌数；
2.1.2.3.2 菌液组 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种试验菌菌液组，见2.1.1.3.2
2.1.2.3.3 试验组
取1:10供试液0.2mL和大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液1mL，分别注入平皿
中，倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，35℃培养3天，计数。
2.1.2.4 结果
试验组菌回收率：(试验组菌数-供试品本底菌数)/菌液组菌数×100%。结果如表2所示。
表2 稀释法菌落计数验证结果（单位：cfu）
注：表中菌落数为稀释法中各个平皿计数之和
如表2所示，采用稀释法（0.2mL/皿），供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种试验菌的回收率均低于70%，说明应采用其它方法检查。
2.1.3薄膜法测定细菌数的方法验证[3]
取1:10供试液1ml过滤，用300 ml无菌pH7.0氯化钠-蛋白栋缓冲液冲洗，在最后一次冲洗时分别加入1ml大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液。取出滤膜，菌面朝上，帖于营养琼脂平板上。置35℃培养3天，计数。菌液组、供试品对照组，稀释剂对照组同法操作。结果见表3，表中可看出采用薄膜过滤法检查，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种试验菌的回收率均高于70%，说明可采用薄膜法进行细菌计数检查。
表3 薄膜法菌落计数验证结果（单位：cfu）
2.2 控制菌检查方法的验证
2.2.1 方法。取1:10供试液10ml，用集菌仪过滤，用400 ml稀释剂冲洗4次，在最后一次冲洗液中分别加入1 ml相应的试验菌株，取出滤膜，放入相应菌培养基中（检查金黄色葡萄球菌放入100ml营养肉汤培养基中，检查铜绿假单胞菌放入胆盐乳糖培养基中），置35℃培养20h。分别取培养物，划线接种于平板上（检查金黄色葡萄球菌采用甘露醇氯化钠琼脂培养基，检查铜绿假单胞菌采用溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基）。培养20小时，观察。
2.2.2结果 采用薄膜法可以检出铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。
3.讨论
氧化锌洗剂为局部给药制剂，本品可采用常规法进行霉菌和酵母菌计数，采用离心沉淀配合薄膜过滤法进行细菌计数和控制菌检查。薄膜过滤时，采用少量多次冲洗的方法可以有效地消除抑菌性。
【参考文献】
[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典(二部)[Z]．北京：化学工业出版社，2005：附录XIJ．
[2]马绪荣，苏德模．药品微生物学检验手册[M]．北京：科学出版社，2000：65．
[3]桑国卫．中国药品检验标准操作规范[M]．北京：中国医药科技出版社，2005：325．
论文作者:胡泽锴,毛腾霄
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第25期供稿
论文发表时间:2015/10/28
标签：培养基论文; 葡萄球菌论文; 琼脂论文; 芽孢论文; 金黄色论文; 枯草论文; 回收率论文; 《医药前沿》2015年第25期供稿论文;