候美玲[1]2012年在《玉米内生细菌的分离鉴定及抗真菌活性物质的研究》文中研究说明玉米大斑病是重要的玉米叶部病害之一,引起该病的病原菌为玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica),严重发生时会极大地影响玉米的产量和品质。目前防治大斑病主要是利用抗病品种,并辅以适当的药剂防治。但由于抗病品种的单一大面积应用往往导致抗性迅速丧失,化学药剂使用又常常带来严重的负面影响。因此,寻求新的病害防治途径势在必行。利用植物内生菌对植物病害进行生物防治具有巨大的发展潜力,本研究从健康玉米植株内分离得到22株内生细菌,进一步筛选得到1株对玉米大斑病菌具有拮抗作用的内生细菌YY1菌株,经对其生物学特性、抗菌性能、抗菌物质及抗菌机理进行分析与研究,获得以下主要结果:1.从健康玉米叶片中分离出的1株对玉米大斑病菌具有较好拮抗作用的内生细菌菌株--YY1,该菌株有较广的抗菌谱,通过分生孢子悬浮液喷雾法检测YY1菌株的生防效果,发现浓度为2×10~4个/mL的孢子悬浮液与YY1菌株发酵液等比例混合液,对玉米大斑病菌具有较好的抑制作用。通过形态观察,生理生化反应及16S rDNA基因序列比对,鉴定YY1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。2.研究了YY1菌株的最佳发酵条件,即可溶性淀粉3.0%、蛋白胨2.0%、KH2PO4 0.02%、MnCl_2 0.01%,培养基初始pH9.0,培养基装液量30 mL/250 mL,接种量4%,28℃120 rpm摇床振荡培养。研究发现,经发酵条件优化后,发酵液对玉米大斑病菌的抑菌活性在30 h时几乎升高1倍。3.对YY1菌株分泌的抗菌蛋白粗提液的抑菌机理进行了初步研究,发现粗蛋白处理后致使玉米大斑病菌基内菌丝由丝状变为串珠状;当粗蛋白浓度为0.78μg/μL时,分生孢子萌发完全受抑制,原生质体裂解。孢子萌发和菌丝生长过程中,cAMP信号途径相关基因表达降低,且相关基因突变菌株抑制率亦降低,推测抑菌的分子机理可能与cAMP信号途径有关。4.抗菌粗蛋白对热稳定,对蛋白酶不敏感,重金属Cr~(3+)可使蛋白完全失活,并且pH活性范围较宽,在pH6~11范围内抑菌活性强,在碱性条件下稳定,在强酸性条件下抑菌活性几乎消失。粗蛋白经分离纯化并进行SDS-PAGE检测得到单一蛋白条带YY1-0.3-6,分子量约为30 kD,经MALDI-TOF MS分析发现该蛋白与烯酰辅酶A水解酶(enoyl-CoA hydratase)的匹配度最高。5.采用高速逆流色谱(HSCCC)对菌株YY1分泌的脂肽类抗菌物质进行分析,确定HSCCC最佳条件:检测波长为214 nm,溶剂体系为乙酸乙酯︰正丁醇︰水(4︰1︰5)。经HSCCC后生测发现第9个组分对玉米大斑病菌有很强的抑菌活性,该组分的保留时间为113~115 min,进一步经HPLC分析发现该组分成分不单一,组成较复杂,有待进一步分离鉴定。6. GFP标记YY1菌株,灌根法接种7 d后,检测发现该菌株在玉米的根、茎、叶中均可检测到。说明菌株YY1在玉米体内可以传导并具有较强的定殖能力。
李振森[2]2014年在《解淀粉芽孢杆菌Y-32-1产细菌素的研究》文中研究说明细菌素是细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的物质，对近似种或同源种有较强的拮抗作用，具有热稳定、广谱高效、无抗药性、无残留等特性，还具有一定的营养价值。与抗生素具有本质的区别，被认为是抗生素最有效的代替物。是生物农药、保健品、食品、饲料、化妆品的好材料，在医药、化工、食品加工等领域具有广泛的应用前景。本论文的研究内容主要包括高产细菌素菌株的筛选，菌株所产细菌素性质的初步研究及其发酵条件优化，并对其所产细菌素的结构进行了初步研究。首先从烟台黄曲霉污染严重的土壤样品中分离得到一株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌都有抑菌活性的菌株，命名为Y-32-1，根据菌株的形态、生理生化特性及其16S rDNA系统发育分析，将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株Y-32-1所产细菌素具有很好的耐酸碱性，发酵上清液显示抑菌活性的pH值为1-13；对热很稳定，发酵上清液沸水浴1.5h，其活性没有明显降低；对胰蛋白酶不敏感，对脂肪酶敏感，说明该细菌素中可能含有酯键。在单因素实验的基础上，运用Plackett-Burman实验和响应面相结合的方法，最终确定了其最佳培养条件和发酵培养基组成：接种种龄20h、接种量5%、装液量70mL/250mL、培养温度31.6℃、初始pH值7.2、摇床转速120r/min、玉米浆31.7g/L、蔗糖糖蜜2.0g/L、氯化钠6g/L、磷酸二氢钾5g/L、磷酸氢二钠5g/L。优化后所产细菌素的抑菌圈直径为24.6667mm，比优化前提高了12.16%。通过酸沉淀、有机溶剂萃取、柱层析等方法对Y-32-1所产细菌素进行了分离纯化，并利用电喷雾电离子质谱对其结构进行了表征。
吴红玉[3]2016年在《解淀粉芽孢杆菌Ht-q6高效突变菌株的筛选及生防潜能研究》文中提出内生细菌作为极具潜力的生防资源已成为国内外生物防治方面研究的重点。本课题组前期筛选得到一株具有广谱抑菌活性的核桃内生细菌：解淀粉芽孢杆菌Ht-q6。本试验以Ht-q6为出发菌株,对其进行诱变,选育出一株抑菌活性更强的高效突变菌株GHt-q6,并对该高效突变菌株的定殖、抑菌效果和抑菌代谢产物等生防潜能进行了研究,为后期开发利用该高效突变菌株奠定了理论基础。具体方法及结论如下：1.通过紫外诱变、亚硝酸诱变和亚硝酸紫外复合诱变叁种方式对菌株Ht-q6进行诱变,计算各处理的致死率和正突变率,最终确定最佳紫外诱变时长为40s;综合初筛复筛的抑菌结果得到高效突变菌株GHt-q6;高效突变菌株GHt-q6的抑菌活性较出发菌株Ht-q6提高了41.67%,但两株菌的生长曲线基本吻合。2.对高效突变菌株GHt-q6进行耐利福平逐级诱导,筛选出了耐300 μg·mL-1利福平的菌株GHt-q6-Rif;采用GHt-q6-Rif的菌悬液分别喷雾和浸泡处理核桃幼嫩叶茎,同时喷雾处理番茄幼苗,并定期采样分析。通过对耐利福平标记菌株GHt-q6-Rif回收平板计数结合扫描电镜(SEM)观察,测定了该菌株在核桃和番茄体内的定殖动态,并直观地显示了该菌株在核桃和番茄叶片内部的定殖位置和数量。证实该菌株可在植物体内成功定殖并转运,定殖的菌体量在接种后21天左右趋于稳定。3.通过硫酸铵沉淀法和盐酸沉淀法分别分离高效突变菌株GHt-q6的蛋白类和脂肽类物质;并通过平板抑菌和果实防病试验证明蛋白和脂肽粗提物均具有广谱的抑菌和防病能力。分别采用串联质谱(LC-MS-MS)和高效液相色谱质谱联用(HPLC-ESI-MS)进一步分离鉴定抑菌蛋白和抑菌脂肽,通过比对得到5种可信蛋白,它们分别与bacillopeptidase F、subtilisin、YnfF、AmyE alpha-amylase和beta-1,3-1,4-glucanase precursor protein相匹配;并证实脂肽粗提物中含有3类同系物：iturins系列(Bacillomycin D、 Bacillomvcin L和Iturin C)、fengycin系列和surfactin系列同系物。
曾东[4]2009年在《鲤益生菌的筛选、生物学特性及作用机理的研究》文中指出本研究从鲤(Cyprinus carpio)肠道及养殖水体分离筛选具有耐热和抑制病原菌功能的益生菌,并对其进行鉴定,在体外研究了部分益生菌对鲤前肠粘液的粘附特性及对病原菌粘附的抑制作用等生物学特性,并探讨了所筛选的枯草芽孢杆菌、肠球菌及光合细菌等3株益生菌对鲤肠道免疫机能、消化酶、肠道菌群结构与多样性及鲤肌肉品质、生长性能等的影响。各试验的研究结果如下:试验一、试验二中,从养殖池、水族箱和健康鲤肠道等分离20株细菌,以及四川农业大学动物微生态研究中心提供的8株供试细菌共28株,通过耐热和体外拮抗试验筛选出5株细菌,经生化试验和细菌16S rDNA测序鉴定为2株芽孢杆菌(Bacillus)、2株肠球菌(Enterococci)和1株柠檬酸杆菌(Citrobacter)。进一步采用体外固定鲤前肠黏液蛋白,结合同位素~(32)P标记细菌并示踪的方法,研究来源于鲤肠道的肠球菌和柠檬酸杆菌以及鲤养殖水体中的芽孢杆菌对鲤前肠黏液的体外黏附活性,建立筛选鲤益生菌的方法。结果表明,5株细菌均能黏附到黏液体外模型,肠球菌的相对黏附率极显着高于芽孢杆菌与柠檬酸杆菌(P＜0.01),柠檬酸杆菌与芽孢杆菌的相对黏附率差异不显着(P＞0.05),而肠球菌L2的相对黏附率极显着高于肠球菌E2(P＜0.01)。结果证明,鱼源的肠球菌对鲤前肠黏液的黏附率高于异源的芽孢杆菌,而且不同种属的肠球菌在黏附能力上也存在差异。试验叁、试验四中,选择枯草芽孢杆菌制剂(B组,由Z2菌株制成),枯草芽孢杆菌和光合细菌(四川农业大学动物微生态研究中心提供)混合制剂(C组),枯草芽孢杆菌和肠球菌(由L2菌株制成)混合制剂(D组)3种益生菌组合,并将每一种制剂在同一浓度水平与对照组(A组)进行比较,分析试验组对鲤鱼免疫功能及鲤肠道消化酶的影响。结果表明:试验B组、C组中鲤的白细胞吞噬、杀菌活性、血清溶菌酶活性与对照组A差异显着(P＜0.05),而试验D组上述3项指标都高于对照组A,但效果没有试验B、C组好,而3个试验组与对照组中淋巴细胞数差异不显着(P＞0.05)。证明:单独使用枯草芽孢杆菌比枯草芽孢杆菌和光合细菌复合制剂,以及枯草芽孢杆菌和肠球菌复合制剂更能有效地提高鲤鱼的白细胞的吞噬活性、杀菌活性和血清溶菌酶活性。同时,结果还表明:试验后期B组淀粉酶比活显着提高(P＜0.05),脂肪酶、胰蛋白酶比活力极显着提高(P＜0.01)。C组、D组胰蛋白酶比活力极显着提高(P＜0.01),但对淀粉酶和脂肪酶比活力的影响差异不显着(P＞0.05),特别是D组与A组的淀粉酶比活力在各阶段差异均不显着(P＞0.05)。在整个试验中,B组对鲤肠道消化酶比活的提高效果最好。试验五中,采用PCR-DGGE技术研究了不同组合的益生菌制剂对鲤肠道菌群结构与多样性的影响。结果表明:B组、C组和D组均能提高鲤肠道菌群的多样性。其中,试验B组鲤肠道菌群的多样性、优势菌群条带较对照组A明显提高,到42 d时条带增加量为9条;而试验C组鲤肠道菌群的多样性、优势菌群高于对照组A,到42 d时条带增加量为4条,但效果没有试验B组好,而D组的效果不明显。试验六中,研究了不同益生菌组合对鲤肌肉氨基酸含量、肉质及生长性能的影响。结果表明,在生长方面,与对照组相比,试验B、C、D组试验组鲤的生长性能指标均高于对照组。其中B组的丰满度、绝对生长率、相对生长率、瞬时生长率、生长比速等均达到同阶段的峰值,与对照组相比,试验B、C组绝对生长率与瞬时生长率显着提高(P＜0.05);在肌肉品质方面,与对照组相比,添加益生菌的3组试验组(B、C、D组),鲤肌肉粗脂肪含量、失水率极显着降低(P＜0.01);肌肉粗蛋白含量显着增加(P＜0.05);其中,试验B组显着程度最高。上述结果表明,3种益生菌组合对鲤均有一定的促生长作用,并对肌肉品质有明显的改善作用,其中,又以枯草芽孢杆菌菌剂单独使用效果最明显。综上所述,在鲤肠道、养殖水体广泛分布着益生菌。本研究通过普通培养和选择培养的方法,并通过耐热及体外抑制试验,筛选出枯草芽孢杆菌Z2、肠球菌L2等2株益生菌对致病性大肠杆菌、气单胞杆菌等有害菌有较强的抑制活性,并首次采用体外固定鲤前肠黏液,结合同位素~(32)p示踪的方法,对来源于鲤肠道的肠球菌和柠檬酸杆菌以及养殖水体的芽孢杆菌的细菌表面凝集素黏液蛋白受体的化学组成、其对病源菌附着鲤前肠黏液的影响等进行了研究,进一步探讨了益生菌的抑菌机理。同时本研究还首次探讨了不同益生菌组合对鲤免疫机理、肠道消化道酶活、肠道菌群结构与多样性、鲤肌肉品质及生产性能等的影响,结果表明,3种益生菌组合均可提高鲤免疫机能、消化道酶活性;增加鲤肠道菌群微生物多样性;改善鲤肌肉品质;提高生长性能。其中又以单株枯草芽孢杆菌制剂对以上指标的影响最大,作用效果最明显。该研究项目筛选的枯草芽孢杆(Z2)有望开发成鲤和其它鱼类养殖应用的益生菌。
姚岚[5]2011年在《一株水稻纹枯病拮抗细菌及其抗菌物质的研究》文中提出本研究以芽孢杆菌223菌株为主要实验材料,在形态学鉴定,生理生化鉴定和16S rDNA序列测定的基础上,又利用其gyrB基因序列进行系统发育树的构建,对该菌株进行菌种鉴定,发现该菌株与Bacillus pumilus和Bacillus safensis都非常接近,因此要得到明确的分类结果还需采用更灵敏的方法作进一步的鉴定。223菌株能产生对水稻纹枯病菌有强烈抑制作用的生物活性物质,我们采用以下方法对其进行分离纯化：用简化的Davis培养基培养得到的发酵液,通过40%和60%两级硫酸铵沉淀,Sephadex G-100分子筛分离和冷冻干燥浓缩等过程,得到纯化的抗菌蛋白,将其命名为ZJU223。利用Tricine-SDS-PAGE测得该物质的分子量在10.7-14.4KDa之问。采用Bradford法测得该抗菌物质浓度为47.78μg/ml。通过质谱分析,得到该抗菌蛋白的两个肽段：肽段1-LVTSPTSGWDPKGLK (15aa)和肽段2-HYHRRPNLTHCQNLDNKK (18aa)。对抗菌物质的部分理化性质研究发现,其对蛋白酶E和蛋白酶K敏感,对胃蛋白酶不敏感,经65℃处理30min后仍具拮抗活性,pH2-pH12均有拮抗活性,其中最适pH在7左右。通过检测抗菌物质对几种常见病原真菌的抑菌活性发现,ZJU223对水稻纹枯病菌和棉花立枯病菌的抑制效果最强,其次是水稻稻瘟病菌,对西瓜枯萎病菌和小麦赤霉病菌的抑制效果较弱,而对番茄灰霉病菌,草莓炭疽病菌,柿树炭疽病菌,柑橘青霉病菌和啤酒酵母则完全没有抑制效果。ZJU223对水稻纹枯病菌的最小抑制浓度约为0.32μg ml-1,半抑制浓度约为0.80μg ml-1。对水稻纹枯病防治的盆栽实验和田间实验发现,抗菌蛋白与223菌株发酵液的防效相当,且不亚于甚至高于井冈霉素的防效。本研究结果表明,在开发防治水稻纹枯病的生物农药方面,223菌株及其产生的抗菌蛋白具有较好的潜力。本研究为将来开展结构与功能研究,最终开发新型生物农药提供了实验基础。
李乔曼[6]2015年在《香蕉炭疽病生防细菌LYM3的鉴定，发酵条件优化及抑菌活性成分的初步分析》文中研究指明香蕉炭疽病分布广泛,是世界香蕉种植区常见病害,由病原真菌香蕉刺盘孢[Collectorichum musae (Berk.&Curt.) Arx]引起。常用防治香蕉炭疽病方法有化学防治和生物防治。长期使用化学农药,造成C.musae产生抗药性,从而迫使人们加大药量或更替新农药,加剧抗药性出现,形成恶性循环。相较于化学防治,生物防治更环保及可持续。目前香蕉炭疽病生物防治的研究集中在生防菌的筛选及植物或微生物抑菌代谢产物的分离等,其中药用植物内生菌抑菌物质的挖掘,也是香蕉炭疽病生物防治研究热点之一。本研究从实验室现有内生细菌出发,利用生长对峙法从中筛选出一株对多种植物病原菌具有较高抑菌活性的细菌LYM3,分离自催吐萝芙木,对其产抑菌物质的发酵培养基进行了优化,并对抑菌物质的成分进行了初步分析,具体研究结果如下：(1)通过生长对峙实验,筛选出一株拮抗性较强的内生细菌LYM3。发现LYM3对10种常见真菌病害皿内抑制率均超过60%,具广谱抗菌性。利用形态观察,结合生理生化试验和16S rDNA分析,鉴定细菌LYM3为Bacillus subtilis。(2)以LB培养基为基础,对细菌LYM3产抑菌物质的发酵条件进行了优化,最适培养基配方为：2%可溶性淀粉,1%胰蛋白胨,0.8%酵母粉,1%NaCl,最适发酵初始pH值为6,培养60h,此条件下发酵上清液产生的抑菌圈直径最大,为34.2mm。(3)LYM3发酵液抑菌物质集中在上清液,对蛋白酶K和UV不敏感,在高温下保持较强抑菌活性,有机溶剂对上清液抑菌活性没有显着影响,不同金属离子对上清液抑菌活性影响有显着差异,在pH>7时,LYM3发酵上清液抑菌活性随pH增加而下降,pH<4时,上清液会产生絮状沉淀,此时发酵液抑菌活性物质在沉淀中,试验证明甲醇浸提沉淀,是初步提取抑菌物质的有效方法。(4)排油圈法确定LYM3发酵上清液中含有表面活性剂,颜色反应证明抑菌粗提物中含肽键,加热释放氨基酸。结合TLC原位酸水解结果,初步判断抑菌活性物质为闭合环状脂肽。HPLC检出条件为波长205μ m,乙腈80%,温度30℃,LCMS鉴定抑菌活性物质A为C15IturinB, B为C14SurfactinB和C15BacillomycinD,E为C14SurfactinA或C15SurfactinB或C14SurfactinC。
贾丽艳[7]2014年在《产类细菌素菌株的筛选鉴定及类细菌素的研究》文中研究指明细菌素(Bacteriocin)是细菌在代谢过程中由核糖体合成,基因编码的一类具有抑菌生物活性的多肽或蛋白质类物质。因其高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性及良好的生物相容性等优点,作为绿色生物防腐剂在农产品和及其他食品的保藏和农作物安全生产中倍受关注。考虑到细菌素产生菌及细菌素的安全性,到目前为止,只有乳酸菌产生的细菌素作为绿色防腐剂应用于食品行业。但是乳酸菌细菌素的理化及生物学特性又限制了其的广泛应用。因此,新型广谱的细菌素有待开发。本论文以从山西老陈醋醋醅中分离得到的75株细菌为研究对象,筛选高产抑菌物质的菌株,并对其中一株产细菌素并具有广谱抑菌效果的菌株进行重点研究,包括产细菌素菌株的筛选、细菌素的定性研究、菌株的鉴定、细菌素生物学特性的研究及细菌素的分离纯化等,为微生物天然生物防腐剂的开发以及在食品和农产品的安全生产和保藏中的应用提供理论依据。研究的主要结果如下：1.采用牛津杯法,从来源于山西老陈醋醋醅的75株细菌中筛选得到17株具有抗菌活性的细菌。通过菌落观察、液体培养初步确定这些菌株均为芽孢杆菌,其中菌株A32所产抑菌物质,具有广谱、高效的抑菌作用,对大肠杆菌、葡萄球菌、芽孢杆菌都有较强的拮抗作用。2.采用酸抑制排除试验、过氧化氢排除试验、蛋白酶消化试验,确定菌株A32发酵产生的抑菌物质为H202和蛋白类物质。根据抑菌蛋白的生成与菌株A32生长曲线关系,推测菌株A32产生的蛋白类抑菌物质为菌株A32的初级代谢产物,即由核糖体合成基因编码的蛋白类物质；根据抑菌蛋白对菌株A32生长的影响,确定抑菌蛋白对菌株A32具有免疫源性。以上结果表明菌株A32产生的抑菌蛋白质类物质符合细菌素应有的特点,推测其为细菌素,但是由于研究中没有获得该类细菌素的编码基因,因此把该类抑菌蛋白称为类细菌素。此外,菌株A32不含有质粒,推测类细菌素相关基因在染色体上。3.通过菌落形态指标、生理生化测定和16S rDNA序列分析,对产类细菌素菌株A32进行种属鉴定。菌落形态指标显示菌株A32为芽孢杆菌；生理生化测定结果显示其可能为枯草芽孢杆菌；对其16S rDNA序列进行扩增、测序,获得1542bp序列(已提交genbank,序列号为JX025646),与g enbank上的已知序列比对,结果显示该序列与枯草芽孢杆菌具有较高的序列相似性,达到99～100%。对其系统发育树分析发现,其与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌亲缘关系最近。结合菌株A32不同水平的检测结果,确定分离自山西醋醅中的菌株A32为枯草芽孢杆菌,定名为枯草芽孢杆菌HJD.A32。该菌株被保藏于中国微生物菌种保藏中心并已经申报专利,专利受理号：201210500205。4.通过双层牛津杯法,构建了枯草芽孢杆菌HJD.A32所产类细菌素的抑菌谱,结果表明该类细菌素抑菌谱广,抑菌活性高,可抑制多种食源性致病菌及引起食品腐败变质的革兰氏阴性菌和阳性菌的生长,包括枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌,其中对芽孢杆菌SH108的抑菌效价高达256AU/mL。此外,它还可以抑制酵母菌的生长,如黄酒酿酒酵母。但是对霉菌没有抑制性。5.利用温度梯度、酸度梯度和不同的化学试剂和蛋白酶处理该类细菌素,结果显示该类细菌素在60-100℃之间处理20min或在pH3～8的范围内处理12h,类细菌素抑菌活性保持稳定,表明其对酸碱稳定性和热稳定性强；1%SDS能使类细菌素抑菌活性提高约40%,1%吐温20、吐温80和司本80能使类细菌素抑菌活性分别降低17%、24%、8%,表明其可不同程度耐受多种化学试剂；胃蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶k消化后,抑菌活性降低或消失,表明其对蛋白酶敏感,能被胃肠所消化,具有一定的安全性。以上类细菌素生物学特性的研究表明该类细菌素符合现代生物性食品防腐的发展要求,具有一定开发应用前景。6.采用超滤法,初步确定发酵上清液中含有多种蛋白类抑菌物质,分子量>3KDa,且主要集中在3～10KDa之间。分别采用硫酸铵沉淀法、有机溶剂沉淀法、酸沉淀法对发酵上清液的抑菌物质进行分离,结果表明饱和硫酸铵法提取类细菌素的抑菌效果最佳、酸沉法次之、丙酮法效果最差；在操作上酸沉淀法、酒精法最为简单,其中酸沉淀的杂质最少；饱和硫酸铵法操作复杂,且杂质多。综合考虑,在后面操作中主要采用酸沉淀法大量提取类细菌素粗提物。通过超滤法对酸沉淀法获得的类细菌素粗提物进行浓缩和分级检测,结果显示,不仅介于3K与10K之间物质和>10K的物质具有抑菌活性,而且<3K的溶液中也具有抑菌活性,抑菌圈不清晰,抑菌圈大小为10mm,表明类细菌素粗提物中最少有叁种抑菌物质存在。这与前面发酵液超滤结果不同。推测可能是由于物质的浓缩,使得<3K的抑菌物质的抑菌活性能够通过牛津杯法测定出来。对<3K的抑菌物质用蛋白酶K消化,抑菌活性消失,表明其为蛋白质类物质。采用Bio-scale TM Mini Macro-Prep (?) High Q阴离子交换色谱法对酸沉淀类细菌素粗提物进行分离纯化,获得1个具有抗菌活性的洗脱峰,洗脱时间范围为5～12min,洗脱液为0.1mol/L NaCl (0.02mol/L, pH5.7磷酸缓冲液)。通过超滤法分级分离、浓缩和检测各级抑菌物质的抑菌活性,发现抑菌物质的分子量<3K,>3K的抑菌物质没有检测到,推测这些物质被基质吸附。对峰A进行质谱分析,结果显示分子大小在1000Da以上,具体抑菌分子大小及其氨基酸序列的排列及组成,还需进一步的纯化后测定。
贾锐[8]2016年在《高产杆菌肽地衣芽胞杆菌的鉴定与选育》文中认为抗菌肽(Antimicrobial peptide)是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质,它是机体先天性免疫系统的重要组成部分。抗菌肽具有独特杀菌机制和广谱抗菌性,不易造成病原菌的耐药性。一些抗菌肽对肿瘤细胞有广谱杀灭活性,为癌症患者提供了一类新型的抗癌药物,其在医药、养殖、食品、生物防治等方面有很高的应用价值。本实验拟从天然界筛选得到1株抑菌活性较强、抑菌谱较广的芽胞杆菌,并通过分离纯化得到其主要抑菌活性物质,再通过全基因组改组方式提高其主要活性物质产量。主要研究结果如下:1.抗菌活性芽胞杆菌的筛选与鉴定:从天然原桃胶中分离到一株有抑菌活性物质的芽胞杆菌TJ12。其发酵产物对金黄色葡萄球菌(StapHylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、蜡样芽胞杆菌(Bacallus cereus)和串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)有抑菌活性。结合菌落形态、生理生化指标、16S rRNA序列和gyrB序列将TJ12菌株鉴定为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)。2.抑菌活性物质的分离纯化与鉴定:通过硫酸铵分级沉淀、有机溶剂萃取、羟丙基葡聚糖凝胶层析、高效液相色谱分离纯化,得到其主要活性物质。该物质对pH、温度和叁种蛋白酶(胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶)有较好的稳定性。经电喷雾电离质谱分析,初步鉴定该株地衣芽胞杆菌TJ12的主要抑菌物质为杆菌肽A。3.基因改组选育高产杆菌肽地衣芽胞杆菌及改组菌株差异分析:为了提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量,采用全基因组改组技术进行菌株选育。以地衣芽胞杆菌TJ12为原始菌株,通过紫外(UV)诱变、亚硝基胍(NTG)诱变、常压室温等离子体(ARTP)诱变构建了 TJ12菌的突变体库。在优化其原生质体制备和再生条件的基础上,以其中4株诱变菌株(U11、U23、H1、L71)作为亲本,采用聚乙二醇(PEG)介导的方法进行叁轮多亲本的全基因组改组,同时,结合双亲灭活的筛选方法,最终选出1株杆菌肽产量提高并能稳定遗传的优良菌株F3,其摇瓶水平发酵36 h,杆菌肽A产量达760mg/L,为野生菌株TJ12的1.7倍。与野生菌株TJ12相比,改组株提前进入生长稳定期,两者发酵过程pH几乎无差异;最终菌体生长量虽低于野生菌,但单位菌体还原糖产量及杆菌肽产量都高于野生菌株;其合成基因和调控基因表达量相对野生菌株都上调,其中合成基因上调幅度较大。推测改组菌株自身有了更强大的杆菌肽耐受机制,且合成基因相关部位可能发生了改变。
袁树忠[9]2008年在《辣椒疫霉颉颃菌的筛选鉴定、生防机制及与杀菌剂的协同作用》文中指出辣椒疫病是一种对甜椒、辣椒具有毁灭性的病害,在我国的辣椒产地均有发生为害。利用生物防治控制辣椒疫病能减少化学药剂的使用数量和缓解病菌的抗药性,但生防菌防治病害的不稳定性限制了生物防治的发展。采用生防菌与杀菌剂协同防治病害,既能克服化学药剂的问题,也能弥补生物防治的不足。本文以辣椒疫霉为靶标病原菌,开展了颉颃微生物的分离筛选、候选菌的鉴定、候选菌对辣椒疫霉的颉颃作用特点、与卵菌杀菌剂的协同作用以及重金属离子的影响研究。结果如下：以辣椒疫霉为靶标病原菌,采用对峙培养的方法筛选得到了105个颉颃菌株,以辣椒疫霉Phytophthora capsici、辣椒炭疽病菌Collectotrichum capsici、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、番茄早疫病菌Alternaria solani、番茄枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、黄瓜蔓枯病菌Mycosphaerella melonis等7种病原菌进行复筛,结果表明,放线菌中以A001菌株对辣椒疫霉菌的作用最强；细菌中以B100菌株最好,对7种植物病原菌的抑菌带达11.3-18.5mm,生长抑制率达50%-84.3%。在定殖试验和盆栽试验中,B100可在辣椒根表面的稳定定殖,在处理后20d根部的菌量仍能达到7.06×105cfu/g(根重),而B148的定殖能力则明显差于B100。在盆栽试验中,B148对辣椒疫病的防治效果最好,B100处理的次之,根据抑制力-定殖力双重筛选的方法,确定与卵菌杀菌剂进行协同防治辣椒疫病的菌株为B100。利用形态、生理生化特征以及16S rDNA序列扩增分析对B100进行了鉴定。结果表明,菌株B100是一株好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性的芽孢杆菌,生理生化特性与多粘类芽孢杆菌最相似；16S rDNA序列与GenBank中登录号为AY359623的Paenibacillus polymyxa GB-465具有最高的同源性,达99.9%,在系统发育树上两者也最接近。由此将B100鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。在离体条件下研究了多粘类芽孢杆菌B100菌株的生长条件及对辣椒疫霉的抗菌作用,结果表明,马铃薯葡萄糖培养液、牛肉膏酵母膏蛋白胨蔗糖培养液以及NA是适合B100生长的培养液,培养条件为28℃、培养液初始pH为6.0-8.0时B100生长最好；B100活菌菌液、无菌滤液、灭菌菌液对辣椒疫霉抗菌作用的顺序为：活菌菌液>灭菌菌液>无菌滤液,灭菌后的菌液有抗菌活性表明抗菌物质具有耐热性能。B100能造成辣椒疫霉菌菌丝畸形、分枝增多,细胞质异常浓缩、菌丝破裂、原生质外溢等。用B100菌液浇灌处理甜椒根部,测定了其叶片和根部中防御酶的活性变化,结果表明,B100能使甜椒(茄门甜椒)幼苗叶片和根中过氧化物酶、多酚氧化酶活性明显提高,但植株中苯丙氨酸解氨酶的活性没有显着变化。离体测定的B100与嘧菌酯抑制辣椒疫霉的联合作用试验结果表明,当B100浓度高于103cfu/ml时,与嘧菌酯0.5-50μg a.i./ml混用,对辣椒疫霉菌丝的实际抑制率均高于理论抑制率,显示为增效作用,而在B100浓度为102cfu/ml时,与嘧菌酯混合对辣椒疫霉菌丝的实际抑制率则低于理论值,两者混用后则为颉颃作用；而采用等效线法判断,则明确表明菌-药混用具有增效作用。在盆栽试验中,处理后7d,嘧菌酯与B100混用对辣椒疫病的防效显着高于B100单用。在田间试验中,采用游动孢子悬浮液灌根接种,B100分别与嘧菌酯、甲霜灵混用对辣椒疫病的效果好且稳定,防效高于药剂单用；通过菌丝块田间接种试验,B100与这两种卵菌杀菌剂混用的防效也高于药剂单用。B100与嘧菌酯、甲霜灵可以协同防治辣椒疫病。离体下研究了化学因子对辣椒疫霉和B100生长繁殖的影响,结果表明,氟吗啉、甲霜灵对辣椒疫霉菌丝生长抑制力强,而嘧菌酯对辣椒疫霉的作用力弱,而叁种药剂在试验浓度下均未对B100有明显的抑制作用；重金属离子中,只有10mg/L的Ag+和Cu2+对辣椒疫霉菌丝生长有明显的抑制作用,其他4种重金属离子在≤10 mg/L浓度下对辣椒疫霉菌丝生长没有明显的抑制作用。而对于B100,Cu2+、Bi3+、Pb2+处理的菌浓度与对照的没有显着差异,0.1-1 mg/L的Cd2+、0.5mg/L的Ag+处理,B100的浓度显着高于对照,只有0.5-1mg/L的Hg2+处理后B100的浓度显着低于对照。如果土壤受到了重金属离子的污染,那么生防菌B100对辣椒疫病的防治效果可能会受影响。
谈艳苗[10]2013年在《栉孔扇贝（Chlamys farreri）组织凝集活性分析及一种C-型凝集素单克隆抗体的研制和特性研究》文中研究指明凝集素是贝类生物体液免疫的主要执行者之一，是抵御外来病原体侵袭和环境刺激的重要“屏障”，在病原识别以及止血、凝固、物质运输和创伤修复等生理过程中都具有重要作用。C-型凝集素（C-type lectin）作为宿主防御系统中的一种模式识别蛋白（Pattern recognition protein，PRP），在病原体识别和细胞间的相互作用上具有重要作用。本论文比较了栉孔扇贝血淋巴以及其它不同组织粗提液对高等动物血细胞和多种菌体的凝集活性；并从栉孔扇贝血淋巴中分离纯化了甘露聚糖结合凝集素（Mannan-binding lectin，MBL）；制备了C-型凝集素CfLec290的单克隆抗体，并结合RT-PCR技术、原位杂交技术对其在栉孔扇贝（Chlamysfarreri）血细胞以及其它不同组织中的分布特性进行分析，为研究栉孔扇贝凝集素在免疫防御机制中作用积累了数据。本论文主要包括以下4个部分：（1）栉孔扇贝血淋巴以及其它不同组织粗提液的凝集活性分析。本论文通过超声波破碎或组织匀浆的方式分别制备了栉孔扇贝血细胞以及其它组织，包括鳃、外套膜、肝胰腺、性腺、肾脏以及肌肉组织的蛋白粗提液，并将其与血淋巴上清的蛋白浓度都调整为1mg/mL，然后分别测定这8组样品对2种动物红细胞血液和9种菌悬液的凝集活性，并测定EDTA、多种糖溶液对其凝集活性的影响。结果发现：血淋巴上清不仅可以凝集小鼠红细胞，还可以凝集鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及毕赤酵母，其凝集活性可以被EDTA、葡聚糖、甘露糖-6-磷酸、N-乙酰葡萄糖胺，甘露聚糖、酵母聚糖、硫酸软骨素、肽聚糖和脂多糖不同程度的抑制；鳃组织粗提液可以凝集金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母，且凝集活性可以被EDTA、N-乙酰半乳糖胺、甘露聚糖、酵母聚糖、硫酸软骨素、肽聚糖和脂多糖不同程度的抑制；外套膜、肝胰腺、性腺和肾脏提取液均只能凝集枯草芽孢杆菌，且该凝集反应主要受到甘露聚糖、酵母聚糖以及肽聚糖的抑制；此外，栉孔扇贝血细胞及肌肉组织粗提液并未发现凝集活性。这些结果表明，在栉孔扇贝体内有多种类型凝集素的存在，且在血淋巴上清中的类型和数量最为丰富，而这正与扇贝强大的体液免疫系统息息相关。（2）栉孔扇贝血淋巴甘露聚糖结合凝集素的分离纯化。本论文依次通过硫酸铵盐析和甘露聚糖-亲和层析柱亲和层析，从栉孔扇贝血淋巴上清中分离纯化出甘露聚糖结合凝集素，通过对其凝集活性的检测以及蛋白分子量的分析发现：提纯的MBL可以凝集鳗弧菌和毕赤酵母，对高等动物血细胞以及其它检测菌体并无凝集活性；MBL在Native-PAGE中的分子量为645kDa，在SDS-PAGE中的分子量为73kDa，表明该凝集素是由一种亚基组成的多聚体。（3）抗栉孔扇贝C-型凝集素Cflec290单克隆抗体的制备和筛选。本论文首先通过体外重组表达获得重组蛋白rCfLec290，免疫小鼠后，经细胞融合技术制备了抗rCfLec290单克隆抗体，并分别通过ELISA技术和Western blotting技术对抗体进行筛选，最后筛选出3株可稳定表达单抗的细胞株1A2、1A7和2B6。（4）C-型凝集素Cflec290在栉孔扇贝血细胞及其它不同组织中的分布。首先通过半定量RT-PCR技术检测Cflec290mRNA在血细胞以及其它不同组织中的表达含量，再通过制备地高辛标记的Cflec290的cRNA核酸探针，检测血细胞滴片以及其它不同组织切片中mRNA表达的位置，最后通过抗重组蛋白rCfLec290单克隆抗体检测该凝集素在血细胞滴片及不同组织切片中的分布情况。结果发现：通过半定量RT-PCR，Cflec290在血细胞以及其它各组织中均有表达，但在外套膜、肾脏以及性腺中的转录水平最高，血细胞、鳃和肝胰腺次之，在肌肉中的转录水平较弱；原位杂交显示，阳性信号主要发现在栉孔扇贝的外套膜表皮细胞以及肝胰腺管壁细胞中，在其它组织中并未发现；通过利用抗重组蛋白rCfLec290的单克隆抗体的间接免疫荧光检测发现，CfLec290蛋白主要分布在扇贝血细胞膜，以及鳃、外套膜、肝胰腺等组织表皮和腔体表面。结果表明，Cflec290可在栉孔扇贝血细胞、外套膜表皮细胞和肝胰腺管壁细胞中合成与表达，功能蛋白则广泛分布于扇贝血细胞及各组织器官中，在血细胞膜，鳃、外套膜、肝胰腺表皮，腔体表面尤为丰富。依此推测，血细胞、外套膜和肝胰腺在Cflec290合成和表达过程中发挥着重要作用，该凝集素在血细胞、外套膜或肝胰腺细胞内合成后，被分泌到细胞外，伴随着体液流动，被运输到全身多组织器官中行使功能。
参考文献：
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[2]. 解淀粉芽孢杆菌Y-32-1产细菌素的研究[D]. 李振森. 青岛科技大学. 2014
[3]. 解淀粉芽孢杆菌Ht-q6高效突变菌株的筛选及生防潜能研究[D]. 吴红玉. 山西农业大学. 2016
[4]. 鲤益生菌的筛选、生物学特性及作用机理的研究[D]. 曾东. 四川农业大学. 2009
[5]. 一株水稻纹枯病拮抗细菌及其抗菌物质的研究[D]. 姚岚. 浙江大学. 2011
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[7]. 产类细菌素菌株的筛选鉴定及类细菌素的研究[D]. 贾丽艳. 山西农业大学. 2014
[8]. 高产杆菌肽地衣芽胞杆菌的鉴定与选育[D]. 贾锐. 南京农业大学. 2016
[9]. 辣椒疫霉颉颃菌的筛选鉴定、生防机制及与杀菌剂的协同作用[D]. 袁树忠. 南京农业大学. 2008
[10]. 栉孔扇贝（Chlamys farreri）组织凝集活性分析及一种C-型凝集素单克隆抗体的研制和特性研究[D]. 谈艳苗. 中国海洋大学. 2013