叶珊, 汪宇辉, 胡丽娟, 刘延友, 王晓佳[1]2006年在《hper1干扰质粒的构建及hper1功能的初步研究》文中提出目的构建高效的针对hper1(人类period1基因)的干扰质粒,并对hper1的功能进行初步研究。方法选择4个hper1的干扰位点,根据位点序列合成构建4个pTER-hper1干扰质粒,并通过测序验证。将4种干扰质粒分别转染至SH-SY5Y细胞,经马血清休克诱导后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测hper1mRNA的表达,鉴定干扰效果。提取细胞总蛋白,Western Blot检测P-p44/42丝裂原活化蛋白激酶(mitagen-actinated pratein kinase,MAPK)表达。结果RT-PCR鉴定显示pTER-hper1-Ⅱ干扰质粒干扰效率最高,hper1表达量降低84.9%。Western Blot显示hper1表达受抑制后,P-p44/42MAPK水平升高。结论成功构建并筛选到具有显着干扰效率的pTER-hper1干扰质粒,为进一步研究hper1的功能奠定了基础,并发现hper1对MAPK通路具有负相调控作用。
孙凤飞, 朱家媛, 刘康, 李婷婷, 李德智[2]2011年在《昼夜节律基因hPer1和hPer2对食管癌细胞株Eca-109放射敏感性的影响》文中提出目的探讨昼夜节律基因hPer1和hPer2对食管癌细胞株(Eca-109)放射敏感性的影响。方法体外培养食管癌Eca-109细胞株,通过避光和乙酰肉豆蔻佛波酯(PMA)分别诱导昼夜节律基因hPer1和hPer2节律性的表达,用RT-PCR检测出表达高峰和低谷。在hPer1和hPer2表达的高峰和低谷时,分别用6mV-X射线给予照射,通过Tunel及流式细胞术,检测肿瘤细胞的凋亡。结果昼夜节律基因表达高峰时照射与低谷时照射比较,肿瘤细胞凋亡率减少(P<0.05)。结论昼夜节律基因hPer1和hPer2高表达,能够降低食管癌细胞的放射敏感性。
汪宇辉, 胡丽娟, 鲁芳, 刘延友, 江舟[3]2006年在《层粘连蛋白受体Ⅰ与hPeriod1相互作用的研究》文中进行了进一步梳理目的寻找与节律蛋白hPeriod1(hPer1)相互作用的蛋白,并对筛选出的层粘连蛋白受体Ⅰ(Lamr1)在节律系统中的功能作初步研究。方法分别构建pGAD rec脑/cDNA文库和pGBKT7/hPer1bH LH-PAS重组诱饵蛋白质粒,酵母双杂交筛选下丘脑里与hPer1相互作用的蛋白。利用RT-PCR技术检测新蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织中的表达及在SH-SY5Y细胞中的节律性质。通过RNA干扰技术研究新蛋白与hPer1的关系。结果通过酵母双杂交筛选,证明Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用。该蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织广泛表达,灰度比较显示经马血清诱导后的SH-SY5Y细胞的hPer1表达呈现近日节律,而Lamr1表达无节律变化。RNA干扰显示hPer1表达下调不影响Lamr1的表达。结论Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用,但其表达在RNA水平无节律变化。Lamr1参与细胞的黏附、转移和侵袭。其前体蛋白作为核蛋白参与细胞蛋白的合成。Lamr1可能参与hPer1相关的生物节律系统的信号传出。
常莉, 李文辉, 汪宇辉, 刘延友, 江舟[4]2013年在《LAMR1与PER1蛋白作用位点的筛选》文中进行了进一步梳理目的:筛选出与PER1蛋白相互作用的LAMR1的核心位点。方法:采用盒式定点突变法,对重组目的质粒pGADT7-Rec/Lamr1201-295的插入片段Lamr1201-295羧基末端的205-216氨基酸序列RDPEEIEKEEQA进行定点突变,并以hPER1蛋白的bHLH-PAS结构域为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统确定这4种不同的突变LAMR1201-295片段与hPER1的相互作用。结果:营养缺陷培养基筛选显示4种转化菌在二缺SD/-Leu/-Trp、叁缺SD/-His/-Leu/-Trp和四缺SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp固体培养基上都可以生长;β-半乳糖苷酶印膜法检测结果显示4种转化菌均可显色。结论:突变片段LAMR1-RDP,LAMR1-EEI,LAMR1-EKE和LAMR1-EQA都能够与hPER1的bHLH-PAS结构域在酵母中发生相互作用。提示LAMR1的205-216Aa可能不是其与hPER1相互作用的核心氨基酸序列。
赵溪岩, 成姝婷, 勾洵, 王正荣, 肖静[5]2013年在《hper1基因3′端UTR区双荧光素酶报告系统构建》文中研究表明目的:构建hper1基因3′端UTR区双荧光素酶报告系统pmiR-RB-REPORTTM-hper1-3′UTR(PMIR-3′UTR),检测其表达,为研究hper1基因的表达调控及microRNA调控靶基因的结合位点提供基础平台。方法:用PCR扩增的方法提取hper1基因3′UTR序列,并连接至pmiR-RB-REPORTTM(PMIR)双荧光素酶报告载体的多克隆位点,测序验证插入序列并转染入A549细胞检测其荧光素酶活性。结果:测序结果表明PMIR-3′UTR的插入序列正确,在转染入A549细胞后其荧光素酶能正常表达。结论:PMIR-3′UTR双荧光素酶报告系统构建成功。
李英明, 汪宇辉, 胡丽娟, 刘延友, 王跃[6]2004年在《hPer_1bHLH-PAS结构域酵母双杂交系统的构建》文中进行了进一步梳理目的构建hPer1bHLH PAS结构域的酵母双杂交系统 ,以寻找与hPer1相互作用的新蛋白。方法构建pGBKT7 hPer1bHLH PAS重组诱饵质粒及 pGADT7 Rec 脑cDNA文库质粒 ;将两种质粒顺序转染至酵母细胞AH1 0 9中 ,进行营养缺陷筛选阳性克隆株。结果经酶切和基因测序鉴定 ,证实重组诱饵质粒 pGBKT7 hPer1bHLH PAS构建成功。脑cDNA文库转化效率为 1 .2× 1 0 6/3μgpGADT7 Rec。结论 酵母双杂交文库筛选得到 2 4个阳性克隆。这为寻找脑组织中与hPer1相互作用的未知蛋白奠定了基础。
胡丽娟[7]2006年在《hPER1相互作用蛋白的筛选及与近日节律关系的研究》文中提出目的:本研究的主要目的是寻找人脑组织cDNA文库中与hPER1蛋白相互作用的新蛋白,完善Per1相关的近日节律钟控系统的详细机制和信号传导通路。研究分为叁个部分:1、人脑组织中与hPER1相互作用新蛋白的筛选与鉴定;2、新蛋白与hPER1相互作用的关键结构域的确定;3、新蛋白与hPER1的功能联系的研究。方法与结果:第一部分:人脑cDNA文库中与hPER1相互作用蛋白的筛选方法:采用BD Clontech公司提供的文库构建试剂盒(BD Matchmaker? Library Construction & Screening Kits)构建人脑cDNA文库。通过RT-PCR扩增hPER1-PAS结构域的编码序列,获得的片断与质粒载体pGBKT7连接重组为诱饵质粒pGBKT7/hPer1PAS。采用顺序转染法构建酵母双杂交系统(MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System,BD Clontech),筛选人脑cDNA文库中能与诱饵蛋白hPER1-PAS结构域相互作用的蛋白。并且采用营养缺陷培养基、β-半乳糖苷酶印膜法检测报告基因的表达;免疫共沉淀实验确证蛋白间的相互作用。阳性克隆子经PCR扩增,进行测序和比对分析。结果:成功构建以pGBKT7/hPer1PAS为诱饵蛋白的表达质粒;构建人脑cDNA文库;成功构建pGBKT7/hPer1PAS和pGADT7-Rec/cDNA的酵母双杂交系统,并经过营养缺陷筛选、β-半乳糖苷酶印膜法检测以及免疫共沉淀实验,总共筛选到
叶珊[8]2007年在《RNAi干扰技术在生物节律相关基因hper1和clock研究中的应用》文中指出RNA干扰(RNAi)是指内源性或外源性双链RNA通过一定的作用机制导致细胞内特定基因在mRNA水平上的表达显着降低。RNA干扰技术是过去十年里基因组学方面最引人注目的发现之一，该技术是应用21nt的短双链RNAs作为一个短干扰RNAs(siRNAs)当它介入到哺乳动物细胞内时有效的抑制RNA的表达。RNA干扰技术因其具有高度特异性和显着的干扰效果，而在研究和应用领域受到高度重视。时间生物学的研究表明，人类的很多生命活动具有一定的节律。在各种不同周期的节律当中，近日节律是最引人注意，被研究最多的。Circadian，是一个最近几十年才出现的词。它被用来描述周期大概为24小时的节律。人类有很多节律活动的周期接近24小时。近日节律(circadian rhythms)由生物钟(近日节律钟)系统产生和调控。该系统在调节生物的生理功能，并使之与外界环境相适应方面起着重要的作用。目前研究证明PER1是近日节律分子振荡中的关键性蛋白，主要通过蛋白与蛋白作用的方式发挥功能。但PER1通过何种途径发挥作用目前还不十分清楚。因此本文构建针对hper1的高效RNA干扰质粒，为进一步研究hper1的功能构建平台，并在此基础上对hper1的功能进行初步研究。结果RT-PCR鉴定显示pTER-hper1-Ⅱ干扰质粒干扰效率最高，hper1表达量降低84.9％。Western Blot显示hPER1表达受抑制后，P—p44／42 MAPK水平升高。在哺乳动物，节律基因per1，per2，Bmall，Clock和cry1已经在精子生成过程中被发现但却不是以近日节律的形式存在。值得注意的是Clock基因的表达仅仅在圆形精子的顶体被发现，这一发现推测Clock基因在雄性动物的生殖能力中可能起到了潜在的作用。因此在本研究中我们利用RNAi技术干扰clock在小鼠睾丸中的表达，结果westernblot显示在注射clock干扰质粒后3天和6天clock表达量分别下降55％和48％，为进一步探讨clock对小鼠生殖功能的影响构建平台，并在此基础上对clock对小鼠生殖功能影响进行初步研究，
郭勇, 程牛亮, 王晓霞, 刘志贞, 解军[9]2002年在《hPER1-NLS:一种新型穿膜多肽的研究》文中研究指明目的 研究hPER1-NLS多肽的穿膜特性。方法 用固相法化学合成hPER1-NLS多肽及对照多肽 ,用免疫组化方法观察hPER1-NLS的穿膜能力及在细胞中的定位 ,并对其穿膜的特性做初步研究。结果 hPER1-NLS对细胞膜有穿透作用 ,主要定位在细胞核中。且在不同作用环境条件下 ,都具有穿膜能力。结论 hPER1-NLS也是一种MPP ,可能对于基因治疗及穿膜机制的探讨具有重要意义
鲁芳, 胡丽娟, 汪宇辉, 刘德松, 刘彦友[10]2006年在《hPeriod1_(PAS)结构域相互作用蛋白的筛选和研究》文中研究表明目的寻找与近日节律系统核心基因Period1(Per1)相互作用的新蛋白,揭示近日节律相关的可能信号通路。方法采用酵母双杂交方法,以人Per1的PAS结构域为诱饵,扫描人下丘脑cDNA文库,并通过体外转录、免疫共沉淀验证蛋白间相互作用;通过RT-PCR检测RACK1(receptors for activated C-k inase)表达的组织特异性及节律性;运用RNA i技术初步研究RACK1与Per1的信号联系。结果人下丘脑区域RACK1蛋白与Per1存在相互作用;RACK1在多器官组织保守表达,但其表达未呈现明显节律性;上调及下调Per1表达,RACK1的RNA水平无显着变化。结论细胞内接头分子RACK1是一种新的Per1作用蛋白,可能介导、调控Per1的功能。
参考文献：
[1]. hper1干扰质粒的构建及hper1功能的初步研究[J]. 叶珊, 汪宇辉, 胡丽娟, 刘延友, 王晓佳. 航天医学与医学工程. 2006
[2]. 昼夜节律基因hPer1和hPer2对食管癌细胞株Eca-109放射敏感性的影响[J]. 孙凤飞, 朱家媛, 刘康, 李婷婷, 李德智. 航天医学与医学工程. 2011
[3]. 层粘连蛋白受体Ⅰ与hPeriod1相互作用的研究[J]. 汪宇辉, 胡丽娟, 鲁芳, 刘延友, 江舟. 航天医学与医学工程. 2006
[4]. LAMR1与PER1蛋白作用位点的筛选[J]. 常莉, 李文辉, 汪宇辉, 刘延友, 江舟. 现代生物医学进展. 2013
[5]. hper1基因3′端UTR区双荧光素酶报告系统构建[J]. 赵溪岩, 成姝婷, 勾洵, 王正荣, 肖静. 四川生理科学杂志. 2013
[6]. hPer_1bHLH-PAS结构域酵母双杂交系统的构建[J]. 李英明, 汪宇辉, 胡丽娟, 刘延友, 王跃. 航天医学与医学工程. 2004
[7]. hPER1相互作用蛋白的筛选及与近日节律关系的研究[D]. 胡丽娟. 四川大学. 2006
[8]. RNAi干扰技术在生物节律相关基因hper1和clock研究中的应用[D]. 叶珊. 四川大学. 2007
[9]. hPER1-NLS:一种新型穿膜多肽的研究[J]. 郭勇, 程牛亮, 王晓霞, 刘志贞, 解军. 山西医科大学学报. 2002
[10]. hPeriod1_(PAS)结构域相互作用蛋白的筛选和研究[J]. 鲁芳, 胡丽娟, 汪宇辉, 刘德松, 刘彦友. 航天医学与医学工程. 2006