一、聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（论文文献综述）
钱程[1]（2021）在《荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究》文中提出核酸检测技术是以生物体内的核酸为靶标进行分析的检测手段。该技术目前已经被广泛应用于食品安全检测、环境污染物监控、临床诊断、遗传分析等众多领域。从样本获取到结果输出,核酸检测技术一般包含提取、扩增和检测三个基本环节。目前,已知的核酸检测技术或是需要复杂的样本提取操作、或是需要耗时冗长的扩增环节、或是需要毒性较大的凝胶电泳鉴定等,都存在着许多的缺陷。为了能够将该技术更好的在实际使用场合中进行推广,本论文从该技术的三个基本环节入手,针对其中的不足之处进行了相应的优化和改进,建立了集荧光可视化、便携性、低成本等优点的核酸分析平台。论文中选取了三种重要的感染于常见农副产品的动植物病菌作为应用对象,将所建立的分析平台用于对这些病菌的快速检测以评估其实际性能。本论文主要研究内容及相关结论如下:（1）论文建立了集核酸快速提取、快速PCR扩增、终点肉眼检测于一体的高效核酸分析平台,并将其应用于对虾传染性皮下组织及造血器官坏死病病毒（IHHNV）的检测。为了尽可能简化核酸检测的流程,提高检测效率,本论文分别从提取、扩增、检测的三个环节进行了相应的优化。首先,论文中引入了碱裂解法用以快速获取核酸样本,将繁琐的核酸提纯环节缩短到仅需3 min即可完成;其次,引入了快速PCR体系,通过对“平衡范例方程”的理解和探索,将传统的三温区PCR循环简化为动态双温区进行,成功地将本需要2 h的PCR扩增环节缩短到10 min以内;接着,引入了分子信标技术,通过对其结构的研究,设计了具有较高特异性的探针体系,实现了在常温下对靶标核酸的肉眼荧光可视化结果判读。此外,通过改变分子信标末端的荧光标记,实现了在同一反应管内对两种不同靶标核酸的高灵敏度双重检测。该分析平台具有较高的特异性和灵敏度,可以充分用于虾苗的IHHNV感染情况的初筛和周期性复检,其低成本、易操作的特性也十分适宜现场检测的应用,该病毒在对虾养殖产业中危害巨大,连年造成不小的经济损失。基于该分析平台的方法可以实现在15 min内对虾苗样本中的IHHNV靶标进行快速可视化分析,检测限达到每反应1000拷贝。与现行国标方案相比,将检测时间从3 h缩短到仅需15 min,并且减少了对大型仪器设备的需求,大大提高了检测效率和实用性。（2）论文建立了集防止核酸污染、恒温扩增、荧光可视化终点检测为一体的分析平台,并将其应用于对柑橘黄龙病病菌的快速检测。论文中引入了基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术通过对CRISPR/Cas系统的探索,验证了Cas12a效应蛋白尚未被报道的新PAM序列“UUUN”。基于此新PAM序列,论文中进一步引入了利用尿嘧啶糖基化酶（UracilDNA Glycosylase,UDG）体系来实现防止核酸扩增子气溶胶污染的方案,解决了核酸检测领域的这一痛点。此外,用更为便携和快捷的环介导等温核酸扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）代替国标采用的PCR方法,可以进一步缩短整个检测流程的时间并减少对复杂温控仪器的需求。利用CRISPR/Cas体系的高特异性,当特殊设计的cr RNA与靶标黄龙病病菌的核酸配对后会与Cas12a效应蛋白形成复合体,从而激活该蛋白的旁路切割活性,使得体系中带有荧光标记的单链寡核苷酸探针被切割降解,进而导致荧光信号的释放,实现荧光可视化的高灵敏度检测。该分析平台可以实现对柑橘养殖产业影响颇大的的柑橘黄龙病的致病菌——黄龙病病菌（Cirtus huanglongbing,HLB）每反应10拷贝的高灵敏度检测,其检测限相较传统的嵌入式染料方法提高了约100倍。（3）论文建立了针对组分复杂样本的免核酸提纯分析方案,并结合玻璃化手段为热敏感的酶类试剂提供了一种更方便的储藏思路。为了进一步提高核酸检测技术的实际使用性能,并提高酶类试剂的储藏稳定性,论文以近些年在全球范围内疯狂肆虐的非洲猪瘟疫情的病原菌非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）为应用对象,建立了基于玻璃化CRISPR体系及免样本提取的荧光可视化核酸分析平台。基于对CRISPR体系在灵敏度和特异性方面的探索和相关研究结果,论文中进一步尝试省略样本提纯的繁琐步骤,对全血样本不进行任何预处理直接对其中的核酸靶标进行检测。通过对三种常用的具有链置换功能的Bst DNA聚合酶的实验探究,筛选出了最适宜的酶种,用以对未经处理的原始全血样本进行直接扩增,并进行后续的可视化检测。此外,为了更好地将LAMP扩增体系与热敏感的CRISPR体系兼容于同一反应管中,并提高酶类试剂的储藏稳定性,论文探索了以普鲁兰糖和海藻糖作为保护剂,通过玻璃化的方法,将液态的CRISPR试剂脱水成膜的手段来实现其较长时间的稳定储存。基于该方法,经过老化加速试验的测试,原本需要低温储存环境的CRISPR体系可以在室温下稳定储藏180天。该方案可以很好地解决此类热敏感的酶类试剂对于储存环境的超低温要求,并且可以大大节省其远距离冷链运输的成本。该平台可以实现对家猪全血样本中的非洲猪瘟病毒每反应100拷贝级别的检测灵敏度,并且整个检测过程都可以在便携的装置上完成,实现“从样本到结果”的直观输出。
黄韬[2]（2020）在《CMIA对HBsAg弱反应性血清标本的检测性能》文中进行了进一步梳理背景:乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）是临床工作中应用最为广泛的判断乙型肝炎病毒（HBV）感染的血清学标志物之一,也是世界卫生组织推荐的诊断HBV感染的核心指标。目前较为主流的HBsAg的检测方法为化学发光免疫分析法（CLIA）和酶联免疫吸附测定法（ELISA）。化学发光微粒子免疫分析法（CMIA）是CLIA的一种。CLIA由于具有检测灵活、自动化程度高和更易实现检验过程的标准化等优势,在临床上的普及率越来越高。近年来,已有一些研究对CLIA和ELISA技术在检测HBV血清学标志物方面的性能进行了比较,但是很少有研究探讨CLIA和ELISA技术检测出的HBsAg弱反应性结果的可靠性。目的:评价CMIA对HBsAg弱反应性血清标本的检测性能。方法:检索南昌大学第一附属医院检验信息系统中的数据,回顾分析CMIA和ELISA对门诊就诊患者血清HBsAg检测的阳性率,初步了解这两种方法检测HBsAg的敏感性差异。在此基础上分别收集临床常规检验中CMIA和ELISA检测结果为HBsAg弱反应性的血清标本,分别采用ELISA和CMIA进行平行检测,评估CMIA与ELISA对HBsAg弱反应性标本的检测结果差异。同时,对上述所有HBsAg检测结果为弱反应性的标本通过中和确认试验对检测结果进行确认,以评价CMIA检出的弱反应性结果的可靠性。在明确检测结果可靠性的基础上,进一步选择HBsAg弱反应性的临床血清标本,根据EP-15A2文件,评价CMIA检测HBsAg弱反应血清标本的精密度。结果:1、本研究共纳入2018年7月至2018年10月期间的55737份临床就诊患者HBsAg的检测结果,结果显示CMIA对门诊就诊人群HBsAg的阳性检出率显着高于ELISA（21.00%vs18.41%,P=0.032）。2、本研究纳入了183例CMIA检测结果为HBsAg弱反应性（0.050.5IU/mL）的血清标本,对这些标本采用ELISA方法进行平行检测,结果显示,ELISA检出的阳性标本仅为88例（48.09%）。以特异性抗体中和确认试验作为金标准对此183例血清标本进行的确认检测结果显示,其中168例为HBsAg确认阳性。统计结果显示CMIA检测弱反应性HBsAg标本的阳性预测值为91.80%;ELISA检测弱反应性HBsAg标本的敏感性为52.38%,但阳性预测值达100%。3、本研究纳入了50例ELISA检测结果为HBsAg弱反应性（S/CO:1-4）的血清标本,对这些标本采用CMIA检测系统进行平行检测。CMIA的检测结果显示其中47例为有反应性标本。特异性抗体中和确认试验的结果显示,CMIA和ELSA检测结果不一致的3例标本HBsAg均为阴性。4、对于所有CMIA检测HBsAg结果为有反应性的标本进行分段分析的结果显示,CMIA检测值≥0.16 IU/mL的标本,中和确认试验100%为阳性。5、精密度检测结果显示,CMIA检测弱反应性血清标本的重复性变异系数和中间精密度变异系数分别为5.06%和5.56%。结论:与传统的ELISA技术比较,CMIA检测HBsAg弱反应性血清标本不仅具有更高的敏感性,同时也具有很好的可靠性和精密度。对于CMIA检测值≥0.16IU/mL的标本,中和确认试验100%为阳性。
彭金鑫[3]（2020）在《CFB基因及其功能多态位点R32W在乙型肝炎病毒感染中的作用》文中提出研究背景:乙型肝炎病毒（HBV）感染呈现全球性,它是导致急/慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌（HCC）的主要原因之一。慢性乙型病毒性肝炎（CHB）由于感染人数众多,已经成为了全球卫生健康安全问题之一。所以研究CHB的发病机制以及HBV感染与机体免疫之间的关系对于治疗CHB有重要意义。补体B因子（CFB）是补体系统中旁路途径的一个重要分子,补体系统在人体抵抗病原微生物的过程中起到了重要的作用。目前关于HBV感染与免疫之间关系的研究主要集中于适应性免疫,而对于固有免疫尤其是补体系统与HBV感染之间的相互关系尚不清楚。因此研究CFB在HBV感染中的作用,对于进一步完善HBV感染与机体免疫系统之间的相互关系有重要意义。前期我们通过全基因组关联研究,发现CFB基因上的一个位于编码区的单核苷酸多态性位点（SNP）rs12614（R32W,CFB基因第32位密码子由精氨酸转变为色氨酸）与CHB发病风险相关,但是CFB R32W在HBV感染中的具体作用机制尚不清楚。研究的目的:本研究拟探讨CFB基因及其功能多态位点R32W在HBV感染中的作用机制,从而进一步解释CFB R32W与CHB之间的关系。研究方法和内容:（1）在HepG2以及Huh7细胞中,转染HBV1.3质粒,用逆转录-定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和酶联免疫吸附实验（ELISA）,分析HBV对CFB基因是否有抑制作用。（2）在HepG2以及Huh7细胞中,转染不同组分的HBV质粒（HBp、HBc、HBx和HBs）,用RT-qPCR和ELISA,分析HBV不同组分蛋白对CFB基因是否有抑制作用。（3）在HepG2.2.15细胞中,通过质粒转染或慢病毒感染,过表达或者敲低CFB基因的表达,用电化学发光免疫分析法（ECLIA）检测细胞上清中的HBeAg和HBsAg,qPCR的方法检测细胞上清中HBV DNA的水平。验证CFB是否能抑制HBV复制。（4）在HepG2和293T细胞中,转染CFB32R和CFB32W的质粒,用RT-qPCR以及ELISA,分析不同细胞中CFB32R和CFB32W表达量是否有差异。（5）在HepG2.2.15细胞中,转染CFB32R和CFB32W的质粒,用RT-qPCR以及ELISA,分析在HBV感染状态下CFB32R和CFB32W的表达量是否有差异;用ECLIA和qPCR来检测HBeAg、HBsAg以及HBV DNA水平,分析CFB32R和CFB32W抑制HBV复制是否存在差异性。研究结果:（1）HBV通过抑制内源性CFB基因的转录,进而降低CFB蛋白水平。（2）HBs蛋白显着抑制细胞内源性CFB基因的表达。（3）CFB抑制HBV复制,主要体现在减少HBeAg和HBsAg的分泌水平及抑制HBV DNA的复制。（4）CFB32W的表达量高于CFB32R。（5）CFB32W抑制HBV复制能力弱于CFB32R,主要体现于CFB32W抑制HBV DNA复制的能力弱于CFB32R。结论:HBV有抑制CFB表达的作用,同时CFB可以抑制HBV复制。CFB32W的表达量高于CFB32R,但是CFB32W抑制HBV复制的能力弱于CFB32R。
杨娜娜[4]（2020）在《核酸检测技术在基层血站的应用与质量控制探讨》文中指出研究背景为减少经输血传播疾病事件的发生,世界各国采供血机构都对献血者血样进行了严格的病毒检测。研究发现血清学酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测技术作为血液筛查的基本方法仍有不足,存在漏检风险,越来越多的国家在此种方法的检测基础之上补充核酸扩增技术（Nucleic acid amplification testing,NAT）,以保证血液制品安全。与血清学检测相比,NAT检测的特点是灵敏度高,对检测标本的质量控制要求高,容易受到污染、对实验室环境、人员操作和设施要求严格以及检测成本高等。因此,加强实验室质量监控尤为重要。研究目的了解国家卫生部于2015年将核酸检测技术正式纳入《血站技术操作规程》后,在基层血站应用与质量监控的情况,探讨核酸检测技术在血液筛查中的作用以及实现NAT实验室质量监控量化的措施。研究方法1.××市中心血站2013年1月1日至2018年12月31日期间采集了163782份无偿献血者血液标本,采用速率法、双试剂酶联免疫方法对血样进行丙氨酸氨基转移酶（ALT）、乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）、丙型肝炎抗体（HCV-Ab）、艾滋病抗体（HIV-Ab）、梅毒螺旋体抗体（TP-Ab）筛查;2016年1月1日-2018年12月31日期间对双试剂ELISA检测结果阴性的献血者标本77721份,利用上海浩源或美国罗氏检测系统,分别采用8人份、6人份血液样本汇集的方法,经血液样本混合、核酸提取、病毒核酸扩增及检测三个阶段进行NAT混样检测,混检阴性的视为阴性结果,混检阳性的进行拆分检测,并以拆分结果为最终结果,每批检测均设一个阴性对照、一个阳性对照和一个室内质控品。本课题收集上述检测资料,应用SPSS软件中的卡方（χ2）检验方法,比较国产、进口两种核酸检测系统NAT阳性率、阳性拆分率以及不同年份NAT阳性率的差异。统计分析核酸混检阳性率、有效拆分率、结果无效率等相关质量指标。2.采用拟定的《××市中心血站血液筛查实验室质量控制管理调查表》,通过听取介绍、现场查看实验室设备和实施以及相关档案记录资料、口头询问的方式,对血站血液筛查实验室质量控制情况进行调查,发现存在的问题。研究结果1.××市中心血站2013年1月1日至2018年12月31日期间采集的163782份无偿献血者血液标本中,有5269份ALT阳性,阳性率为3.22%;ELISA双试剂检测HIV-Ab阳性数255,阳性率为0.16%,TP-Ab阳性数829,阳性率为0.51%,HCV-Ab阳性数373,阳性率为0.23%,HBs Ag阳性数1199,阳性率为0.73%。从2013年到2018年间,ALT、HIV-Ab、TP、HCV-Ab、HBs Ag阳性率总体呈现降低趋势。2016年NAT实验开展后三年ALT、HIV-Ab、TP-Ab、HCV-Ab、HBs Ag这五项检测项目阳性率均低于NAT实验开展前三年,经χ2检验差异有统计学意义（χ2值分别为296.512、47.014、25.218、77.564、41.098,P<0.05）。提示开展核酸检测项目后,血液初筛检测更加规范严格,有助于减少对不合格血液检测的资源消耗。2.该血站2016年1月-2018年12月采用上海浩源和美国罗氏两种检测系统对77721份标本进行HBV-DNA、HIV-RNA、HCV-RNA检测,共检出112份阳性标本,其中上海浩源检测系统NAT检测阳性标本62份,NAT阳性率为0.17%（62/36563）,美国罗氏检测系统NAT检测阳性标本50份,NAT阳性率为0.12%（50/41158）,经χ2检验,两种检测系统的NAT阳性率差别没有统计学意义（χ2=3.111,P>0.05）。上海浩源检测系统三年间的NAT阳性率经χ2检验,差别有统计学意义（χ2=7.889,P<0.05）;美国罗氏检测系统三年间的NAT阳性率经χ2检验,差别无统计学意义（χ2=1.226,P>0.05）。结果提示上海浩源和美国罗氏两种检测系统对HBV-DNA、HIV-RNA、HCV-RNA的检测结果不存在差异,美国罗氏检测系统的检测结果较上海浩源检测系统稳定。3.该血站2016年1月-2018年12月两种检测系统三年间混检阳性率差异经χ2检验均无统计学意义（χ2值分别为1.741、2.862,P>0.05）,上海浩源检测系统的混检阳性率1.93%（107/5556）高于美国罗氏检测系统的混检阳性率0.85%（68/7961）,经χ2检验,差异有统计学意义（χ2=24.409,P<0.05）;美国罗氏检测系统的有效拆分率73.53%（50/68）高于上海浩源检测系统的有效拆分率57.01%（61/107）,经χ2检验,差异有统计学意义（χ2=4.892,P<0.05）;上海浩源检测系统结果无效率为0.14%,三年间上海浩源检测系统结果无效率的差异无统计学意义（χ2=0.032,P>0.05）,导致无效结果的原因为血液核酸筛查内参（Internal Control,IC）无效;美国罗氏检测系统结果无效率为0.19%,经排查导致无效结果的原因是该批次康彻斯坦质控血清存在问题,更换质控血清后核酸检测结果无效池数为0,结果无效率为0.00%。上述结果提示两种检测系统的NAT检测结果均较为稳定,罗氏检测系统有效拆分能力较浩源检测系统强,无效结果的发生是随机性的,需要保持对核酸无效结果的密切监测,使检测系统、检测流程稳定、可靠运行。4.××市中心血站血液筛查实验室质量控制管理情况调查分析显示,该血站制定了较为完善的核酸实验室操作规程以及实验室质量管理体系并依此运行,存在的主要问题是未选取适合本实验室质量监控指标进行NAT过程的量化质量监控和趋势分析。结论核酸扩增技术灵敏度高,作为对ELISA检测病毒阴性血样的补充检测,可进一步提高血液质量,降低输血传播疾病的发生率;NAT检测技术应用于献血员血样筛查后,提高了血样初筛过程的严谨性,减少了核酸检测前筛查实验的工作量与血液检测资源的消耗。国产与进口两种检测系统的NAT检测结果没有差异,进口检测系统更加稳定一些。建议选取适合于本实验室质量监控指标,建立NAT过程的量化质量监控和趋势分析体系并付诸实施,将有利于血液制品更高安全性的保证。
袁志凤[5]（2019）在《日照市无偿献血人群中隐匿性乙肝感染状况的统计分析及研究》文中提出目的通过筛查日照市无偿献血者的血液,计算隐匿性乙肝（Occult hepatitis B virus infection,OBI）的阳性率,初步分析OBI在日照市无偿献血人群中的流行状况。探讨OBI可能的发生原因、转化生长因子β1（Transforming growth factorβ1,TGF-β1）在OBI感染发生中的作用,评估输血传播OBI的残余风险,为更好的制定政策,改进血液筛查策略,为临床提供安全血液和血液制品提供思路。方法（1）血液常规检测:收集我站2014年至2018年的无偿献血者样本117395例,酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清中的乙肝表面抗原（HBsAg）、丙肝抗体（HCV Ab）、人类免疫缺陷病毒抗原抗体（HIV Ag/Ab）、梅毒螺旋体抗体（TP）含量,统计血清中HBsAg、HCV Ab、HIV Ag/Ab、TP的阳性率,分析本地区献血人群中经输血传播病毒的流行状况。（2）核酸检测技术（Nucleic acid amplification test,NAT）对血液样本中HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA检测:本实验室应用上海浩源和广州中山达安两个厂家的核酸检测系统,对常规筛查合格的92110例样本进行NAT8人份混检,统计HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA阳性率,分析无偿献血人群中OBI的阳性率。探讨OBI在本地区无偿献血人群中的流行状况。（3）对HBsAg合格HBV DNA不合格的样本进行“两对半”检测:核酸检测工作开展以来本实验室共检出HBsAg阴性HBV DNA阳性的样本31例,对这部分样本进行检测乙肝“两对半”,统计分析样本中核心抗体的阳性率,探讨核心抗体与OBI的相关性。（4）聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction,PCR）定量检测:HBV DNA阳性的样本进行定量检测,分析其病毒载量水平。（5）应用ELISA法分别检测健康对照组30例、HBV组30例、OBI组30例样本的血清中TGF-β1表达情况,分析其与OBI的相关性。结果（1）117395例样本中,实验室检测不合格样本共2183例,总不合格率为1.86%,各年份之间的不合格率总体呈逐年下降趋势,有明显统计学差异（?2=709.00,P<0.05）。其中HBsAg不合格样本249例,不合格率为0.21%,各年份之间的不合格率有统计学差异（?2=61.95,P<0.05）。（2）对性别、年龄以及各地区之间做了统计分析,其中性别之间无统计学差异（P>0.05）;HBsAg不合格率在各个年龄段之间的比例分别为:40.2%、23.3%、24.9%、11.6%,其中18-25岁之间的不合格率最高为40.2%;各区县之间比较结果分别为:38.2%、14.5%、26.1%、21.3%,以莒县地区不合格率最高为38.2%。（3）92110例样本中检出HBV DNA有反应性样本31例,阳性率为0.034%;HCV RNA未检出有反应性样本;检出HIV RNA有反应性样本1例,阳性率为0.001%。（4）HBV DNA样本病毒载量很低,结果<20IU/ml的样本占70%以上。（5）OBI组血清TGF-β1水平较健康对照组增高,差异有统计学意义（P<0.05）,OBI组血清TGF-β1水平与HBV组比较无统计学差异（P>0.05）。结论（1）本地区无偿献血人群中OBI的检出率为0.034%。（2）核酸检测应用于血液筛查能缩短病毒检测的“窗口期”,特别对于OBI的检出有重要意义,能降低输血传播乙肝病毒的风险,核酸检测与酶免检测互为补充不能替代。（3）新的血液筛查模式电化学发光法加核酸检测应用于血液筛查具有可行性。（4）血清中免疫因子TGF-β1在OBI的持续感染过程中发挥重要作用。
夏舒[6]（2019）在《基于RPA和ECL的生物气溶胶核酸检测方法研究》文中研究说明气溶胶态病原体主要包括病毒和细菌（生物气溶胶）,由于气溶胶粒径小常悬浮于空气中,因此,生物气溶胶病原体容易造成呼吸道传染性疾病的大规模爆发。生物气溶胶采样对传染性疾病的防控尤为重要,目前传统的生物气溶胶采样方法主要有自然沉降法、冲击法、撞击法、采样膜法等。采样膜法由于采样效率高,常被用于空气采样。FTA卡（Flinders Technology Associates）适用血液、口腔拭子、上皮细胞、细菌、病毒和培养细胞等多种样品的保藏,可与核酸结合,维持样品中DNA的完整性。目前尚未见利用FTA卡进行生物气溶胶病原体采集的报道。生物气溶胶病原体常用检测方法主要包括细胞培养菌落计数法、免疫检测法和核酸检测法。细胞培养菌落计数法需依靠人工操作,耗时费力,细胞培养超过24 h,不能实现自动化快速检测。免疫检测法对样本的处理相对较为简便,但是复杂样本的检测,存在交叉污染等问题。近年来,核酸分子检测技术在临床医疗、疾病防控等领域发挥越来越重要的作用,如聚合酶链式反应（PCR）、荧光原位杂交技术（FISH）、基因测序技术等。但传统PCR方法由于需依靠精密的仪器以精确控制温度的变化,并且由专业技术人员操作分析,很大程度上限制其在条件有限的现场检测领域的应用。近年来我国出现各种空气传播传染病爆发（如SARS、H1N1、H7N9）,给传染性疾病的预防工作带来了前所未有的挑战,为有效预防传染性疾病的爆发,开展针对生物气溶胶病原体快速检测的研究意义重大。本研究拟构建以FTA卡进行生物气溶胶病原体采样方法,实现气溶胶病原体采样与核酸提取一体化操作。结合重组聚合酶扩增和纸基电化学发光（RPA-ECL）检测技术,初步建立一种特异灵敏、操作简便的生物气溶胶病原体检测方法。通过检测临床HBV血清样本进行验证,并与实时荧光定量PCR法比较。主要实验结果如下:1.FTA卡在初始负压40 kPa、空气湿度98%RH和26℃条件下可以持续采样8 min,采样最大单位截留量为0.96 mg/cm2。FTA卡可用于气溶胶HBV质粒的采集,采集效果可通过RPA+凝胶电泳紫外成像法进行半定量分析。2.三联吡啶钌标记引物标记率达到74.62%,为后续钌标引物的制备提供技术基础。3.RPA扩增HBV质粒的优化反应条件为:0.8μmol/L引物,280 mmol/L醋酸镁,30℃下扩增20 min。4.RPA-ECL方法的灵敏度及线性检测范围实验结果表明,电化学发光响应强度在0.12—1200 ng/mL HBV质粒样品浓度之间呈现良好的线性关系;检出限为1.2 pg/mL（S/N>3）;检测的相对标准偏差分别为5.18%和6.40%。提示RPA-ECL法对HBV基因检测具有良好的重复性、灵敏度和较宽的线性范围。5.FTA-RPA-ECL方法对临床HBV血清样本检测分析,结果表明电化学发光响应强度在20—2×105 IU/mL浓度之间呈现良好的线性关系,检出限为0.2 IU/mL（S/N>3）;相对标准偏差分别为1.94%、2.03%和2.32%。检测结果与实时荧光定量PCR结果相对偏差范围在-8%—12%之间。提示FTA-RPA-ECL方法对临床HBV血清样本的检测具有较高的准确度和重复性。总之,利用FTA卡进行空气气溶胶病原体采样,可实现采样与核酸提取一体化操作,简化整体检测过程。基于RPA和纸基ECL的核酸检测技术具有特异、简便、灵敏及快速等特点。因此,本研究构建的基于FTA卡的生物气溶胶采样方法,结合RPA和纸基电化学发光（ECL）技术,有望为生物气溶胶中病毒的快速和实时现场检测技术研发提供新途径。
陈锦元[7]（2017）在《工具酶辅助信号放大的DNA电化学传感器》文中进行了进一步梳理基因检测在疾病早期诊断、预后评估及药物治疗指导等方面具有重要意义,因而在临床医学方面具有举足轻重的地位。为了提高临床医疗效率和降低医疗成本,使医学服务于广大人民群众,未来的基因检测将朝着床边诊断系统发展。DNA电化学传感器具有易于微型化、快速、高通量、高灵敏度、高特异性和价格低廉等优点,因而具有广阔的临床应用前景。为了实现实际样品中核酸的痕量分析,通过信号放大途径提高灵敏度尤为重要。基于分子生物学中工具酶的高催化能力、高生物相容性、高特异性和高灵活性等特征,本论文利用工具酶通过引入多个信号分子或使目标链放大等方式构建简单、超灵敏的DNA电化学传感器,实现了对复杂实际样品的检测,为DNA电化学传感器广泛应用于临床奠定扎实的基础,本论文主要研究工作如下:（1）在第一部分中,利用末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxyribonucleotide transferase,TdT）在恒温条件下无需模板即可催化多个脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）聚合到DNA分子的3’羟基末端的特点,构建了植入模式（grafting-to mode）的DNA电化学传感器。与传统的TdT介导的基于界面起始聚合（surface-initiated enzymatic polymerization,SIEP）模式的电化学传感器不同,本实验采用先均相延伸后固相杂交的方法引入多个信号分子。实验结果表明,SIEP模式所存在的高背景问题是由于TdT在界面作用时所产生,而并非是由探针的非特异性吸附所引起。然而,植入模式可以避免高背景的产生,使用较高的酶量即可快速的完成反应,所需反应时间从120 min降至20 min。通过对检测性能多方面的比较,植入模式在背景、时间、电流值等方面均显着优于SIEP模式。（2）在第二部分中,基于连接酶链式反应（ligation chain reaction,LCR）提出了一种简便、实用的双链组装型DNA电化学传感器。通过均相LCR扩增得到大量两端分别修饰有巯基和生物素的短双链DNA（dsDNA）片段,具有刚性结构的dsDNA通过金-硫键均匀的分布在牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）组装界面上,而末端生物素通过与链霉亲和素的特异性结合将HRP固定到金电极表面,最后通过辣根过氧化物酶（horeseradish peroxidase,HRP）催化TMB-H2O2底物进行电化学检测。结果表明,在目标DNA浓度为1.0×10-161.0×10-1111 M时,安培电流与和浓度对数值呈良好的线性关系,检测限为5.0×10-19M（50μL的反应体系里含有15个目标DNA分子）。此外,该方法能够显着区分其他三种碱基所引起的单碱基错配,可用于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）的分析。在实际样品应用中,该方法可直接从血清总核酸提取物（DNA/RNA）里的大量基因组和长短不一的RNA中检测出不同含量的C型乙型肝炎病毒（HBV）基因组,而对于B型样品和正常样品则没有响应,显示出很好的检测效果,且与基因测序和凝胶电泳结果相符。更为重要的是,通过改变引物序列可以检测不同的目标DNA序列,因此本方法具有通用性,有望用于临床各种疾病相关DNA标志物的定性定量分析。（3）本文第三部分在第二部分的基础上提出亲和素标记的多聚辣根过氧化物酶（SA-PolyHRP）与LCR双重信号放大用于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）PML/RARα融合基因检测的电化学生物传感器,即将均匀分布在电极表面的经LCR扩增的每条短双链DNA末端结合多个HRP从而实现后放大（post-amplification）。选择酶联免疫分析中以不同方式引入多个HRP的链霉亲和素-酶标生物素复合物和链霉亲和素包被的HRP聚合物这两种酶复合物进行实验,结果表明链霉亲和素包被的HRP聚合物由于其外部的链霉亲和素层更易与电极表面的生物素结合而产生有效信号放大。针对固定局限在融合位点附近PML/RARα融合基因所设计的探针,本实验在引入SA-PolyHRP之后保证了灵敏度,可检测低至15个拷贝的目标DNA分子,在1.0×10-16 M到1.0×10-13 M浓度范围内,安培电流与浓度的对数值呈线性关系,与传统的SA-HRP相比,其在灵敏度上提高近2个数量级。此外,在引入SA-PolyHRP之后,本方法同样具有较高的特异性,能够显着区分其他三种碱基所引起的单碱基错配,而且本实验所设计的PML/RARα融合基因探针区分单碱基错配的能力更加显着。
刘超[8]（2017）在《双区段检测提高乙型肝炎病毒核酸检测性能的研究》文中研究指明乙型肝炎病毒（HepatitisB virus,HBV）是一种严重危害人类健康的DNA病毒。HBV DNA定量检测在乙肝治疗过程中发挥重要作用,是抗病毒治疗效果监测重要指标。目前用于HBVDNA定量试剂多采用的是单引物/探针的设计方法,但是HBV病毒具有较高的突变率和耐药突变,如果标本引物/探针结合区发生错配,可导致HBVDNA定量值低于实际值,甚至出现假阴性。本文基于HBVDNA基因组保守区,设计了一种新的双引物/双探针的策略,建立了一种双重荧光HBVDNA定量PCR方法。方法包括引物探针的设计与筛选、体系的建立和优化。并对建立的检测体系进行了方法学评价,包括线性范围、最低检出限（the limit of detection,LOD）,特异性等。为验证其临床实用性,我们将新的定量方法的定量值分别与商品化试剂COBAS TaqManHBVTest,version2以及达安定量试剂进行比较和一致性分析。对其中定量值差别10倍以上的标本,进行测序和质粒验证。结果显示:本研究建立的双引物/双探针的HBVDNA定量方法具有良好的检测性能。与商品化COBAS TaqMan HBV Test version 2以及达安定量试剂定量值具有良好的一致性。两种试剂均存在与本研究建立方法定量值差10倍以上标本,测序结果发现在COBAS TaqMan HBV Test version 2试剂反向引物nt1962和1963位置存在突变位点。用包含这些突变序列的质粒进行定量验证,COBAS TaqManHBVTest version 2试剂对质粒定量值存在偏低的情况。方法中S区和C区定量值具有良好的一致性（R2=0.9657）,但有5例样本存在C区定量值低于S区10倍以上的情况,测序结果发现这部分标本在引物结合区存在突变。本研究建立的双引物/双探针的HBVDNA定量方法,可降低因单引物/单探针与标本序列错配导致定量值偏低的风险,为临床对HBV的诊断、治疗、预后提供准确依据。HBV核酸检测是血液核酸筛查（nucleotide acid test,NAT）重要组成部分,在防止HBV经输血传播,保障输血安全中发挥重要作用。HBV是高度变异的病毒,单区段的HBV核酸筛查可能存在漏检风险,威胁输血安全。本研究中,建立了一套基于HBV保守的S和C区的HBV核酸检测方法。对其进行了最低检出限和特异性等方法学评价。用自建方法对两种血筛试剂:浩源和Cobas TaqScreen MPX Test,version 2检测阴阳性不一致的标本进行检测,并对标本进行HBV DNA定量检测。结果显示:自建方法具有良好的方法学检测性能。浩源和Cobas TaqScreen MPX Test,version 2血筛试剂检测不一致标本中,8例标本HBV DNA定量浓度高于其LOD发生漏检,间接证明HBV核酸血液筛查中,单区段检测存在漏检风险,双区段检测可有助于降低漏检风险,保障输血安全。
何雨[9]（2016）在《广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究》文中提出研究背景:HBV属于嗜肝病毒科,是一种长3.2kb的DNA病毒,其为有包膜的环状不完全双链DNA。HBV是已知可感染人体的最小的双链DNA病毒,但其复制效率最高。它包含4个部分重叠的开放读码框（ORF）,pre S1/S2/S,pre C/C,P和X。由于HBV聚合酶缺乏校准功能,导致HBV有很强的序列异质性。核苷酸异质性大于8%是HBV分型的原则,按照此原则HBV可以被分为8个基因型:A-H,新发现的基因型I和J还存在争议（未被NCBI在线基因分型工具收录）。急慢性肝炎,肝硬化和肝癌的发生都与HBV感染紧密相关,严重影响人类健康。HBV是人体中最常见的病原体,全球有20亿人既往感染或现症感染。其中2千5百万人有慢性乙肝。超过75%的乙肝病人生活在西太平洋和东南亚。中国是HBV感染高发区,有1千2百万乙肝病人,其中大约有15%-40%发展成HBV相关肝硬化和肝癌。每年有大约60万人死于此类疾病。HBV在中国的分布:北方地区以C型为主,中南地区以B型为主,西南地区B型和C型均等,C/D重组基因型主要分布在西北地区,C2和B2是最多见的亚型。在我国农村,恶性肿瘤中胃癌死亡率最高,其次是肝癌;在城市,肝癌死亡率仅次于肺癌和胃癌死亡率,居第三位,因此其病原生物学、发病机制及预防和治疗是研究的重点内容。广西扶绥地区的肝癌发病率和死亡率均超过50/10万,远高于全国平均水平27/10万。而广西桂林地区肝癌发病率约为29/10万,与全国水平接近。本课题组既往研究发现HBV感染、黄曲霉毒素的摄入和饮用水源污染等是广西扶绥县肝癌发生的主要三大环境危险因素,在黄曲霉毒素的摄入和饮用水污染得到控制后,扶绥县肝癌仍持续高发。目前HBV基因型、亚型以及变异成为其致癌作用研究的重点。为了了解扶绥地区HBV的生物学特征,现选取肝癌低发区桂林的HBV感染者和肝癌患者一同进行对照研究,预期从病毒学角度发现导致扶绥肝癌持续高发的根本原因。目的:（1）建立适用于多种HBV基因型的PCR反应体系并优化其反应条件,实现对广西壮族自治区内存在的各个基因型HBV全序列的高灵敏度扩增,并确保反应的特异性,为后续测序工作打下基础。（2）对扶绥地区和桂林地区感染HBV的肝癌和慢性肝炎患者及携带者,通过PCR产物直接测序的方法,获得其血清中HBV序列信息,再使用相应的生物信息学分析软件对PCR产物进行拼接,获得HBV全序列。并使用进化树的方法对全序列进行分型和确定亚型。研究肝癌组和非肝癌组病人HBV突变情况,确定HBV感染相关肝癌的独立危险因素。（3）对扶绥和桂林地区可能存在的特有基因型进行分析鉴定。方法:（1）通过文献检索和使用引物设计软件,找到适用于大多数HBV基因型的PCR引物,验证引物的特异性。同时比较一片段法和两片段法PCR在HBV全序列扩增中的效果差异,从而选择最优化的方法,确定PCR反应体系和反应条件,使用经荧光定量PCR准确测出HBV DNA含量的标本验证该PCR反应体系的检测灵敏度。（2）收集来自扶绥地区和桂林地区的肝癌和慢性乙肝患者及HBV携带者血清,使用两片段法结合半巢式PCR,扩增HBV全基因,使用相应的生物信息学分析软件对PCR产物进行拼接,获得HBV全序列。并使用NCBI的在线分型工具和分子进化树的方法对全序列进行分型并确定亚型。按照基因分型分别研究肝癌组和非肝癌组病人的HBV突变情况,使用SPSS进行比较分析,找出肝癌相关突变位点;使用多因素统计分析,确定独立危险因素,并确定这些突变位点用于肝癌诊断的灵敏度和特异性,并尝试进行联合诊断分析。（3）对基因分析得到的重组序列,使用NCBI的BLAST功能找到与重组序列相似的序列,查找文献原文,了解其分布情况。使用SIMPLOT确定重组位点,找出重组序列来源;分析其全序列与不同基因型标准序列的差异情况、以及S区氨基酸表达情况,确定重组基因型的分类。结果:（1）通过对30例临床标本的检测发现:两片段法的检测灵敏度远高于一片段法,HBV DNA定量大于1.45×103 IU/ml的标本均可以检出明显的产物条带。故在后续实验中确定使用两片段法进行PCR扩增。同时,将本实验用到的引物序列与HBV标准序列进行匹配验证,证明其具有很好的特异性和较强的结合能力。此外,半巢式PCR方法的使用,既提高了检测灵敏度,又避免了非特异性产物的出现。（2）本研究共收集来自扶绥和桂林地区的血清标本共339例,按照实验流程去除资料不全,HBV DNA含量过低及测序失败的病例后,共有187例研究对象测得HBV全基因序列。经NCBI基因分型工具鉴定分型,获得本地区HBV B型和C型的参考序列。扶绥地区的受试者中,C基因型占77.1%,B基因型占18.8%,重组基因型占4.2%。桂林地区的标本中C基因型占21.8%,B基因型占78.2%。两地HBV基因型分布存在显着差异。在全部受试者中,HBV B型有86例,其中B2占88.4%（75/86）,B4占11.6%（11/86）;HBV C型有93例,其中C1占69.9%（65/93）,C2占9.7%（9/93）,C5占20.4%（19/93）。扶绥地区以C1,C5亚型为主,B2,C2,B4次之。桂林地区以B2占绝对多数,C1,C5,B4,C2次之。多因素统计分析结果显示:男性,年龄大于50岁,HBV C基因型感染分别是HCC发病的独立危险因素。将全部研究对象按照基因型分组,分别研究肝癌组和非肝癌组的HBV全基因序列,将超过10%的研究对象出现突变的位点定义为突变热点。B型有147个突变热点,C型有249个突变热点,将这些突变位点分为肝癌组和非肝癌组进行研究和分析,B型中有20个位点有统计学差异,C型有17个位点有统计学差异。经过多因素统计分析,在C基因型中发现3组位点突变（T53C,A1762T/G1764A,G1775A）是肝癌发生的独立危险因素,三者联合诊断将有助于提高诊断效能。（3）本课题组发现编号为414,441,533,678的四例标本经NCBI基因分型工具确定为A,C,G重组基因型,在GENEBANK中找到与其相近的HBV全序列进行进化树分析,发现其不属于目前已有的分型;经查看参考文献,发现近年有文献报道类似的HBV全序列,有学者将其命名为基因型I,对本研究的标本进行全序列分析及S区氨基酸分析均支持将其分为新的基因型。时间树分析发现该新的基因型I分化年代约在1200年前。结论:（1）本课题组结合已有文献和引物设计工具,找到了一种能够对HBV全基因进行高保真PCR的方法,该实验方法能够保证检测的高灵敏度和高特异性,具有广泛的应用前景。（2）对来自扶绥和桂林的183例肝癌和非肝癌病人的血清标本的HBV全序列分析,我们研究发现了肝癌高低发区的HBV基因型和基因亚型分布存在显着差异;建立的B和C型参考序列为后续的研究提供了参考;发现的肝癌相关突变位点将为后续的肝癌早诊早治工作提供帮助。（3）经过多序列比对和生物进化分析,本研究发现的四例HBV重组基因型最终确定为基因型I,这是在广西扶绥首次报道该基因型的存在,这完善了该基因型分布的地域资料并为NCBI基因分型工具提供了补充。
李林臣,张懿晖,牛艳芬,李芙琴,谢桂芳[10]（2016）在《全自动化学发光分析仪及核酸扩增仪检测乙肝标志物的应用》文中研究说明目的:探讨全自动化学发光分析仪及核酸扩增仪检测乙肝标志物的临床应用。方法:选择2235例住院及门诊收治的肝功能异常病例,分别用化学发光方法检测乙肝病毒表面抗原（HBs Ag）,用实时荧光聚合酶链式反应（FQ-PCR）方法检测乙肝病毒基因（HBV-DNA）含量,并对结果进行分析。每位患者检测HBs Ag与HBV-DNA均采用同一份标本。结果:全部受检标本中,化学发光方法检测HBs Ag阳性率为61.34%,显着高于FQ-PCR方法检测阳性率（48.59%）,差异有统计学意义（x2=73.41,P<0.01）。将化学发光检测HBs Ag的结果分成强阳性、弱阳性和阴性3组,不同组间FQ-PCR检测HBV-DNA的阳性率显着不同,差异有统计学意义（x2=1863.60,P<0.01）,强阳性组HBV-DNA阳性率为97.31%,显着高于弱阳性组,差异有统计学意义（x2=966.90,P<0.01）。结论:全自动化学发光分析仪所采用的化学发光方法对筛查乙肝病毒感染效果较好,而扩增仪所采用的FQ-PCR方法对检测乙肝病毒复制及疗效的监测效果更好,二者联合检测可提高乙肝患者的检出率并可对乙肝患者的病情及疗效作出准确判断。
二、聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（论文提纲范文）
（1）荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题背景及意义 |
| 1.1.1 核酸检测技术在分子诊断方面的应用 |
| 1.1.2 农副产品中动植物病菌快速检测的重要性 |
| 1.1.3 本节小结 |
| 1.2 核酸扩增检测技术的原理和基本流程 |
| 1.2.1 核酸提取 |
| 1.2.2 核酸扩增 |
| 1.2.3 核酸扩增子检测 |
| 1.2.4 本节小结 |
| 1.3 新型核酸检测分析方法的研究进展 |
| 1.3.1 核酸气溶胶污染防止办法 |
| 1.3.2 快速PCR技术的应用 |
| 1.3.3 免扩增的核酸分析方法 |
| 1.3.4 新型探针技术的应用 |
| 1.3.5 基因编辑技术的应用 |
| 1.3.6 本节小结 |
| 1.4 核酸检测技术目前面临的问题 |
| 1.5 研究目的、内容和技术路线 |
| 1.5.1 研究目的和内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 基于分子信标和快速PCR的双重荧光可视化检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 对虾IHHNV病毒标准PCR检测方法建立 |
| 2.3.2 快速PCR体系循环时间参数探索 |
| 2.3.3 分子信标用于可视化检测条件探索 |
| 2.3.4 可视化检测平台灵敏度与特异性评估 |
| 2.3.5 可视化检测平台应用于双重检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于基因编辑技术的防污染核酸荧光可视化检测方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料和试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 针对柑橘黄龙病菌的LAMP扩增体系 |
| 3.3.2 Cas12a效应蛋白新PAM序列可行性分析 |
| 3.3.3 基于Cas12a效应蛋白的荧光可视化检测体系 |
| 3.3.4 基于UDG酶消解的防污染核酸检测体系 |
| 3.3.5 防污染荧光可视化核酸分析平台的搭建 |
| 3.3.6 防污染荧光可视化核酸分析平台灵敏度评估 |
| 3.3.7 防污染荧光可视化核酸分析平台用于柑橘黄龙病菌检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于玻璃化CRISPR及免样本提取的荧光可视化核酸分析方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 针对非洲猪瘟病毒的LAMP扩增体系 |
| 4.3.2 免样本提取的恒温核酸扩增体系 |
| 4.3.3 针对非洲猪瘟病毒的CRISPR/Cas12a检测体系 |
| 4.3.4 普鲁兰糖和海藻糖用于对CRISPR体系的保护 |
| 4.3.5 玻璃化的CRISPR薄膜加速老化试验 |
| 4.3.6 免样本提取可视化核酸分析平台搭建 |
| 4.3.7 免样本提取可视化核酸分析平台用于非洲猪瘟病毒检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 进一步研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（2）CMIA对HBsAg弱反应性血清标本的检测性能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 CMIA检测系统 |
| 2.2.2 ELISA检测系统 |
| 2.2.3 中和确认试验检测系统 |
| 2.2.4 质控品 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 临床常规HBsAg检测结果的回顾分析 |
| 2.3.2 HBsAg的 ELISA法检测 |
| 2.3.3 HBsAg的 CMIA法检测 |
| 2.3.4 HBsAg中和确认试验 |
| 2.4 ELISA、CMIA和中和确认试验结果的解读 |
| 2.4.1 ELISA结果的解读 |
| 2.4.2 CMIA结果的解读 |
| 2.4.3 中和确认试验结果的解读 |
| 2.5 精密度评价方法 |
| 2.6 统计分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 临床常规HBsAg检测结果的回顾性分析结果 |
| 3.2 CMIA检测为HBsAg弱反应性标本的ELISA法检测结果(表2) |
| 3.3 ELISA检测为HBsAg弱反应性标本的CMIA法检测结果 |
| 3.4 HBsAg弱反应性标本精密度分析结果 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
（3）CFB基因及其功能多态位点R32W在乙型肝炎病毒感染中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 HBV对内源性CFB基因表达的影响 |
| 第一节 实验材料与实验方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 主要试剂的配置 |
| 3. 实验方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 1. HBV抑制内源性CFB基因的表达 |
| 2. HBs蛋白抑制内源性CFB基因的表达 |
| 第三节 讨论 |
| 第二章 CFB对HBV复制的影响 |
| 第一节 实验材料与实验方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.主要试剂的配置 |
| 3.实验方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 1.CFB蛋白可抑制册V复制 |
| 第三节 讨论 |
| 第三章 CFB32R与CFB32W的表达量以及对HBV复制的影响 |
| 第一节 实验材料与实验方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.主要试剂的配置 |
| 3.实验方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 1.CFB32W的表达量髙于CFB32R |
| 2.CFB32W抑制HBV复制的能力弱于CFB32R |
| 第三节 讨论 |
| 全文总结 |
| 局限性和展望 |
| 中英文缩略词表 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）核酸检测技术在基层血站的应用与质量控制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 资料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 核酸检测技术应用于血液筛查的现状 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）日照市无偿献血人群中隐匿性乙肝感染状况的统计分析及研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象和样本采集与处理 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 样本采集与处理 |
| 2 研究的技术路线 |
| 3 主要试剂及仪器 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要仪器 |
| 4 常规血液筛查模式 |
| 4.1 血清中HBsAg ELISA实验原理及实验步骤 |
| 4.2 血清中Anti-HCV ELISA实验原理及实验步骤 |
| 4.3 血清中HIV-1-Ag/Ab ELISA实验原理及实验步骤 |
| 4.4 血清中TP抗体ELISA实验原理及实验步骤 |
| 4.5 ELISA血液筛查全自动化流程的建立 |
| 4.6 血清中ALT检测的实验原理及实验步骤 |
| 5 NAT技术对血液中HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA进行筛查 |
| 5.1 实验原理 |
| 5.2 实验方法及步骤 |
| 5.3 质量控制 |
| 6 PCR法定量检测HBV DNA |
| 6.1 实验原理 |
| 6.2 实验方法及步骤 |
| 7 电化学发光法检测乙肝“两对半” |
| 7.1 实验原理 |
| 7.2 实验方法及步骤 |
| 8 血清中TGF-β1 定量ELISA检测 |
| 8.1 实验原理 |
| 8.2 实验方法及步骤 |
| 9 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 常规血液筛查结果统计分析 |
| 1.1 血清中HBsAg、抗-HCV、HIV-1-Ag/Ab、TP、ALT检测结果统计分析 |
| 1.2 HBsAg阳性样本的统计分析 |
| 2 NAT检测技术对血液筛查结果分析 |
| 2.1 核酸检测HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA阳性率统计分析 |
| 2.2 两个厂家核酸检测系统比较分析 |
| 3 PCR定量检测HBV DNA以及血清学检测“两对半”结果分析 |
| 4 血清中TGF-β1 定量ELISA检测结果分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（6）基于RPA和ECL的生物气溶胶核酸检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 常见的空气气溶胶态病原体 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 细菌 |
| 1.2 气溶胶病原体采样方法研究进展 |
| 1.2.1 传统采样方法 |
| 1.2.2 新型采样技术 |
| 1.3 FTA技术原理及应用 |
| 1.4 空气气溶胶病原体检测方法 |
| 1.4.1 细胞培养菌落计数法 |
| 1.4.2 免疫检测法 |
| 1.4.3 分子核酸检测法 |
| 1.4.4 其它检测技术 |
| 1.4.5 空气病原体采样检测的难点 |
| 1.5 恒温扩增技术介绍及应用 |
| 1.5.1 环介导等温扩增技术 |
| 1.5.2 重组聚合酶扩增技术 |
| 1.6 电化学发光(ECL)原理及应用 |
| 1.6.1 湮灭式ECL |
| 1.6.2 共反应物式ECL |
| 1.7 本课题研究意义及技术路线 |
| 1.7.1 研究意义 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第二章 基于FTA卡的生物气溶胶采样系统构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 气溶胶采样系统构建 |
| 2.3.2 含HBV基因质粒的大肠杆菌培养、质粒提取及浓度测定 |
| 2.3.3 FTA卡采集气溶胶HBV质粒及样本洗脱 |
| 2.3.4 引物设计 |
| 2.3.5 FTA卡HBV质粒样本检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 气溶胶发生器相关特性表征 |
| 2.4.2 FTA卡采样效果评估 |
| 2.4.3 FTA卡HBV质粒检测结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于重组聚合酶扩增和纸基电化学发光的核酸检测方法 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 三联吡啶钌标记引物 |
| 3.3.2 重组聚合酶扩增反应参数优化 |
| 3.3.3 纸基电化学发光检测扩增核酸 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 三联吡啶钌标记引物及表征 |
| 3.4.2 重组聚合酶扩增反应相关条件优化结果 |
| 3.4.3 链霉亲和素磁珠对电化学发光检测的影响 |
| 3.4.4 纸基电化学发光响应特性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于FTA—RPA—ECL方法检测HBV血清样本 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 基于FTA-RPA-ECL方法检测HBV血清样本 |
| 4.3.2 基于实时荧光定量PCR方法检测HBV血清样本 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 纸基电化学发光响应特性 |
| 4.4.2 HBV血清样本检测结果分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、不足与展望 |
| 三、本论文的创新之处 |
| 四、本研究应用价值 |
| 参考文献 |
| 攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）工具酶辅助信号放大的DNA电化学传感器（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 基于末端脱氧核苷酸转移酶的DNA电化学传感器 |
| 1.1 仪器与试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 基于连接酶链式反应的DNA电化学传感器 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 基于Poly-HRP和连接酶链式反应双重信号放大的DNA电化学传感器 |
| 3.1 仪器与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）双区段检测提高乙型肝炎病毒核酸检测性能的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 双区段检测提升乙型肝炎病毒核酸定量检测性能的研究 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1. 实验材料和试剂配制 |
| 1.2. 方法 |
| 1.2.1. 建立室内HBV DNA工作标准 |
| 1.2.2. HBV基因组序列的比对及保守区分析 |
| 1.2.3. 扩增体系的建立 |
| 1.2.4. qPCR体系的建立和优化 |
| 1.2.5. 双重荧光HBV DNA定量方法评价 |
| 1.2.6. 标本基因分型检测 |
| 1.3. 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1. HBV DNA室内工作标准品的建立 |
| 2.2. HBV基因组序列的比对及保守区分析 |
| 2.3. 扩增体系的建立 |
| 2.4. qPCR体系的建立和优化 |
| 2.5. 双重荧光HBV DNA qPCR定量体系建立 |
| 2.6. 双重荧光HBV DNA qPCR定量体系方法学评价 |
| 2.7. 临床样本基因分型检测 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 单区段荧光PCR方法用于血液筛查的风险分析 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1. 实验材料和试剂配制 |
| 1.2. 方法 |
| 1.2.1 体系的建立 |
| 1.2.2 方法学评价 |
| 1.2.3 浩源和罗氏血筛试剂单阳性标本自建qPCR方法检测 |
| 1.2.4 浩源和罗氏血筛试剂单阳以及双阳标本乙肝病毒血清标志物检测 |
| 1.2.5 浩源和罗氏血筛试剂试剂单阳和双阳标本HBV DNA定量检测 |
| 1.2.6 双区段qPCR体系检测低浓度室内工作标准的线性关系以及S和C区Ct值相关性验证 |
| 2. 结果 |
| 2.1. 超速浓缩对自建qPCR方法影响 |
| 2.2. 方法学验证 |
| 2.3. 浩源和罗氏血筛试剂单阳性标本自建qPCR方法检测结果 |
| 2.4. 浩源和罗氏血筛试剂单阳和双阳标本血清标志物检测 |
| 2.5. 浩源和罗氏血筛试剂单阳性标本定量检测结果 |
| 2.6. 自建qPCR体系S和C区Ct值相关性分析 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文综述——乙型肝炎病毒核酸检测概述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1-1. 下载HBV基因组序列号 |
| 附录1-2. 室内工作标准HBV全长序列 |
| 附录1-3. 103例HBV阳性双重荧光HBV DNA qPCR定量体系和Cobas TaqMan HBVTest,version2定量值 |
| 附录1-4. 59例HBV阳性双重荧光HBV DNA qPCR定量体系和Daan HBV Test定量值 |
| 附录2-1. 浩源和罗氏血筛试剂检测HBV DNA单阳和双阳性标本的血清学检测结果 |
| 附录2-2. 浩源和罗氏血筛试剂检测HBV DNA单阳和双阳性标本的HBV DNA定量结果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究（论文提纲范文）
| 个人简历 中文摘要 英文摘要 前言 第一部分 |
| HBV全序列检测方法的建立 1. |
| 材料和方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 第二部分 |
| 广西肝癌高低发区HBV分布差异及不同基因型致癌突变位点的筛选 1. |
| 材料和方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 第三部分 |
| 广西扶绥HBV基因型Ⅰ的发现及其进化分析 1. |
| 材料和方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 全文总结及创新点 参考文献 附录 文献综述 参考文献 致谢 |
（10）全自动化学发光分析仪及核酸扩增仪检测乙肝标志物的应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 仪器与试剂 |
| 1.4 检测方法 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 两种方法检测结果比较 |
| 2.2 不同HBs Ag检测结果下HBV-DNA的检测结果分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结语 |
四、聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（论文参考文献）
- [1]荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究[D]. 钱程. 浙江大学, 2021(01)
- [2]CMIA对HBsAg弱反应性血清标本的检测性能[D]. 黄韬. 南昌大学, 2020(08)
- [3]CFB基因及其功能多态位点R32W在乙型肝炎病毒感染中的作用[D]. 彭金鑫. 南方医科大学, 2020(01)
- [4]核酸检测技术在基层血站的应用与质量控制探讨[D]. 杨娜娜. 东南大学, 2020(01)
- [5]日照市无偿献血人群中隐匿性乙肝感染状况的统计分析及研究[D]. 袁志凤. 青岛大学, 2019(03)
- [6]基于RPA和ECL的生物气溶胶核酸检测方法研究[D]. 夏舒. 华南理工大学, 2019(01)
- [7]工具酶辅助信号放大的DNA电化学传感器[D]. 陈锦元. 福建医科大学, 2017(04)
- [8]双区段检测提高乙型肝炎病毒核酸检测性能的研究[D]. 刘超. 北京协和医学院, 2017(11)
- [9]广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究[D]. 何雨. 广西医科大学, 2016(11)
- [10]全自动化学发光分析仪及核酸扩增仪检测乙肝标志物的应用[J]. 李林臣,张懿晖,牛艳芬,李芙琴,谢桂芳. 中国医学装备, 2016(04)