许雪梅[1]2002年在《人乳头瘤病毒16型E6E7基因的克隆、修饰及与共激活分子B7-1协同诱导特异性免疫反应的研究》文中指出人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是重要的性传播因子，可引起人皮肤粘膜的增生性疾病及恶性肿瘤。根据HPV与良恶性病变的关系分为低危组和高危组。HPV16是高危组最重要的基因型，与宫颈癌等泌尿生殖系恶性肿瘤的发生密切相关，除此之外还与口腔癌、肺癌、食管癌的发生具有一定的关系。我组多年攻关研究及国外报道均表明：HPV16E6及E7为病毒的主要转化基因，E6及E7的表达为癌细胞恶性表型维持所必须。流行病调查资料显示：人群感染HPV16后，可产生抗HPV16E6及E7特异免疫。因而，研制防治HPV16相关疾病的疫苗，E6和E7是理想的靶抗原。 由于E6及E7为病毒转化基因，利用E6及E7基因直接作为疫苗具有潜在的致癌性，因此去除E6及E7的转化活性，保留其抗原性是利用E6及E7研制疫苗的前提。文献报道表明E7第24位氨基酸的突变可废除E7的转化活性。为了涵盖较多的抗原表位，本研究拟利用中国宫颈癌标本中E6及E7基因作为疫苗研究的靶基因。定点突变E7的第24位氨基酸，敲除E7的转化活性，然后对E6的终止密码区进行突变修饰，构建E6E7融合基因fmE6E7(fused and mutated E6E7gene，fmE6E7)，在证实fmE6E7的转化活性敲除之后，用于DNA疫苗的构建及研究。 根据T淋巴细胞活化的双信号学说和MHC(major histocomplex)I类分子呈递抗原的规律，为了有效地活化T细胞，本研究构建淋巴细胞活化所必需的共刺激分子B7-1的真核表达质粒pcDNA3.1-B7-1，采用裸DNA肌肉接种的免疫方式，使E6E7在机体组织细胞内翻译成蛋白进入MHCI类分子抗原呈递途径，同时辅以共激活分子B7-1基因共同免疫，以期有效地活化机体的免疫反应，特别是CTL(cytotoxic T lymphocyte，CTL)活性。获得以下结果： 1．首先对宫颈癌标本中HPV的感染型别进行检测，14例宫颈癌活检标本中，
许雪梅, 朱明昭, 张明策, 司静懿, 李昆[2]2003年在《人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应》文中进行了进一步梳理目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显着提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。
参考文献：
[1]. 人乳头瘤病毒16型E6E7基因的克隆、修饰及与共激活分子B7-1协同诱导特异性免疫反应的研究[D]. 许雪梅. 中国协和医科大学. 2002
[2]. 人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应[J]. 许雪梅, 朱明昭, 张明策, 司静懿, 李昆. 中国医学科学院学报. 2003