（江苏省苏北人民医院急诊科 江苏 扬州 225001）
【摘要】目的：探讨百草枯(PQ)诱导人肺上皮细胞HPAEpiC发生上皮间质转化(EMT)的作用及其分子机制。方法：MTT法计算PQ对HPAEpiC细胞的半数抑制浓度(IC50)值，计算最适合诱导HPAEpiC细胞发生EMT的浓度。应用不同活性的Rac1质粒pExRed-NLS Flag（空载体组）、pExRed-NLS Flag Rac1（野生型Rac1组）、pExRed-NLS Flag Rac1T17N（显性负调控Rac1组）、pExRed-NLS Flag Rac1G12V（持续活化型Rac1组）瞬时转染HPAEpiC细胞，经PQ处理细胞。采用免疫印迹法检测上皮标志物Ck8、E-cadherin和间质标志物Vimentin、α-SMA表达，Transwell法检测细胞迁移能力，同时采用流式细胞仪检测细胞的ROS水平。结果：PQ对HPAEpiC细胞的IC50值为91.3μmol/L;体外PQ诱导HPAEpiC细胞上皮间质转化的发生，并伴随着细胞迁移能力的增强，同时促进HPAEpiC细胞ROS的表达。与PQ组、空载体组和野生型Rac1组比，持续活化型Rac1转染细胞后，PQ诱导的上皮间质转化过程明显增强，同时迁移能力增强，ROS表达增高；而显性负调控Rac1转染细胞后，则得出相反的结论。结论：PQ在促进人肺上皮HPAEpiC细胞死亡的同时促进其向EMT转化，且通过Rac1-ROS来诱导HPAEpiC细胞上皮间质转化的发生。
【关键词】HPAEpiC细胞；Rac1；ROS；上皮间质转化
【中图分类号】R595.4 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）22-0230-03
百草枯（paraquat，PQ）是一种在世界范围内广泛使用的高效除草剂，中毒致死剂量极低，无特效解毒药物，百草枯中毒患者以肺损伤最为突出，早期多死于为急性呼吸窘迫综合征，而晚期多发生肺纤维化。
目前百草枯致肺纤维化的机制尚不明确，近年来研究表明肺泡上皮细胞可通过上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）向肌成纤维细胞转化[1]。研究证实EMT是肺纤维化发生发展的重要机制，而肺上皮细胞EMT的发生是肺纤维化形成的重要标志之一[2-3]。
Rac1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1）属于小G蛋白超家族的重要成员之一，在多种细胞内具有调节肌动蛋白细胞骨架重组，导致细胞板状伪足形成和膜褶皱样运动，影响细胞形体极化，促进细胞运动与迁移，促进细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）产生等作用[4]。本课题组前期研究不同活性的Rac1质粒瞬时转染肝上皮细胞，证明Rac1可促进EMT。但是Rac1在百草枯肺纤维化的EMT中的作用尚不清楚，本文将通过转染不同活性的Rac1质粒到人肺上皮细胞HPAEpiC中，观察其EMT的作用。
1.材料与方法
1.1 细胞与试剂
人肺上皮细胞株HPAEpiC购自美国ATCC；百草枯购于Sigma 公司；DEME培养基、胎牛血清购于Gibco公司；MTT试剂盒购于Thermo Fisher公司；Vimentin抗体购于Merck&Millipore公司；α-SMA抗体购于Sigma公司；β-actin、CK-8、E-cadherin购于Bioworld公司；Lipofectamine2000购于Invitrogen公司；ROS试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.2 细胞培养
取人肺上皮HPAEpiC细胞，培养于含10%胎牛血清的DEME培养基中（37℃、5%CO2），待细胞融合至90%左右，用0.25%胰酶-EDTA 消化、传代。
1.3 细胞转染
将对数生长期的HPAEpiC细胞以每孔2×105个细胞接种于6孔细胞培养板，37℃培养过夜。根据Lipofectamine2000说明书操作步骤，将质粒转入细胞内，4～6h后换成正常培养基。
1.4 MTT取4×103人肺上皮 HPAEpiC细胞接种于96孔板，24h细胞贴壁后，加入不同浓度的(200、100、50、20、10、5、0μmol/L)PQ溶液，每组设3个平行孔，培养72h后，各孔加入20μg的MTT溶液(0.5%)，37℃培养箱中孵育4h，再加入150μg二甲基亚砜(DMSO)，摇床10分钟轻轻地混匀，酶联仪上选择检测波长490nm比色测定各孔的吸光度(OD值)，计算IC50值。
1.5 细胞蛋白的检测
采用 Western blotting法，取经过预处理的细胞，加PBS洗涤，加入RIPA裂解液冰上裂解30min，30min后4℃、12000r/m离心10min，取上清液于-20℃保存。各组蛋白等量加样，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，200mA恒流转至PDVF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，加入一抗室温孵育过夜，TBST洗涤3次，HRP标记的二抗室温孵育2h，TBST洗涤3次，加ECL发光液化学发光显色，压片曝光。
1.6 细胞迁移能力检测
采用Transwell小室实验，转染细胞4～6h，胰酶消化，调整各组细胞使其细胞数为1×104/ml。取各组细胞200μl加入各小室，下室加入500μl的10%FBS-DEME培养基，常规培养24h，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，光镜下随机选取6个视野，在倒置显微镜拍照、计数，取平均值。
1.7 ROS的检测
取按照上述分组培养的细胞，加入2’,7’-二氯二氢荧光素黄二乙酸酯（DCFH-DA）探针孵育30min后取细胞沉淀，PBS悬浮细胞，525mm的发射波长和488mm的激发波长检测刺激后的荧光强度。计数1×104个细胞，以DCFH-DA（DCF）的平均荧光强度表示ROS的生成量。
1.8 统计学处理
应用SPSS18.0软件进行数据统计，计量资料以（x-±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 PQ对HPAEpiC细胞增殖影响
以不同浓度PQ孵育HPAEpiC细胞，在不同时间点收集细胞，使用MTT法检测PQ对肺上皮细胞的增殖影响。如图1A所示，PQ诱导肺上皮细胞死亡呈现剂量和时间依赖性关系，PQ抑制HPAEpiC细胞的IC50值为91.3μmol/L(图1B)，结合IC50和生长曲线，我们确定50μmol/LPQ用于后续实验。
3.讨论
百草枯中毒后可引起多脏器损害，而肺脏是其重要的靶器官，引起不可逆的肺间质纤维化，治疗效果差。因此研究百草枯致肺纤维化的机制成为了急诊中毒领域的难点和重点。
EMT是具有极性的上皮细胞转化成具有活动能力、能在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程，其以上皮细胞极性的丧失和间质特性的获得为特征。体内外研究发现百草枯通过调控β-catenin来诱导EMT的发生，进而促进肺纤维化的形成[5-6]；通过博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型中，蔡琳等证实肺泡上皮细胞可以通过EMT向MFs转化[7]。
大量研究表明，氧化应激与肺纤维化的关系密切，百草枯可通过氧化还原反应在细胞内产生过量ROS，从而引发肺及各脏器细胞膜脂质氧化应激损伤。研究显示MMP3处理小鼠乳腺上皮细胞时，Rac1b可促进ROS的产生，而ROS可刺激转录因子Snail的表达和EMT的发生[8]。Rac1、ROS表达或活性的异常升高在肺纤维化过程中起着重要作用，但两者的相互作用及具体机制尚不清楚。
我们研究证实，与阴性对照组相比，PQ可刺激人肺上皮细胞HPAEpiC，在抑制细胞增殖的同时，增加了迁移能力，同时促进ROS的产生。本实验通过将不同Rac1活性的质粒转染到肺上皮细胞中，证实 Rac1通过以下两个方面影响HPAEpiC细胞 EMT：（1）细胞出现 EMT分子标志物的改变，即上皮标志物 CK8、E-cad表达下调、间质标志物 Vimentin、α-SMA表达上调；（2）Tranwell 小室实验证实细胞迁移能力增强。检测不同Rac1活性的质粒转染到肺上皮细胞后，Rac1可促进肺上皮细胞的ROS表达，表明Rac1-ROS在PQ致肺上皮细胞EMT的过程中起着关键的作用。基于以上研究，我们推测PQ通过激活Rac1-ROS信号通路来启动EMT，从而使得HPAEpiC细胞的迁移能力增强，促进了肺纤维化的发展。
综上所述，本研究通过将上调和下调Rac1活性的质粒转染到HPAEpiC细胞，初步证实Rac1-ROS可促进PQ诱导的肺上皮细胞EMT。因此深入研究Rac1-ROS在PQ致肺纤维化过程中的作用及其具体机制具有重要意义，将为PQ肺纤维发生发展及靶向治疗提供有价值的理论依据。
【参考文献】
[1]钟长军，李琳，高俊.氧化应激在特发性肺纤维化中的作用及其机制研究进展.中国药理学通报,2012,28(2):169-172.
[2] Han YY，Shen P，Chang WX.Involvement of epithelial–to-mesenchymal transition and associated transforming growth factor-beta /Smad signaling in paraquat-induced pulmonary fibrosis[J].J Mol Med Rep ,2015,12(6):7979-7984
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[4] Lagna G, Ku MM, Nguyen PH, et al. Control of phenotypic plasticity of smooth muscle cells by bone morphogenetic protein signaling through the myocardin-related transcription factors. J Biol Chem. 2007； 282(51):37244-37255.
[5]赵春燕,刘畅,朱忠立.百草枯通过调节Wnt/β-catenin信号通路促进肺上皮细胞上皮间质转化.局解手术学杂志.2017,26(11):790-795.
[6]孙兆瑞,赵扬,杨志洲.抑制Wnt/β-catenin信号通路对百草枯致肺纤维化的影响的研究.医学研究生学报.2017,30(2):117-121.
[7] 蔡琳,吴壮,徐军，等,博莱霉素诱导α平滑激动蛋白Cre重组酶转基因小鼠肺纤维化上皮细胞-间质转分化的研究.中国呼吸与危重症杂志,2009:8(1):52-56
[8] Radisky DC,Levy DD, Littlepage LE,et al.Rac1b and reactive oxygen species mediate MMP-3 induced EMT and genomic instability. Nature.2005；436(7047):123-127.
江苏省苏北人民医院院级课题，课题编号：yzucms201513，
课题名称：Racl-ROS对百草枯肺纤维化中的EMT调控作用的初步探讨。
论文作者:王晖晖,凌冰玉,张继燃,徐继扬（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2018年8月第22期
论文发表时间:2018/8/28
标签：细胞论文; 百草论文; 转染论文; 上皮细胞论文; 质粒论文; 诱导论文; 间质论文; 《医药前沿》2018年8月第22期论文;