唐中华[1]2002年在《喜树中喜树碱和10—羟基喜树碱的代谢生物学研究》文中指出应用高效液相色谱技术对我国特有树种——喜树(Camptotheca acuminata)在种子形成、成熟、萌发、幼苗生长及高温胁迫过程中喜树碱和10-羟基喜树碱的代谢动态进行了详尽的研究。结果发现，喜树碱和10-羟基喜树碱像大多数其它生物碱一样，特异性地受到组织发育程度和环境因子的调控，特别是10-羟基喜树碱趋向于在成熟过程中的种子中、吸胀第12～13天的种芽中、新出现的子叶中、幼嫩叶片中和高温胁迫后的幼嫩组织中大量积累，这些幼嫩的和受到生理胁迫的组织也是植物必须特别保护的部位，这也从另一个侧面说明10-羟基喜树碱肯定直接参与了喜树化学防御的过程，而喜树碱主要充当贮藏库和提供代谢源的任务，是一个常规的防御措施，所以它受发育和环境因子调控的程度也就比10-羟基喜树碱低：在高温胁迫条件下，喜树碱和10-羟基喜树碱分别在38℃和40℃度达到各自的峰值，比以丙二醛和叶绿素为指标的致死温度低了2～4℃，说明喜树碱和10-羟基喜树碱作为喜树的化学防御手段在喜树受到生理胁迫的最前期就已被启动，对于缓解喜树的生理胁迫起到了积极的作用，其作用机制可能是10-羟基喜树碱通过中和由胁迫诱导的酸性物质，从而稳定细胞质中的在生理活性范围内而缓解植物生理胁迫；关于喜树碱和10-羟基喜树碱之间的关系，我们认为喜树碱羟基化形成10-羟基喜树碱的反应可能不是单向的，而是可逆的，后者去羟基化后可以转化为喜树碱，这是处于生长和防御两难境地的植物充分利用有限量的氮资源必然的要求。
李香莉[2]2007年在《喜树生长过程中喜树碱及10-羟基喜树碱的代谢规律研究》文中指出本项研究利用高效液相色谱方法较为系统地测定了贵阳地区不同生长季节喜树嫩叶、成熟叶和果实中喜树碱及10-羟基喜树碱含量的动态变化并对贵州省不同地区喜树叶和喜树果中喜树碱及10-羟基喜树碱的含量进行了分析。所获结果如下:建立了同时测定喜树叶中喜树碱和10-羟基喜树碱含量的高效液相色谱分析方法。贵州省不同地区喜树叶和喜树果中喜树碱和10-羟基喜树碱的含量差异显着,其中以铜仁地区所产的喜树中喜树碱含量最高,六盘水地区的喜树中10-羟基喜树碱含量最高,对喜树碱及10-羟基喜树碱含量进行综合分析认为六盘水地区的喜树中二者含量均较高,可作为贵州省喜树和喜树碱产业化的优势地理种源。在一年的生长过程中,喜树嫩叶中喜树碱的含量变化为一双峰曲线,分别在7月和9月达到峰值,其中7月的含量最高;成熟叶中喜树碱的含量持续下降;除4-5月,喜树成熟叶中的喜树碱含量略高于嫩叶中的含量,其他月份喜树嫩叶中喜树碱含量均显着高于成熟叶中的含量。在一年的生长期内,不同月份喜树嫩叶中10-羟基喜树碱含量波动很大,4月含量较高,5月显着下降,此后基本在这两个水平间升降变动,10月以后持续上升;成熟叶中10-羟基喜树碱除在7月降到最低水平,其他时期是持续增加的变化趋势。在生长过程中,喜树叶片中喜树碱和10-羟基喜树碱的含量变化呈现出明显的相关性。早期喜树嫩叶中喜树碱和10-羟基喜树碱的含量均较高,6月以后,二者的变化呈现出较好的互补性;在整个生长期,成熟叶中喜树碱的含量持续下降,而10-羟基喜树碱的含量除在7月出现骤降,此时为嫩叶中喜树碱的含量达到最高的时候,其他时期与喜树碱的变化相反为持续上升的趋势。在果实成熟的过程,喜树碱和10-羟基喜树碱含量均是持续增加的,完全成熟时二者含量达到最高,此时为喜树果采收的最佳时期。实验结果表明,喜树碱和10-羟基喜树碱特异的积累在喜树的幼嫩组织和果实中,在这些容易受到伤害的部位和生长的关键时期担当着化学防御的作用。二者在叶片中的代谢动态呈现出的相关性暗示喜树碱和10-羟基喜树碱之间转化的途径可能不仅是由喜树碱到其衍生物10-羟基喜树碱的方式,或许还存在由10-羟基喜树碱去羟基生成喜树碱的趋向。
沈少华[3]2011年在《转Bax和tdc基因对喜树碱及10-羟基喜树碱生物合成的影响》文中提出细胞凋亡是普遍存在于动植物中的一种由基因调控的细胞主动死亡方式。细胞凋亡不仅是植物体正常生长发育必不可少的调控方式,还是植物抵御病原体侵害的重要手段。Bax基因是Bcl-2基因家族的成员,该基因的表达能够诱发细胞凋亡。喜树碱及其衍生物的生物合成途径是一个多酶催化的复杂过程,涉及许多关键酶和相关基因。喜树色氨酸脱羧酶(tryptophan decarboxylase, TDC)基因是喜树中喜树碱及其衍生物生物合成途径中的关键酶基因,该基因已被成功克隆,但是关于它在喜树次生代谢中的作用并不清楚。本研究将促进细胞凋亡的Bax基因和喜树tdc基因转化到喜树细胞中,分别研究促细胞凋亡基因以及喜树碱合成过程关键酶基因过量表达对喜树次生代谢物合成的影响。主要实验结果如下：1.Bax基因对喜树细胞凋亡和喜树碱合成的影响运用PCR检测证明促细胞凋亡Bax基因(Est型启动子)成功转化到喜树细胞中。通过RT-PCR、荧光定量PCR和Western blotting实验证实Bax基因正常表达。通过细胞形态观察和TTC细胞活性检测,发现诱导Bax基因表达促进喜树细胞凋亡。建立并优化了转基因系的诱导表达体系。在未添加Est诱导前,喜树碱和10-羟基喜树碱的含量与非转基因对照组无显着差异。在添加：5mg/L Est诱导两周的转化细胞中,相关代谢物的含量比对照组有显着提高,分别为对照组的2.2倍和4.3倍。2.喜树tdc同源基因遗传转化喜树以及对喜树碱合成的影响克隆了喜树tdc同源基因tdcl和tdc2,构建了植物表达载体pBIN-35S-tdcl-GFP和pBIN-35S-tdc2-GFP,并导入根癌农杆菌GV3101中。利用优化的叶盘法对喜树进行遗传转化,并通过PCR检测证实了转基因细胞株的获得。喜树碱检测结果显示tdc过表达能促进喜树碱和10-羟基喜树碱含量的积累。3.喜树碱和10-羟基喜树碱提取方法的优化及RP-HPLC荧光检测方法的建立通过对多种提取方法进行比较,得到同时提取喜树碱和10-羟基喜树碱的最优方法为：55%的乙醇匀浆16min,60℃水浴30min,超声提取15min。建立了RP-HPLC荧光检测喜树碱和10-羟基喜树含量的方法。
王敏[4]2009年在《羟基喜树碱和去甲斑蝥素对肿瘤及其宿主细胞区别杀伤作用的研究》文中研究指明肿瘤是人类健康的大敌,其治疗也主要是手术切除、放疗与化疗。近年来,中药及其活性成分在临床上用于抗肿瘤的治疗越来越受到各界学者的关注。喜树碱(camptothecin,CPT)是分离自珙桐科植物喜树(Camptotheca acuminate Decne)的一种五环生物碱,是迄今发现的唯一有选择性抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)的抗癌植物药。10-羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine HCPT)的化学结构与CPT相似,是后来分离自喜树的另一种抗癌活性成分。HCPT与CPT相比,毒性小,疗效更好,现已广泛用于临床,主要用于非小细胞肺癌、肝癌和膀胱癌等肿瘤的治疗。斑蝥(mylabris)系鞘翅目芫青科昆虫,南方大斑蝥或黑黄小斑蝥的干虫体均可入药,在我国用于肿瘤的治疗已有两千余年的历史,具攻毒蚀疽、破血散结的作用。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)是在对斑蝥抗肿瘤有效成分斑蝥素(canthaidin)的构效关系研究基础上,由人工合成而来。NCTD在具有显着抗肿瘤活性的同时能升高外周血白细胞数,现广泛用于临床,主要用于肝癌、肺癌等的治疗。目前,大多数抗癌药物在对癌细胞有效杀伤的同时,对其正常宿主细胞的杀伤作用也不可忽视,甚至一些药物对正常细胞的杀伤大于肿瘤细胞。因此,研究药物对肿瘤和宿主细胞的区别杀伤作用显得尤为重要和迫切。本文选用同一组织来源的人肺腺癌细胞(A549)和宿主人胚肺成纤维细胞(MRC-5),用不同浓度HCPT和NCTD作用不同时间,研究这两种药物对肿瘤和宿主的区别杀伤作用。结果显示:50-100μmol/L的HCPT在0-72h对A549杀伤作用均大于MRC-5,但作用72h时,对MRC-5杀伤作用也很大,HCPT对两种细胞的半数抑制浓度均＜50μmol/L;30-60μmol/L的NCTD在作用24h时,对A549的杀伤作用强于MRC-5,而作用48h和72h时对MRC-5的杀伤超过A549。通过药物脉冲作用细胞24h后恢复培养5天发现,实验剂量范围内HCPT对A549和MRC-5的生长抑制作用在停止药物作用后1天之内仍然存在,但杀伤A549强于MRC-5的区别杀伤作用在恢复培养中不明显,两种细胞生长与对照相比均未恢复;实验剂量范围内NCTD对A549和MRC-5的生长抑制作用在停止药物作用后马上消失,但杀伤A549强于MRC-5的区别杀伤作用在恢复培养时仍然存在,表现为30μmol/LNCTD剂量组MRC-5生长恢复较快,恢复培养3天时与对照组相比无显着性差异,而A549需要5天。用30μmol/L的NCTD和50μmol/L的HCPT作用细胞,收集细胞进行流式细胞术,结果显示:50μmol/L的HCPT引起A549细胞S期阻滞,且48h后凋亡率明显增加,而MRC-5则只显示明显S期阻滞;30μmol/L的NCTD能引起A549和MRC-5的G2-M期阻滞,A549强于MRC-5,但NCTD作用48h后MRC-5凋亡率有小幅度升高。因此,认为HCPT和NCTD对A549和MRC-5的细胞周期和凋亡影响不同,是这两种药物在一定时间和剂量范围内对两种细胞存在区别杀伤作用的原因之一。为使抗癌药敏试验研究更贴近体内环境,在体外建立了一种肿瘤和宿主细胞的共培养体系,并在此条件下研究A549和MRC-5对HCPT和NCTD的敏感性。结果显示:A549在单独培养和与MRC-5共培养时对HCPT和NCTD的敏感性没有区别;MRC-5在与A549共培养12h和72h时对HCPT较单独培养时敏感,共培养12h和24h时对NCTD较单独培养时敏感。
马云彤[5]2007年在《稳恒磁场结合抗肿瘤药物羟基喜树碱对小鼠肝癌细胞Hepa1-6抑制作用的初步研究》文中研究表明目的：研究磁场与抗肿瘤药物羟基喜树碱对肿瘤细胞Hepal-6的协同杀伤作用，并初步探讨其机制。方法：1．将Hepa1-6细胞以不同初始密度，在不同时间接种，培养完成后MTT检测光密度值，绘制不同细胞密度的生长曲线，以筛选药物处理时适宜的细胞初始接种密度；2．采用不同终浓度的羟基喜树碱处理Hepal-6细胞24h，MTT检测，以筛选羟基喜树碱与稳恒磁场协同处理Hepa1-6细胞时适宜的羟基喜树碱浓度；3．采用MTT法检测了抗肿瘤药物(羟基喜树碱)和稳恒磁场联合处理对Hepa1-6细胞(小鼠肝癌细胞)增殖的影响。4．通过单细胞凝胶电泳、原子力显微镜及流式细胞仪等分析检测技术进行磁场结合抗肿瘤药物对Hepa1-6细胞协同杀伤效应的研究。结果：1．(1)Hepa1-6细胞以1×10~5 cells／mL的初始细胞密度接种，MTT检测的结果表明，在接种后的60h内处于对数生长期，因而在磁场和药物处理实验中，适于作为初始接种密度。2．以终浓度0.01，0.5，0.1，0.2，0.4，0.8，1.2μg／mL羟基喜树碱处理Hepa1-6细胞24h，MTT检测显示，0.2μg／mL及以上终浓度的羟基喜树碱对Hepa1-6细胞产生抑制作用，差异极显着(P＜0.01)。3．Hepa1-6细胞以1×10~5cells／mL的细胞密度接种，经磁场处理，MTT检测的结果表明曝磁36h时细胞增殖受到抑制；以浓度为0.2μg／mL羟基喜树碱联合磁场处理Hepa1-6细胞24h后，磁场可增强羟基喜树碱对Hepa1-6细胞的抑制作用，与单纯药物处理相比差异显着(P＜0.05)。4．0.2μg／mL羟基喜树碱联合磁场处理Hepa1-6细胞24h后，细胞形态改变，细胞膜不完整，细胞表面出现突起、孔洞；但SCGE检测的结果表明，细胞DNA没有出现损伤，显示二者联合后对肿瘤细胞的抑制作用不是由DNA损伤引起；检测细胞周期分布发现，羟基喜树碱结合磁场处理Hepa1-6细胞24h后，G2／M期细胞明显增加，显示出磁场对羟基喜树碱阻滞Hepa1-6细胞G2／M期的效应具有协同作用。结论：稳恒磁场结合抗肿瘤药物(羟基喜树碱)在一定的条件下对Hepa1-6细胞有协同抑制效应，主要表现在细胞活性下降、细胞G2／M期被阻滞、细胞形态受损，但未检测出细胞DNA损伤。提示在所采用的药物浓度和时间下，稳恒磁场结合羟基喜树碱对Hepa1-6细胞的协同抑制效应，可能由对细胞增殖周期的阻滞引起。
赵腾飞[6]2013年在《胆酸偶联喜树碱新衍生物的合成及生物活性测定》文中进行了进一步梳理本文以喜树碱为细胞毒素集团,胆酸为癌细胞识别集团合成了16个未见报道的胆酸偶联喜树碱新衍生物,并通过IR、H1NMR、LC-MS方法确认了化合物结构。目标是为了进一步降低新合成喜树碱类化合物的毒性,增强的血浆中的稳定性,提高对肿瘤细胞选择性及抗肿瘤活性,并测试不同连接链和连接不同胆酸对喜树碱新衍生物活性的影响,寻求最佳的组合方式,我们在前期一系列工作的基础上,利用酯键、酰胺键将四种胆酸通过四种链偶联至喜树碱的10位和20位上,共合成了十六个胆酸偶联喜树碱类化合物,使用的合成方法周期短,反应得率高。对新合成胆酸偶联喜树碱类化合物的体外抗肿瘤活性检测结果显示,在20位引入胆酸的新衍生物表现出了对结肠癌细胞较好的抑制性；对肝癌细胞表现出接近喜树碱的活性,其中G4的IC50值仅为喜树碱的五分之一；对乳腺癌细胞表现出比肝肠癌细胞明显差的抑制性活性。喜树碱对叁种癌细胞抑制活性接近,这体现出了喜树碱与胆酸链接后具备了对细胞的选择性。另外连接链的不同,及胆酸的不同都对新衍生物的抗肿瘤活性表现出了影响。选取E2进行肝癌细胞和乳腺癌细胞荧光成像实验,结果显示只在肝癌细胞中发现肉眼可见荧光,并且随着药物浓度的增加,肝细胞中荧光亮度变大,这体现出药物对肝细胞的靶向性及浓度依赖性。H22移植的小鼠体内抑制肿瘤活性实验结果表明,化合物G4的体内抗肿瘤活性优于阳性对照10-羟基喜树碱,并且20位引入胆酸的新衍生物毒性明显降低。在小鼠血清中考察了所得化合物的内酯环稳定性。新衍生物和喜树碱相比,血浆稳定性有了很大的提高。总之,在喜树碱10位或20位引入胆酸都可以提高新衍生物在血浆中的稳定性,在喜树碱20位引入胆酸可以赋予新衍生物对于肝肠细胞的选择性,降低喜树碱衍生物的体内毒性,其中引入鹅脱氧胆酸和脱氧胆酸会大幅度提高新衍生物对肝癌细胞的选择性。
廖志华[7]2004年在《紫杉醇前体生物合成的分子生物学和抗癌萜类吲哚生物碱的代谢工程》文中提出紫杉醇的生物合成来源于经典的MVA途径和新近发现的DXP途径。为研究紫杉醇前体生物合成途径的分子生物学，本文首先建立了从成熟的曼地亚红豆杉等裸子植物的各种成熟组织中提取高质量RNA的方法；在此基础上，采用RACE方法从曼地亚红豆杉中首次克隆了MVA途径上叁个重要基因的全长cDNA，包括tmhmgr(曼地亚红豆杉3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合成酶基因)，tmfps(曼地亚红豆杉法呢基焦磷酸合成酶基因)，tmipi(曼地亚红豆杉异戊烯焦磷酸异构酶基因)；同时克隆了DXP途径上的两个限速酶tmdxs(曼地亚红豆杉5-磷酸脱氧木酮糖合成酶基因)和tmdxr(曼地亚红豆杉5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因)的全长cDNA；克隆了为紫杉醇提供二萜骨架(20碳原子)的tmggpps(曼地亚红豆杉香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因)的基因组序列，并获得全长cDNA；由于这些基因都是首次从裸子植物中获得，故对这些基因及其编码的酶进行了详尽的生物信息学分析；采用遗传功能互补的方法验证了tmhmgr、tmfps、tmggpps基因的功能，结果显示，tmhmgr能够弥补酵母JRY2394缺失的HMGR功能，tmfps能够弥补酵母CC25缺失的FPS功能，tmggpps能够弥补酵母SFNY368缺失的GGPPS功能，证明它们编码相应的功能蛋白；在大肠杆菌中过量表达tmipi推动DXP途径代谢流向下游流动，促进β-胡萝卜素的生物合成而验证了tmipi的功能；Southern杂交结果表明，tmhmgr、tmfps、tmipi、tmdxs在曼地亚红豆杉中都是其相应基因家族的成员；Northern杂交结果表明，tmhmgr在曼地亚红豆杉根、茎和叶中都有表达，但表达量有差异，tmhmgr在地上部分的表达高于地下部分，这与紫杉醇的药用部位相一致；tmfps在根、茎、叶中都有表达，在根和树干中的表达量没有明显差异，在针叶中的表达量高于根和树干。首次发现tmggpps是一个没有内含子的基因，有本底表达水平，在用甲基茉莉酸处理曼地亚红豆杉细权只k李讨阮七学位专七火。一~l胞后，其表达量大为提高且维持较长时间，有利于紫杉醇的积累;获得了切茗邵砂，上游调控序列，通过生物信息学分析，发现了与长春花str基因MeJA反应元件G一box一样的顺式作用元件CACGTC，该元件可能是MeJA诱导加g盯，，表达上调的分子基础;分别采用紫外线和甲基茉莉酸处理曼地亚红豆杉细胞，结果显示，tme众‘在处理后细胞中的表达水平提高，这表明，紫外线和甲基茉莉酸是促使该基因表达上调的两个信号;作为紫杉醇前体生物合成途径中的关键基因，切啥邵少，和tm加都受到MeJA的影响而上调表达，这个现象的发现为MeJA诱导紫杉醇超量积累的分子机制的阐明提供了事实依据。本文关于这些基因的研究为深入阐明紫杉醇生物合成的分子生物学、分子遗传学和生物化学机理莫定了重要基础，为紫杉醇的代谢工程提供了更多可能的调控靶点。 喜树碱、经基喜树碱、长春花碱和长春新碱都是高效的抗癌天然药物，属于菇类叫垛生物碱(Terpenoid hidole Alkalnids，TIAs)，但在植物中的含量都很低。本文对这些抗癌叫噪生物碱的代谢工程进行了研究。从长春花中克隆了TIAs生物合成途径上的关键酶基因tdc、str和g10h，以及调控长春花T认s生物合成途径上多个基因的转录因子。rc“了，构建了双元植物表达载体:p1304++比沦勺tr、pl304++g]oh、pl304++orca了、pl3o4++g 20人+orca了，导入了根癌农杆菌LB从404并获得了工程菌株，同时导入卸甲型根癌农杆菌C58CI(P形A4)并获得了工程菌株;用LBA4404+P 1 304+十r改十‘tr遗传转化喜树，用15。留ml潮霉素筛选，获得多个独立转化的抗性愈伤组织，在多次继代除菌培养后，用PCR在继代培养抗性愈伤组织的基因组DNA中检测到转入的潮霉素抗性基因、外源目的基因tdc、s介:同时用Rl’- PCR检测到了tdc和str的表达;HPLC分析结果表明，转基因喜树愈伤组织中轻基喜树碱和喜树碱含量比普通愈伤组织中的含量显着提高，转基因喜树愈伤组织中经基喜树碱最高含量达到1.87mg/g干重，喜树碱最高含量达到6.52m砂g干重，证明长春花TIAs生物合成上游途径上的基因可以用于具有共通途径的喜树TIAs的代谢工程，提高喜树中喜树碱和经基喜树碱的含量。用c58CI(p形A4)，C58CI印形A4)+P 1304++g 10h，C58CI(p瓦A4)+pl3o4++orca了，C58CI印形A4)+p1304++g 10h+O rca3分别转化了长春花，获得了多个毛状根，在多次继代除菌培养后，用PCR在继代培养的毛状根(C 58CI印形A4)转化获得的长春花毛状根)的基因组DNA中检测到导致并维持毛状根表型的rolB和rolC基因，并用RpPCR检测到rolB和rolC基因的表达;在其他叁种携带目的基因的工程菌转化获得的长春花毛状根基因组DNA中检测到潮霉素抗性基因，rolB和rolC基因，同时用 Rl’- PCR检测到潮霉素抗性基因、rolB和roIC基因的表达。这些结果表明我们获得了长春花毛状根、转gI0h的长春花毛状根、转口rc心的长春花毛状根、共转化g10h和。rca了的长春花毛状根，为进一步研究转基因对长春掇只k李例卜七学州叶七火、.咳洲奉生用“幻做的，曰阳七传月.~.一花TIAs代谢组的影响提供了重要的材料，同时为利用转基因毛状根开展长春花抗癌菇类叫噪生物碱代谢工程奠定了坚实的基础。
戴绍军[8]2002年在《环境因子对喜树幼苗生长和喜树碱含量的影响》文中认为研究了土壤水分、土壤自然干旱、PEG模拟干旱、土质、光强、光质等环境条件对年生喜树幼苗生长、光合作用、幼苗喜树碱含量和产量的影响。分析了一年生喜树幼苗根、茎、叶中喜树碱的分布关系及对环境因子的响应，并据此总结和探讨了高喜树碱产量喜树幼苗的培育和采收方案。 生长在土壤干旱条件下的幼苗，生物量明显低于正常条件下的幼苗。幼苗的光合作用降低，各时期幼苗的气孔导度、净光合速率都低于正常，甚至出现了“光合午休”现象。生物量和光合作用的顺序为：正常〉轻度干旱〉重度干旱。土壤干旱胁迫明显提高了喜树幼苗根、茎、叶中的喜树碱含量。幼苗平均喜树碱含量的顺序为：重度干旱〉轻度干旱〉正常。但是由于干旱胁迫限制了幼苗的生物量，所以喜树碱含量高的幼苗并没有得到高的喜树碱产量。不同浓度的PEG模拟干旱和土壤自然干旱实验表明，在水分胁迫条件下幼苗叶片的含水量下降，膜透性增强，随着干旱时间的延长，受到的伤害逐渐增大，在干旱的前期幼苗叶片中的喜树碱含量增大，后期低于正常。 在幼苗生长的初期，轻度遮荫有利于幼苗叶片的生长，但是在幼苗生长的中后期，遮荫限制了幼苗的生长，幼苗的光合作用和生物量明显低于正常。遮荫有利于喜树幼苗根、茎、叶中喜树碱的含量的提高。幼苗中平均喜树碱含量的顺序为：重度遮荫〉轻度遮荫〉正常。由于长期遮荫导致幼苗的生物量降低，遮荫幼苗中的喜树碱产量不是最高。在蓝色和红色遮光膜下生长的幼苗，虽然生长状况不好，但是叶片中的喜树碱高于正常，并且随着处理时间的延长，含量逐渐升高。黄色遮光膜下生长的幼苗，虽然喜树碱含量稍高于正常，但与处理时间没有明显的相关关系。 同时干旱和遮荫的幼苗喜树碱含量明显高于正常，但光合作用很弱，生物量很低，喜树碱也产量很低。 土壤质地影响幼苗的生长。生长在沙土(花土：沙土=1：2)中的幼苗光合作用、生物量和叶片中的喜树碱含量低于生长在土中的幼苗。 叶片喜树碱含量与叶位的关系可用方程y=ac~(bx)描述，叶片中的喜树碱含量与时间(叶龄)的关系可用方程y=kx+b描述。幼苗根和茎中喜树碱含量的相关性很强，茎和叶、根和叶中喜树碱含量的相关性不是很强。环境因子对根和茎、茎和叶、根和叶中喜树碱含量的相关性有一定的影响。 在育苗生产实践中，保证土壤营养是幼苗旺盛生长和高喜树碱产量的关键。在这个前提下，适度地和定期地遮荫和干旱胁迫处理是获得高产量喜树碱的有效手段。
刘展眉[9]2012年在《耦合Ri质粒介导发根技术的喜树次生代谢物研究》文中研究指明喜树为中国特有树种,喜树碱系列衍生物抗癌药物是附加值极高的产品。Ri质粒诱导的发根具有生长迅速、激素自养、生长条件简单、次生代谢产物含量稳定、分化程度高、不易变异等特点,而且可把代谢物分泌至培养基中。本研究用植物转基因工具发根农杆菌,对喜树进行基因干预,实现喜树药用价值次生代谢物的合成；用大孔吸附树脂完成离线分离富集工作,用化学计算指导分子印迹化合物的设计和合成,探讨喜树发根培养次生代谢物的原位捕抓和专一吸附；用细胞模型(黑色素瘤细胞)评价了喜树次生代谢物的药理活性,探讨了次生代谢物的抗氧化能力,进一步阐明了相关物质的抗癌药用机理和抗氧化能力。本研究的具体工作总结如下：1.建立了Ri质粒介导的喜树发根的培养体系：选择发根农杆菌种ATCC15834作为介导菌株；证实用无菌苗子叶进行发根培养,发根率最高,发根农杆菌经液体培养至OD600为近0.8,稀释5倍用于接种感染喜树外植体；用250mg/L羧苄青霉素+250mg/L替漫汀抗菌；发根在含蔗糖30g/L的HRIM培养基中生长较迅速,液体培养介质有利于喜树发根生长,选8小时光照条件,发根的PH范围以5.5-6.0为优。2.确定了喜树碱及羟基喜树碱的定量测定方法；毛状根的喜树碱含量0.022mg.g-1(D.W)与正常根含量0.027mg.g-1(D.W)接近；30天培养基中喜树碱含量达根含量的近30%。3.用大孔吸附树脂离线分离富集培养基中次生代谢物,证实HPD722树脂对喜树碱效果最好；动态参数是：氯仿/乙醇(1：1)作解吸液,解吸液PH值为3,上柱流速1.0ml/min,从培养基中提取了β-谷甾醇、喜树碱、羟基喜树碱；确定了金丝桃苷的存在。4.以与喜树碱含有相似官能团的茶碱为模板分子,制备了对茶碱有良好吸附能力的单分散或窄分散分子印迹聚合物微球,为喜树碱分子印迹微球的制备筛选了系列参数：GMA和DVB用量配比为4：6得到单分散的聚合物微球,微球的平均粒径为2.65μm；分子印迹聚合物微球的接枝量可以通过控制PGMA-DVB微球表面环氧基含量进行调整；当分子印迹聚合物的接枝量增大到12%时,其吸附量达到14μg/g。5.运用Gaussian03程序包,采用密度泛函理论(DFT, Density Functional Theory)方法,对喜树碱分子和功能单体分子丙烯酰胺以及二者所形成的复合物的构象进行几何优化,在此基础上结合自然键轨道(NBO)进行计算并分析喜树碱E环C-0键的成键性质,解释其易分解的原因。对化合物数据库进行搜索,寻找与喜树碱结构近似的分子：H(8-ethyl-8-hydroxybenzo[6,7]indolizino[2,3-b]quinoline-9,12(6H,8H)-d ione)6.证实喜树碱、羟基喜树碱、β-谷甾醇对人A375细胞及鼠B16-F10细胞生长有显着抑制作用,不同浓度处理后与对照组比较差别有显着性(P<0.05),呈浓度时间依赖性;而金丝桃苷、白桦酯酸对人A375细胞及鼠B16-F10细胞生长没有显着抑制作用；喜树碱的抑制浓度(IC50)测得是35μmol/L,羟基喜树碱的抑制浓度(IC50)测得是32μmol/L,β-谷甾醇的抑制浓度(IC50)测得是0.75mmol/L；喜树碱对B16-F10细胞周期的影响是：改变细胞的周期分布,使细胞周期出现S期延长,G0-G1期缩短。7.通过邻苯叁酚自氧化法、清除DPPH自由基法和清除ABTS自由基叁种方法得到金丝桃苷的抗氧化能力接近VC,β-谷甾醇的抗氧化能力与BTH接近的结果,金丝桃苷的IC50为0.043g/L。β-谷甾醇的IC50为0.73g/L
参考文献：
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[2]. 喜树生长过程中喜树碱及10-羟基喜树碱的代谢规律研究[D]. 李香莉. 贵州师范大学. 2007
[3]. 转Bax和tdc基因对喜树碱及10-羟基喜树碱生物合成的影响[D]. 沈少华. 杭州师范大学. 2011
[4]. 羟基喜树碱和去甲斑蝥素对肿瘤及其宿主细胞区别杀伤作用的研究[D]. 王敏. 北京中医药大学. 2009
[5]. 稳恒磁场结合抗肿瘤药物羟基喜树碱对小鼠肝癌细胞Hepa1-6抑制作用的初步研究[D]. 马云彤. 陕西师范大学. 2007
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[9]. 耦合Ri质粒介导发根技术的喜树次生代谢物研究[D]. 刘展眉. 广东工业大学. 2012