李俊刚[1]2004年在《人肝细胞可回复永生化逆转录病毒载体的初步研究》文中研究表明背景和目的:肝细胞材料已成为限制生物人工肝(bioartificial liver, BAL)及肝细胞移植(hepatocytes transplantation, HTX)发展的瓶颈问题,这一问题的解决必将大大提升BAL及HTX的临床实用价值。理论上讲,人肝细胞(包括成人肝细胞及人胎肝细胞)最为理想,但成人供肝来源极其有限且仅用于肝移植,加之成人肝细胞在体外增殖能力差,故大量获得成人肝细胞是不可能的。胎肝的利用因涉及伦理问题,亦难以推广应用。使用动物肝细胞又存在发生免疫反应及传播动物病毒的危险。肝细胞株(如HepG2、C3A、HHY41、HepZ等)分化功能较原代肝细胞差,且多为瘤源性或由原代肝细胞经病毒转染获得,存在安全性问题。可回复性永生化程序为解决细胞材料问题提供了新的思路及手段。其基本原理是先将永生化基因猿猴病毒40大T抗原基因(simian virus 40 large T antigen gene, SV40T)导入原代细胞以获得永生化细胞株,使其获得体外增殖能力,然后再以特异性位点重组技术切除SV40T基因,使细胞株回复到永生化前的状态,这样细胞既得到了增殖又不具有致癌性及病毒感染的可能性。根据这一原理,本实验构建了含SV40T的逆转录病毒载体,旨在为人肝细胞的可回复永生化奠定基础。本研究共分叁部分进行:第一部分为菌落聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)筛选重组阳性克隆方法的建立,旨在为构建载体的快速鉴定提供有效手段;第二部分为SV40T外显子的拼接和pLLTSN的构建,旨在删除其内含子并缩短外源基因DNA的长度,以利于后续基因的插入;第叁部分为可回复永生化逆转录病毒载体pLNCTIGlox的构建,旨在为肝细胞的可回复永生化奠定基础。方法:1.采用合成的loxP正义单链为上游引物,载体互补的序列为下游引物并直接以菌落为模板进行PCR对插入LoxP序列的重组阳性克隆进行鉴定,并用酶切法鉴定loxP序列重组阳性克隆,两者效果作对比分析。2.以质粒 pUC19-SV40T为模板,高保真PCR分别扩增SV40T的两个外显子。国家自然科学基金资助课题(编号:30100080)
马娜[2]2016年在《树鼯肝细胞永生化方法的建立及ITH6.1细胞系特性分析》文中研究表明肝脏疾病是一系列严重危害人类健康的疾病,合适的动物模型仍然为许多药物筛选和疫苗开发所急需。相对于小鼠、大鼠等啮齿类动物,树鼩是一种与灵长类亲缘关系更为接近的小型动物,因此具有其独特的应用价值。由于与人相似的肝炎药物靶向基因以及能够感染以人类为特定宿主的嗜肝性病原体(如肝炎病毒等),树鼩肝细胞具备了与人肝细胞很多相似的特点。然而,树鼩这一研究模型还有许多不成熟、需要被优化的地方。例如种群不均一、实验周期长,常常会导致实验结果偏差较大、可重复性差。同时,利用原代树鼩肝细胞进行研究也受到诸多限制,因为肝脏是一种处于分化末端的器官,即使经过较为费时费力的操作获得原代肝细胞,细胞在体外培养数天后就会死亡,很难进行耗时较长的基因导入或基因编辑等实验研究。由于目前还没有建立树鼩永生化肝细胞系的先例,因此本研究以建立永生化树鼩肝细胞系为目的,通过向体外树鼩原代肝细胞导入外源性基因,成功建立了树鼩肝细胞永生化的方法。随后,本研究对一株永生化树鼩肝细胞系ITH6.1 (immortalized tupaia hepatocyte 6.1)进行了特性分析,研究显示：该细胞有着较强的增殖能力,连续传代超过100次后,仍保持相对稳定的细胞特性。进一步对ITH6.1进行基因测序、蛋白表达、生化指标等特性分析,结果显示了ITH6.1具有典型的树鼩肝细胞特性。同时致瘤性实验等安全性检测也提示了该细胞系具有较好的生物安全性。树鼩永生化细胞系的建立不但减少了实验动物的使用量,提供了一种更为稳定的实验研究对象,同时也将为树鼩动物肝病模型的优化提供更为方便快捷的体外预分析系统。
李爱民[3]2012年在《人工肝新型生物材料的初步探索》文中提出研究背景和目的我国是一个“肝病大国”,各种肝病引起的急性肝功能衰竭是一种严重的临床综合征,其致死率高达60%-90%[1]。生物人工肝(bioartificialliver,BAL)作为肝功能衰竭病人的有效治疗措施及肝移植前的替代手段,受到广泛关注而成为当前研究热点[2-5]。BAL是以人工培养的肝细胞为基础构建的体外反应装置,其生物学支持作用主要来源于肝细胞的合成、代谢和解毒等功能,因此生物材料即肝细胞源是BAL的核心部分[6]。理想的BAL生物材料应具备:(1)人源性;(2)表型正常;(3)易于获得;(4)易于培养且能迅速生长至高密度;(5)具有良好的分化状态及成熟肝细胞的全部生物代谢功能[7]。但是现在尚无任何一种细胞材料能满足以上所有条件。目前常用的生物材料及缺陷主要有:(1)新鲜分离的成人原代肝细胞,具备肝细胞的所有功能,无疑是BAL最理想的生物材料,但由于来源严重缺乏,体外难以增殖,而无法实现临床普及应用。(2)异种肝细胞,主要应用的是猪肝细胞,有多种进入临床试验阶段的BAL都采用它作为生物材料,但由于可能引起异种蛋白反应和动物源性传染病,许多欧洲国家已明确禁止猪肝细胞用于BAL。(3)人源性肝细胞株,包括两种,一是肿瘤来源的肝细胞株,它们来源广泛,具有正常肝细胞的某些功能,培养后能迅速达到人工肝治疗的数量需求[8],但其潜在的致瘤危险性难以完全排除;二是基因工程技术获得的永生化肝细胞,主要通过病毒载体将SV40LT或hTERT等永生化基因导入肝细胞而构建,但是SV40LT也存在潜在的致瘤性,病毒载体还可能导致不可预知的细胞遗传障碍[9]。(4)其他,如肝干细胞,由于其分离培养及诱导分化技术尚未成熟,要进入应用研究阶段时日尚早。由于缺乏理想的生物材料,BAL技术现尚难成为可靠、有力的治疗手段,但是研究者仍然相信随着研究的不断深入,BAL最终将会为急性肝衰竭的治疗带来革命性的变化。本研究论文在既往研究的基础上,着重对如何提高人源性肝细胞株的安全性问题,提出了自己的观点,并作出了初步的探索。首先针对肿瘤来源的肝细胞株,提出了利用高分化肝癌组织或良性病变肝脏组织构建新型人源性肝细胞株;其次,针对基因工程获取的永生化肝细胞株,提出了基于piggyBac的新型肝细胞永生化载体系统;最后,我们还对硝酸纤维素(NC)膜做为BAL肝细胞源生长的支持材料的可能性进行了初步研究。总之,最终为解决理想生物材料缺乏这一制约BAL发展的问题作出努力。方法1、不同人肝细胞株肝脏功能水平的比较研究。收集南方医院手术切除肝脏标本病变周围的非肿瘤组织,采用本课题组申请有专利技术的肝细胞分离器械盒(专利号:201120133192.5)进行原代成人肝细胞的分离,含15%胎牛血清的RPMI-1640培养基常规条件下培养。提取12种人肝细胞株及原代成人肝细胞的RNA后,采用实时定量PCR技术检测12种肝脏功能相关基因mRNA的表达。上述细胞爬片后,通过细胞免疫荧光技术检测细胞功能相关蛋白ALB、CYP 2E1的表达,同时收集细胞培养上清采用全自动生化分析仪测定上清中白蛋白及尿素氮的含量。2、不同分化程度肝脏肿瘤组织的肝脏功能水平的比较。收集2009年1月-2011年12月期间在南方医科大学南方医院肝胆外科行外科手术切除的34例患者的肝脏组织标本,包括高分化肝癌组织12例、低分化肝癌组织12例、病变周围相对正常肝组织12例(有2例与上述肝癌组织取自同一患者)。提取组织RNA后,采用实时定量PCR技术检测上述叁类组织肝脏功能相关基因mRNA的表达。同时采用免疫组织化学染色技术检测细胞功能相关蛋白ALB、CYP2E1的表达。3、新型人源性人工肝用肝细胞株的构建。细胞分离程序参照上述原代成人肝细胞的分离,培养基采用含20%胎牛血清的DMEM,0.25%胰酶消化传代。采用上述实时定量PCR技术、免疫细胞化学技术及上清检测评价肝脏功能相关指标表达情况,并与原代成人肝细胞及C3A细胞相比较。4、无病毒可回复性肝细胞永生化载体的构建及应用。重迭延伸PCR技术扩增 attB1-Kozak-hTERT (前端)-attB2 和 attB1-hTERT (后端)/E2A/eGFP/F2A/neo-attB2,对相应大小条带切胶回收后,通过Gateway重组克隆技术BR反应和LR反应,以及酶切连接,构建最终目的载体PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo。随后将永生化载体PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo和载体pCAGG-PBase共转染HL-7702细胞后,检测其hTERT基因的表达情况。5、NC膜作为BAL细胞生长支架材料的研究。将BAL用细胞材料接种于NC膜上,通过扫描电镜技术及HE染色技术观察其生长情况,流式细胞术及LDH测定评价细胞凋亡情况,免疫细胞化学技术等观察部分肝脏功能蛋白的表达情况。同时以盖玻片或培养板等普通培养介质作为对照。6、统计分析。统计学方法采用SPSS13.0软件,对于mRNA的表达水平的组间差异,方差齐性检验后行多个独立样本的非参数检验;对于计数资料采用行列表资料的X2检验;对于LDH漏出检测分析,组间差异采用两因素的方差分析;对于凋亡检测分析,组间差异采用两样本的t检验,P< 0.05被认为差异有统计学意义。结果1、不同人肝细胞株肝脏功能水平的比较研究。实时定量PCR检测结果显示现有12种人肝细胞株12个肝脏功能相关基因的mRNA表达水平均远远低于原代成人肝细胞的表达水平,且不同肝细胞株之间差异较大,其中HepG2、C3A和Hep 3B2.1-7肝细胞特异性功能相对较好,尤其是合成功能,细胞免疫荧光证实了部分相关基因的蛋白水平表达,培养上清中白蛋白和尿素氮的含量与实时定量PCR检测结果基本相符。2、不同分化程度肝脏肿瘤组织的肝脏功能水平的比较。实时定量PCR检测结果显示肝脏合成、代谢和解毒相关的12个基因的mRNA表达水平除GST-π外,高分化肝癌组织、低分化肝癌组织和癌旁组织之间差异具有统计学意义(X2≥16.635, P<0. 001),而且癌旁组织高于高分化肝癌组织高于低分化肝癌组织。免疫组化检测肝细胞特异性功能相关蛋白ALB、CYP2E1的表达情况与实时定量PCR检测结果基本相符。3、新型人源性人工肝用肝细胞株的构建。利用高分化肝癌和良性病变肝脏组织分别构建两株BAL用肝细胞材料,分别命名为NHBL1和NHBL2。NHBL1细胞经实时定量PCR检测显示在12个肝脏功能相关基因中,GST-π的mRNA表达水平比C3A细胞略高,但其他指标均不同程度的低于C3A细胞,其中相差在1倍之内的有AAT、TF、G6P,2倍之内的有ALB、TTR、CYP 3A4,5倍之内的有CPS-1,CYP 3A,其他指标差距均超过5倍。培养上清中单细胞ALB生成量分别为 2.200×10-5g/L,0.277×10-5g/L,0.496×10-5g/L,BUN 生成量分别为 1.965×10-5mmol/L 0.109×10-5mmol/L, 0.237×10-5mmol/L。NHBL2 细胞来源为36岁男性肝癌患者的癌旁肝组织,已传25代。通过实时荧光定量PCR分析,我们发现ALB,ATT, TF,TTR,TAT和CYP3A4的水平比C3A细胞略低,其他六个指标均高于C3A细胞。4、无病毒可回复性肝细胞永生化载体的构建及应用。PCR及酶切和测序鉴定均证实成功构建了肝细胞永生化载体PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo,目的基因序列与GenBank报道一致,并将其与载体pCAGG-PBase成功转染至HL-7702 细胞。5、NC膜作为BAL细胞生长支架材料的研究。扫描电子显微镜下NC膜的形态:低倍镜下NC膜表面较为平整光滑,高倍镜下NC膜呈现海绵样空间立体结构,膜孔径精确度高,具有均一的孔径。HE染色并透明处理后镜下观察细胞在NC膜和玻片上呈现高贴壁状态,细胞逐渐增殖,细胞形态一致,扫描电镜下也呈现出类似的表现。生长在NC膜上细胞的凋亡情况与普通介质之上的无明显差异(F=0.267, P=0.609)。免疫细胞化学染色显示功能相关蛋白仍正常表达。结论1、研究中认为现有各种人源性肝细胞株与理想BAL生物材料的差距仍较大,主要是高度恶性肿瘤组织来源,安全性顾虑较大,而且功能上还远远无法达到正常成人肝细胞的水平。2、研究中筛选出两株高分化肝癌和良性病变肝脏组织来源的细胞株,功能水平接近于C3A细胞,但一定程度上降低了应用的安全性顾虑,同时也为构建新型人工肝细胞材料提供了一种新的思路。3、研究中建立了一种基于piggyBac转座酶的新型肝细胞永生化载体系统,与传统永生化技术相比主要优势在于无病毒载体的参与,因而更适于下一步的临床应用。4、研究中初步论证了 NC膜对BAL用细胞材料生长的支持作用,为新型人工肝支持系统生物反应器的构建提供了实验依据。
孟凡迎[4]2010年在《人原代肝细胞的分离、培养及可逆性永生化》文中研究说明第一部分：前期实验——猪原代肝细胞的分离、培养及可逆性永生化[目的]建立大动物肝组织灌流分离原代肝细胞的方法；建立用携带永生化基因的逆转录病毒感染原代肝细胞实现肝细胞可逆性永生化的方法。[方法]采用改良的四步循环灌流法分离乳猪肝细胞,然后用SSR#69包装细胞释放的携带Cre/LoxP系统／SV40T及潮霉素抗性基因的逆转录病毒感染猪原代肝细胞,潮霉素筛选阳性克隆细胞团,克隆环挑选目的克隆增生细胞团进行单独传代培养。最后添加Cre重组酶,切除两个LoxP位点间的永生化基因SV40T,实现永生化的逆转。[结果]我们共获得6块大小合适的猪肝组织,成功分离获得活性很高的大量原代猪肝细胞(产量：9.4±7.5×106／g肝组织；活性：94.6±4.2%)。在此基础上利用SSR#69释放的含有SV40T的逆转录病毒转染猪肝细胞获得成功,永生化的肝细胞具有正常肝细胞的形态特点,能传代培养。加入Cre重组酶逆转永生化后,肝细胞停止增生。[结论]我们建立了大动物肝组织四步循环灌流法分离原代肝细胞,并成功实现了用携带永生化基因SV40T的逆转录病毒转染猪原代肝细胞,获得了永生化的猪肝细胞。第二部分：人原代肝细胞的分离、培养[背景及目的]药物代谢实验、生物人工肝及细胞移植等均需要大量的人肝细胞,而目前国际上利用外科手术切除后废弃的健康肝组织分离原代肝细胞的经验尚少。本部分实验旨在建立一种高效利用手术切除后废弃的健康肝组织分离人原代肝细胞的方法。[方法]收集良性肝病患者外科手术切除后废弃的健康肝组织,采用我们自己建立的改良四步循环灌流法分离人原代肝细胞。同时评价获取肝组织的重量、冷热缺血时间等对肝细胞分离效果的影响。[结果]我们共获得13块合适的健康肝组织,其中肝血管瘤患者10例,肝内胆管结石患者3例。所有患者查HCV-Ab、HIV-Ab及HBV-Ag均为阴性。患者手术前肝功能(ALT, ALB等)均在正常水平,平均年龄47岁(23—57岁),血型：O+型4例,A+型6例,AB+型1例,B+型2例。肝组织块重量为27.2±7.8g(15—42g)。热缺血时间(WIT) 10-35min,、所有13例组织块的冷缺血时间(CIT)均<35 min。分离获得的细胞产量为4.8±2.1×106／g肝组织,台酚蓝染色后用血球计数板测肝细胞活率为78.1±10.4%(62%-93%)。[结论]1,良性肝病(主要是肝血管瘤及肝内胆管结石)行部分肝切除后废弃的周边正常肝组织,可以采用改良的四步循环灌注法分离获得大量活性好的人肝细胞。2,对于存在中度以下纤维化的肝组织,如果切缘血管条件好,仍可以有很好的细胞分离效果。3,应尽量缩短获取肝组织的热缺血时间,提高肝细胞分离效果。4,对于较小的肝组织块,切面血管条件欠佳者,采用四步循环灌流法分离肝细胞效果欠佳。第叁部分：人肝细胞的可逆性永生化[背景及目的]人原代肝细胞体外培养时增殖困难,且存在培养时间短,不能及时获得等缺陷,使其应用受到很大的限制。具有正常肝细胞功能的永生化人源肝细胞,能够解决细胞来源紧缺的难题。本部分实验旨在利用逆转录病毒实现SV40T单个永生化基因的转染,构建人源肝细胞的可逆性永生化。[方法]用SSR#69包装细胞释放的携带Cre/LoxP系统／SV40T及潮霉素抗性基因的逆转录病毒转染人原代肝细胞,7天后用潮霉素筛选阳性克隆细胞团,用合适大小的克隆环挑选目的克隆增生的细胞团进行单独传代培养。最后添加Cre重组酶,以切除两个LoxP位点间的永生化基因SV40T,实现永生化的逆转。RT-PCR及免疫荧光染色验证永生化基因SV40T的存在。[结果]逆转录病毒转染7天,潮霉素进行筛选14天后,培养瓶中出现大量克隆增生的细胞团,形态类似肝细胞。克隆环挑选至新培养瓶中单独培养,细胞能传代培养并保持形态规则。添加Cre重组酶后逆转永生化后,细胞即停止生长。RT-PCR检测永生化细胞具有人原代肝细胞的标志基因,免疫荧光染色亦验证永生化细胞内SV40T的存在。[结论]我们建立的可逆性永生化人源肝细胞,具有肝细胞的功能,体外能传代培养。更重要的是,我们成功实现了逆转录病毒单永生化基因转染人原代肝细胞的方法,为后继实验进行人肝细胞SV40T/hTERT双永生化基因转染,实现人源肝细胞的彻底永生化奠定方法学基础。
吴惠玲[5]2008年在《Cre/LoxP系统联合SV40LTAg或SV40LTAg、hTERT致大鼠胰岛β细胞可复性永生化》文中研究表明背景和目的:无论是1型糖尿病或2型糖尿病患者,或早或晚都要进入烦琐的胰岛素替代治疗阶段,其共同原因是胰岛细胞数量的下降导致胰岛素分泌的缺乏。胰岛移植被认为是目前可能治愈糖尿病的最有效方法之一。而理想的供体胰岛细胞来源的匮乏是胰岛移植相关研究的重要障碍。原代胰岛细胞体外增殖能力差,研究者利用各种生长因子与胰岛β细胞共孵育,其增殖仍然有限,而且随着细胞的衰老与去分化,细胞群也逐渐丧失其原有表型与胰岛素分泌功能。研究者利用猿猴病毒大T抗原基因(simian virus 40 large T antigen gene,SV40LTAg)或人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)诱导细胞发生永生化,可增加原代细胞的体外扩增能力。但是,原癌基因长期存在于细胞内,具有潜在的致癌危险性,而且,永生化细胞的表型及功能特性与原代细胞相比,往往相差甚远。将已经得到成熟、广泛应用的条件基因敲除技术――Cre/LoxP系统,联合转基因技术诱导细胞永生化,又称可回复性永生化技术(reversible immortalization),为解决胰岛β细胞的材料问题提供了新的思路及手段。其基本原理是,构建含永生化基因及其侧翼带两同向LoxP序列的重组载体,对原代细胞进行转染,使之发生永生化,得到相当数量细胞后,利用位点特异性重组酶Cre识别特异性位点LoxP,从而切除位于两同向LoxP序列之间的永生化基因,使细胞回复到永生化前的状态。这样既解决了原代细胞的体外增殖问题,又克服了由于永生化基因保留在细胞内,使得细胞安全性差、功能分化差的缺点。目前已陆续有研究者借助该项技术,诱导获得肝细胞、成纤维细胞、嗜铬细胞、神经干细胞等可回复性永生化细胞。有研究表明,单独转染hTERT,不足以促进体外培养的胰岛β细胞或角质化细胞的大量增殖。提示:hTERT致细胞永生化可能存在组织特异性。另有研究提示,无论是端粒依赖的还是非端粒依赖途径的细胞增殖与衰老的模型中,p16~(INK4A)、p21~(CIP1/WAF1)均具重要作用。而SV40LTAg与p16/Rb、p53/p21通路均具作用,因此,本研究拟将SV40LTAg单独转染入大鼠胰岛β细胞,以获得永生化的胰岛β细胞。此外,虽然单独转染hTERT未能促进β细胞的大量扩增,但如果将SV40LTAg、hTERT同时转染入胰岛β细胞,与单独转染SV40LTAg相比,两者的表型与生物学性状不知是否有所区别。为寻求一种简便的、实用的理想技术手段,以获得可大量扩增的、安全有效的胰岛β细胞,因此,本研究拟利用Cre/LoxP系统联合SV40LTAg或SV40LTAg、hTERT分别致大鼠胰岛β细胞可回复性永生化,待其体外大量扩增后,以Cre重组酶识别LoxP序列,切除永生化基因,获得回复后细胞。对两种回复后细胞的表型、功能及致瘤性等进行研究,为解决胰岛β细胞的材料问题提供实验基础。方法:(1)构建可回复性永生化逆转录病毒载体phTERT-I-GTKlox(含hTERT),鉴定可回复性永生化逆转录病毒载体pLCRSTP(含SV40LTAg、Cre-ER)。(2)采用胆总管内插管、胶原酶灌注消化及Ficoll400梯度离心法分离纯化原代大鼠胰岛,以DTZ染色、AO-PI染色、胰岛素与Pdx-1免疫荧光双标染色鉴定大鼠胰岛的纯度及活率。(3)以Phoenix A包装细胞,分别包装pLCRSTP、phTERT-I-GTKlox逆转录病毒颗粒。(4)以pLCRSTP逆转录病毒上清感染原代大鼠胰岛细胞,以有限稀释法最终获得永生化胰岛β细胞克隆,LT-β;以phTERT-I-GTKlox逆转录病毒上清感染LT-β(P4),以有限稀释法最终获得永生化胰岛β细胞克隆,LT-hTERT-β。对永生化β细胞LT-β、LT-hTERT-β进行培养与传代,分别传至第20代。(5)以他莫昔芬诱导Cre-ER移入细胞核,将永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20)中的永生化基因及Cre-ER基因自身切除,以更昔洛韦筛选,最终分别获得相应回复后β细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β。(6)分别以PCR、RT-PCR、Western blot、免疫荧光双标染色,在DNA、mRNA、蛋白水平,检测SV40LTAg、Cre-ER基因在永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20)中的整合、表达与细胞内定位,以及在回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β中的彻底切除;以同法检测hTERT基因在永生化细胞LT-hTERT-β(P20)中的整合、表达与细胞内定位,以及在回复后细胞R-LT-hTERT-β中的彻底切除;激光共聚焦显微镜下观察永生化细胞LT-hTERT-β(P20)、回复后细胞R-LT-hTERT-β中EGFP的表达。(7)永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20)及回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β的功能及致瘤性的研究:以MTT比色法测定细胞生长率;以葡萄糖刺激的胰岛素释放试验检测其胰岛素释放量及胰岛素释放指数;以半定量RT-PCR法检测其Pdx-1、生长抑素、胰高血糖素mRNA的表达;以免疫荧光双标染色法检测其胰岛素、Pdx-1的表达及细胞内定位;以染色体核型分析、平板克隆形成实验、裸鼠致瘤性实验检测其致瘤性。结果:(1)成功构建并鉴定可回复性永生化逆转录病毒载体phTERT-I-GTKlox,成功鉴定可回复性永生化逆转录病毒载体pLCRSTP的正确性。(2)成功分离纯化获得纯度、活率均较高的原代大鼠胰岛,该胰岛细胞群富含具有正常胰岛素、Pdx-1合成能力的胰岛β细胞。(3)成功获得稳定包装pLCRSTP逆转录病毒颗粒的包装细胞pLCRSTP-Phoenix A。(4)成功诱导获得两种永生化胰岛β细胞,LT-β及LT-hTERT-β。(5)以Cre-ER/LoxP系统成功切除永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20)内的永生化基因及Cre-ER基因自身,获得两种回复后β细胞,R-LT-β及R-LT-hTERT-β。(6)分别检测到Cre-ER、SV40LTAg、hTERT基因在永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20)内的稳定整合、表达以及各自在细胞内的准确定位;成功鉴定了Cre-ER、SV40LTAg、hTERT基因在回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β内的彻底切除。永生化细胞LT-hTERT-β(P20)内成功检测到EGFP的稳定表达,回复后细胞R-LT-hTERT-β内检测不到EGFP的表达。(7)细胞生长率的测定:永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20)生长增殖旺盛,与原代细胞相比,其细胞增殖速度均显着加快,群体倍增时间均显着缩短(P <0.01);两种永生化细胞之间相比较,无统计学差异。回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β生长增殖有限,其群体倍增时间较永生化细胞显着延长(P <0.01),与原代细胞之间相比无统计学差异。(8)葡萄糖刺激的胰岛素释放试验的检测:无论低糖、高糖条件下,永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20)的胰岛素释放量均较低,回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β的胰岛素释放量均显著增高(P <0.01);两种回复后细胞的胰岛素释放量与原代胰岛细胞相比,均无统计学差异。永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20)的胰岛素释放指数均较低。回复后细胞R-LT-β的胰岛素释放指数较永生化细胞LT-β(P20)显着增高(P <0.01),回复后细胞R-LT-hTERT-β的胰岛素释放指数较永生化细胞LT-hTERT-β(P20)亦显着增高(P <0.05)。两种回复后细胞的胰岛素释放指数与原代胰岛细胞相比,均无统计学差异。在低糖、高糖刺激下的胰岛素释放量以及胰岛素释放指数方面,两种永生化细胞之间相比较,两种回复后细胞之间相比较,均无统计学差异。(9) Pdx-1 mRNA的半定量RT-PCR结果:永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20)内Pdx-1 mRNA表达量均较低。回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β内Pdx-1 mRNA表达量虽然较原代细胞低(P <0.01),但分别为原代细胞表达量的0.89与0.91倍,且与永生化细胞相比,均显着增高(P <0.01)。两种永生化细胞内Pdx-1 mRNA表达量相比较,两种回复后细胞之间相比较,均无统计学差异。(10)胰高血糖素、生长抑素基因mRNA的RT-PCR结果:无论永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20),或回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β内,均未检测到胰高血糖素或生长抑素mRNA的表达。(11)回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β内,胰岛素、Pdx-1均能正常表达,细胞内定位准确,与原代大鼠胰岛细胞内胰岛素、Pdx-1的表达相似。(12)染色体核型分析:永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20)及回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β内,均为正常二倍体核型,未见异常核分裂相。平板克隆实验结果:回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β,均未见克隆形成。裸鼠致瘤性分析:回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β,移植处皮肤局部均未见肿块形成;移植处皮肤局部及相应各内脏的组织切片,均未见异常增生细胞。结论:(1)以“一步法”转染pLCRSTP(含SV40LTAg、Cre-ER)成功获得可回复性永生化胰岛β细胞LT-β,以“两步法”转染pLCRSTP(含SV40LTAg、Cre-ER)及phTERT-I-GTKlox(含hTERT)成功获得可回复性永生化胰岛β细胞LT-hTERT-β,此两种永生化β细胞均可在体外持续增殖、长期稳定传代。(2)以Cre-ER/LoxP系统成功切除永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20)内的永生化基因及Cre-ER基因自身,成功获得相应回复后β细胞:R-LT-β及R-LT-hTERT-β。(3)回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β,其胰岛素的合成及分泌功能较永生化状态下的细胞显着增高,与原代胰岛细胞一致;其Pdx-1 mRNA的表达量较永生化细胞显着增高,分别为原代细胞表达量的0.89与0.91倍;未见胰高血糖素、生长抑素mRNA的表达,未发现致瘤性,具有良好的表型及功能。(4)在细胞生长率,低糖、高糖刺激下的胰岛素释放量与胰岛素释放指数,Pdx-1 mRNA表达量方面,两种永生化细胞LT-β(P20)、LT-hTERT-β(P20)之间,两种回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β之间,未发现差异。
毕杨, 何昀, 黄佳祎, 张琴, 王瑜伟[6]2008年在《携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体的构建与结构鉴定》文中研究说明目的构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化。方法去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒。先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基因Blasticidin上游获得pSEB-LoxP-SV40T质粒。同时将CD自杀基因定向克隆至pSEB-HUS的eGFP下游;然后设计一段HSV-tk自杀基因引物,在上游引物的5′端加入方向一致的LoxP序列。PCR获得TK基因后,定向克隆至CD下游获得pSEB-CD-TK,最后将pSEB-CD-TK上的双自杀基因亚克隆至pSEB-LoxP-SV40T质粒上得到携带双自杀基因及SV40T的质粒。结果PCR及酶切鉴定均证实两个自杀基因及SV40T正确克隆至逆转录病毒质粒中,目的基因序列与GenBank报道一致,两个LoxP位点方向相同。结论成功构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体。
姚文芳[7]2007年在《可逆性永生化正常成人肝细胞rSSR#69/HL-7702的构建及其生物学特性的测定》文中研究说明肝功能衰竭的发生率和死亡率甚高，目前缺乏有效的治疗手段。国内外动物实验及初步临床研究证明：采用猪肝细胞或肝癌细胞的生物型人工肝，可以暂时地或部分地替代衰竭肝脏的功能。但动物源性细胞仍存在着免疫反应、人畜共患病及伦理学的担心；而肝癌细胞可能存在功能幼稚及致瘤性的危险。正常人肝细胞应是生物型人工肝最理想的细胞来源。但人胚胎肝细胞功能幼稚并存在伦理学问题；正常成人肝细胞在体外的增殖能力十分有限，难以大规模培养获得足量的肝细胞用于人工肝治疗。尝试建立永生化人肝细胞，有望解决这一难题。20世纪60年代初从猿猴肾细胞中发现的SV40(simianvirus40)病毒，具有调节细胞周期调控点、使细胞进入永生化状态的作用，已广泛用于多种哺乳动物细胞的永生化(如骨髓、涎腺、乳腺、前列腺、食管等)。但永生化细胞存在过度增殖致瘤的危险。近来有研究发现在细胞中导入HSV-tk自杀基因，在更昔洛韦的作用下，该细胞内脱氧核糖核酸的合成可中止，避免细胞的致瘤性。有研究发现转导Cre酶的重组腺病毒后，可切除SV40T基因，使细胞产生“去永生化”效应。本研究拟在正常成人肝细胞HL-7702中导入SV40T永生化基因和HSV-tk自杀基因，以构建可逆性永生化正常成人肝细胞(rSSR#69／HL-7702肝细胞)。旨在增加肝细胞的增殖活力，以通过体外培养获得大量的肝细胞，并在需要时可诱导其去永生化。研究采用逆转录病毒载体的方法，将SV40T永生化基因和HSV-tk自杀基因导入正常成人肝细胞HL-7702内；分别采用RT-PCR法、间接免疫荧光法和Western blot法，在基因水平及蛋白水平，鉴定转染后肝细胞内SV40T永生化基因及其表达；采用更昔洛韦药物敏感试验检测转染后肝细胞内HSV-tk自杀基因的存在；采用MTT染色法和流式细胞法，检测转染前后肝细胞的增殖的生长曲线和细胞周期；采用RT-PCR法检测转染后细胞内存在的肝细胞特有的功能基因；采用Western blot法检测肝细胞内细胞色素P450酶蛋白；在相差显微镜下观察细胞的生长形态；用透射电镜观察肝细胞超微结构。结果：(1)RT-PCR法、间接免疫荧光法和Western blot法显示：所构建的可逆性永生化正常成人肝细胞rSSR#69／HL-7702内存在SV40T永生化基因并能表达；(2)更昔洛韦药物敏感试验表明：转染后的rSSR#69／HL-7702肝细胞内存在HSV-tk自杀基因；(3)RT-PCR法检测结果表明转染前后的肝细胞均存在肝细胞特有的功能基因，如白蛋白、糖原合成基因等；(4)生长曲线和细胞周期测定结果显示转染后的rSSR#69／HL-7702肝细胞的增殖活力高于未转染的肝细胞；(5)光镜下和电镜下转染前、后肝细胞的形态和超微结构无明显差异；(6)肝细胞培养上清液的测定表明转染前、后肝细胞的一般生化功能和利多卡因转化功能无明显差异；(7)Western blot法检测结果显示：转染前、后的肝细胞均可表达细胞色素P450酶蛋白；(8)转染前、后的肝细胞培养上清液中未检测出甲胎蛋白。本研究构建了含有SV40T永生化基因和HSV-tk自杀基因的可逆性永生化正常成人肝细胞rSSR#69／HL-7702；该细胞增殖能力提高；其形态及生物学功能与转染前的正常人肝细胞HL-7702无明显差异；并且未检出幼稚肝细胞分泌的甲胎蛋白。提示该细胞有望解决人肝细胞来源稀少的难题，为生物型人工肝治疗肝衰提供更加理想的人肝细胞源，值得进一步研究。
徐哲[8]2003年在《微载体粘附培养肝细胞的生物学特性及其移植治疗大鼠急性肝衰竭的实验研究》文中研究指明近年来对急性肝功能衰竭的治疗进展甚微，急性肝功能衰竭病死率依然维持在60％～80％这一令人难以接受的水平。 原位肝移植为急性肝功能衰竭的有效疗法。然而，由于供肝短缺、高费用、高风险、技术要求高、术后需终生免疫抑制治疗等缺点，原位肝移植的实施受到了极大的限制。 为此研究者们提出体外肝脏灌注、生物型人工肝、肝细胞移植等技术，以期为肝功能衰竭患者度过肝脏供体等待期或为肝脏自行修复提供代谢支持。与OLT比较，肝细胞移植操作技术简单、侵袭性小、费用相对低廉、风险小，移植肝细胞可发挥肝脏解毒、合成功能。因此，肝细胞移植有着良好的发展前景。 肝细胞的质与量为肝细胞移植研究中的关键问题，如何方便的获得足够数量和功能良好的肝细胞已成为广大学者关注的焦点。微载体培养技术作为一项体外高密度细胞培养技术，兼有单层培养和悬浮培养的优点，已被用于多种贴壁细胞的培养。 本实验对原代SD大鼠肝细胞行微载体粘附培养、观测其生物学特性，第四军医大月卜布反创匕学位士仑文并将微载体粘附培养肝细胞移植到D一GalN诱导的急性肝功能衰竭大鼠腹腔内，观察其存活率、肝功能生化指标及肝脏病理改变，以评估微载体粘附肝细胞腹腔内移植的疗效，为肝细胞材料的研究打下一定的实验基础，为微载体粘附培养肝细胞移植的临床应用提供实验依据。实验结果如下1.采用Seigen改良二步灌注法，平均每只大鼠分离到的肝细胞数为(1 .21士0.45)xlos，台盼蓝染色示平均活力为93.6%士2.8%。微载体粘附培养肝细胞的正常形态及白蛋白、尿素合成功能可维持1周以上，LDH漏出量、白蛋白及尿素水平一周内呈波动性变化，在培养第3天白蛋白及尿素水平最高、LDH漏出量最低。2.根据不同剂量组(l .8、2.0、2.2叭g)不同时间实验大鼠的临床表现、存活率、肝脏生化指标及肝脏病理方面的变化，选用2.0叭gD一GalN，腹腔注射后24小时作为制备成年SD大鼠急性肝衰竭模型的最适药物剂量和最佳时间。3.微载体组(组3)存活率明显高于空载体组(组l)的同期存活率，移植5天后及以后各时间点两组率比较有显着统计学差异(P<0.05)。微载体粘附肝细胞腹腔内移植组移植14天后57.1%大鼠存活，肝细胞悬液组移植14天后大鼠存活率为41.7%，而同期空载体组大鼠存活率仅巧.4%。4.微载体组肝功能各项指标逐渐下降，移植5天以后肝功能各项指标渐趋正常，与移植第1日有显着统计学差异(P<0.05)。空载体组肝功能各项指标无下降趋势，总胆红素及ALT水平于移植第3日达最高峰。微载体组移植后第3、5天肝功能各项指标均低于空载体组同期水平，两组TBIL水平比较有显着统计学差异(P<0.05)。5.微载体组移植后载体在大鼠上腹部聚集成团，HE染色示肝细胞在微载体周围成团，在移植后第9天这些团块仍能观察到。细胞悬液组移植后肝细胞被大网膜包裹，可短期存活。微载体组肝脏组织学检查示:移植第3一3一第四军医大学布皿士学位士仑文天后肝组织损伤逐渐恢复，移植14天后肝脏除小范围点状坏死外、肝脏基本恢复正常。空载体组幸存鼠的肝脏病变恢复较微载体组及细胞悬液组慢。 结论:胶原酶消化法是肝细胞分离的可行方法，微载体培养肝细胞兼有单层培养及悬浮培养的优点，微载体培养肝细胞在培养第3天有较好功能。腹腔内移植微载体粘附培养肝细胞可对急性肝衰竭大鼠提供代谢支持作用，显着提高急性肝衰竭大鼠的存活率、改善肝功能、减轻肝脏病理改变。
顾劲扬[9]2009年在《骨髓间充质干细胞与肝细胞共培养的实验研究》文中研究表明急性肝功能衰竭是一类死亡率极高的综合征候群。近年来,生物人工肝(bioartificial liver, BAL)支持系统已成为延长急性肝功能衰竭患者生命,并向肝移植手术过渡的一种替代性治疗手段。其中,肝细胞是BAL的生物核心材料,BAL对肝功能衰竭患者的支持作用有赖于所用肝细胞的生物学特性。因此,如何获得更接近正常人肝细胞功能、对人体无害且足够数量的肝细胞历来成为BAL领域的研究热点。原代肝细胞是一种高分化细胞,正常生理状态下处于静止期,很难分化增殖,一旦失去体内生存微环境,在体外传统培养过程中极易丧失其结构特征和分化再生能力,呈“去分化”状态。近年来,许多研究证实肝细胞和非肝实质细胞在体外共培养可通过异质细胞间的相互作用充分模拟肝细胞在体内的生存环境,形成缝隙连接、胆管样结构,故可有效延长肝细胞的生存时间,促进肝细胞增殖分化,并保持肝细胞特有的生物学功能。因此,共培养是肝细胞大规模、高活性培养并最终应用于BAL的理想培养方式。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCS)是一类具有自我复制和多向分化潜能的干细胞,既容易分离又易于在体外扩增,以其分泌多种可溶性细胞因子和表达内生性细胞外基质的特点,在骨髓中为造血干细胞的生长、增殖、迁移和分化提供必要的微环境。有鉴于此,骨髓MSCS与肝细胞共培养可能成为BAL的理想细胞来源。本课题旨在明确骨髓MSCS与肝细胞共培养对肝细胞的作用和规律,揭示共培养中肝细胞增殖与凋亡的分子生物学机制,确定共培养体系中肝细胞增殖与凋亡的关键分子靶点,既解决了BAL中肝细胞大规模、高活性和高功能培养问题、为BAL提供最适细胞来源,又为进一步将分子靶向研究应用到肝细胞大规模培养中奠定坚实的理论基础。另外,急性肝功能衰竭的预后取决于并存在患者血浆/血清中的循环再生抑制因子与肝细胞再生因子之间的竞争与对抗,骨髓MSCS与肝细胞共培养体系能否耐受肝功能衰竭血浆/血清的细胞毒性作用、有效发挥肝细胞支持功能是影响BAL效能的关键问题。第一部分肝细胞与骨髓MSCS最适共培养体系的建立和规律研究目的:建立猪肝细胞与骨髓MSCS体外最适共培养体系,为BAL的构建提供理想细胞来源。方法:自中华实验猪(n=3)髂前上棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代,流式细胞仪分别鉴定各代CD29、CD44、CD45和CD90比例。原位两步胶原酶法分离猪肝细胞,台盼兰拒染实验判断肝细胞活率,并采用抗白蛋白和CK18免疫细胞化学染色法鉴定肝细胞纯度。将肝细胞与MSCS分别按照1:1、2:1、5:1和10:1等不同比例随机混合培养,并设立肝细胞与MSCS单纯培养组为对照组。观察各组肝细胞形态和功能变化及随时间变化规律。结果:第3代骨髓MSCS纯度>90%,新鲜分离的肝细胞活率>95%,纯度>99%。倒置显微镜观察发现共培养组肝细胞迅速粘附于MSCS表面,并呈球形聚集生长。电镜观察提示共培养组有大量细胞外基质存在,且肝细胞内超微结构与正常肝细胞接近,异质细胞间可见细胞连接形成。共聚焦显微镜进一步提示异质细胞间形成叁维分层生长。活细胞工作站记录MSCS高迁移性,且与肝细胞聚集生长相关。共培养组肝细胞糖原染色明显强于对照组,抗白蛋白免疫细胞化学染色示实验组肝细胞内白蛋白水平较对照组显着增高。Dead/Live荧光染色见共培养组肝细胞活性较对照组明显改善。肝细胞/MSCS共培养2:1组的白蛋白分泌水平和尿素合成能力为各组中最佳,自第1d共培养起显着高于各组(P<0.05),并在第2d达到高峰,且随后的下降趋势较缓慢。流式细胞仪分选出共培养组肝细胞经Western Blotting检测提示2:1组肝细胞内白蛋白和细胞色素P4503A1合成水平均较其余各组显着增高(P<0.05)。细胞周期检测提示共培养组肝细胞分布于G2-S期的比例较对照组显着增加(P<0.05)。结论:猪肝细胞与骨髓MSC体外共培养可维持肝细胞形态与功能,猪肝细胞与MSC按2:1比例接种培养至第2d可最大程度维持肝细胞功能,为构建功能性BAL提供高效细胞材料。第二部分骨髓MSCS参与肝细胞培养的作用机制研究目的:探索骨髓MSCS来源的细胞外基质和可溶性细胞因子在最适共培养体系中的作用。方法:自中华实验猪(n=3)髂前上棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代;原位两步胶原酶法分离猪肝细胞后与MSCS按照2:1比例随机混合培养至第2d,免疫细胞化学染色观察纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I、III、V型胶原表达水平和胞内外分布情况。合成纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I和V型胶原SiRNA特异性片段分别转染MSCS后再与肝细胞共培养,观察肝细胞特异性功能变化水平。使用Millicell悬挂式小室将猪肝细胞与MSCS按照2:1比例隔离培养,观察非直接接触共培养体系中肝细胞特异性功能变化,检测培养液上清中TNF-α、IL-6和TGF-α水平。抗IL-6中和抗体孵育后的MSCS与肝细胞建立上述共培养体系,检测肝细胞特异性功能变化水平。结果:免疫细胞化学染色提示单纯培养的肝细胞内表达除纤维连接蛋白以外所有细胞外基质,而MSCS胞内外均不表达III型胶原。共培养组肝细胞与MSCS之间分布大量细胞外基质网络,由纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I型和V型胶原组成。Western Blotting检测提示RNAi片段转染MSCS后纤维连接蛋白、层粘连蛋白和I型胶原表达干扰效率超过85%,V型胶原超过50%。各干扰组白蛋白分泌水平和尿素合成水平均较对照组显着下降(P<0.05)。非直接接触共培养组白蛋白和尿素浓度与肝细胞培养组相比较显着升高(P<0.05)。肝细胞组、共培养组、MSCS组上清液中均未检测到TNF-α。TGF-α水平在肝细胞组与共培养组之间没有统计学差异(P>0.05)。共培养组和MSCS组IL-6水平较肝细胞组显着增高(P<0.05),两组之间未见统计学差异(P>0.05)。IL-6中和抗体实验后白蛋白分泌和尿素合成水平较对照组显着降低(P<0.05)。结论:骨髓MSCS通过分泌纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I和V型胶原,以及IL-6共同提高原代肝细胞特异性功能,为组织工程、细胞生物学和BAL的研究提供新手段。第叁部分骨髓MSCS共培养下的肝细胞蛋白质组学研究目的:比较骨髓MSCS与原代肝细胞构建最适共培养体系前后肝细胞内蛋白质表达谱的差异,并对明确的蛋白质进行功能分析,在蛋白质水平上阐明骨髓MSCS共培养下的原代肝细胞功能改善的机制。方法:自中华实验猪(n=3)髂前上棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代,与原位两步胶原酶法分离得到的猪肝细胞建立最适共培养体系。流式细胞仪分选CD44-CD45-细胞群,并设立肝细胞单纯培养组作为对照,每组重复3次。将提取的蛋白样品采用固相pH梯度双向凝胶电泳进行分离,使用ImageMaster 2D Elite软件对图像进行匹配和差异分析,识别两组间表达差异的蛋白质点,将部分差异蛋白点进行胶内原位切割、酶解后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异表达的蛋白质,获得肽质指纹谱。通过生物信息学查询鉴定蛋白质并将差异蛋白质分子归类相应生物学事件。Western印迹技术验证部分蛋白质在肝细胞单纯组与共培养组肝细胞之间的表达差异。结果:流式细胞仪可将共培养细胞分选为CD44-CD45-(肝细胞)、CD44+CD45-(MSCS)两群。经双向凝胶电泳成功建立肝细胞蛋白质二维电泳图谱,图像分辨率高,重复性好。两组间差异表达量≥3倍的蛋白质点共40个,其中表达上调的19个。经质谱鉴定出34个蛋白点,Western Blotting检测证实CFTR、IL-6、HMG-1变化水平与蛋白质组结果基本一致。这些差异蛋白的分子功能主要与肝脏代谢功能、细胞周期调节、细胞增殖与凋亡、免疫调节等相关。结论:采用比较蛋白质组学的方法可以发现大量与骨髓MSCS共培养下的原代肝细胞内差异表达的蛋白质,这些功能蛋白的差异表达可能与MSCS和原代肝细胞体外共培养下肝细胞特异性功能改善、细胞生存时间延长、免疫调节密切相关,为进一步优化肝细胞功能提供了靶点。第四部分骨髓MSCS诱导肝细胞耐受肝功能衰竭血清的实验研究目的:明确与骨髓MSCS共培养的肝细胞可耐受慢加急性肝功能衰竭患者血清的细胞毒性,以及共培养细胞对肝衰血清的肝功能支持作用。方法:患者知情同意前提下收集慢性乙型肝炎慢加急性肝功能衰竭患者血清(n=18)及正常志愿者血清(n=18)。建立猪肝细胞与骨髓MSCS最适共培养体系。实验分为4组:肝衰竭血清单纯肝细胞培养组(Hep-F)、肝衰竭血清共培养组(Co-F)、正常人血清单纯肝细胞培养组(Hep-N)和正常人血清共培养组(Co-N)。血清浓度依次为10%、20%、40%、60%、80%和100%。培养24h后收集上清液检测白蛋白水平和肝细胞周期确定最适肝衰竭血清浓度。观察细胞生长状态、超微结构及细胞活力。分别检测60%浓度血清培养组SOD、LDH、GLN和CHE水平。更换为含10%胎牛血清的完全培养基继续培养24h,收集肝衰竭血清单纯肝细胞培养组(Hep-FB)、肝衰竭血清共培养组(Co-FB)、正常人血清单纯肝细胞培养组(Hep-NB)和正常人血清共培养组(Co-NB)上清液,重复检测SOD、LDH、GLN和CHE水平。结果:骨髓MSCS共培养后的肝细胞在60%浓度的肝衰竭血清中肝细胞贴壁数量最多,呈岛状聚集生长。肝细胞表达白蛋白水平最佳(P<0.05),G2-S期细胞比例升至32.08%,细胞内超微结构接近正常,细胞活力较对照组明显改善。Hep-F组SOD、GLN、CHE活性显着下降(P<0.05),而LDH显着升高(P<0.05);Co-F组SOD、GLN和LDH水平与Co-N组之间差异无统计学意义(P>0.05),仅CHE活性有所下降(P<0.05),但与Hep-F组比较有显着性提高(P<0.05)。Hep-NB、Hep-FB、Co-NB与Co-FB之间SOD活性的差异无统计学意义(P>0.05);Co-FB组LDH、GLN、CHE活性较Hep-F组有显着性改善(P<0.05)。结论:与骨髓MSCS共培养的肝细胞可耐受中高浓度慢加急性肝功能衰竭血清的细胞毒性,有效维持肝细胞功能的支持作用。
参考文献：
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[8]. 微载体粘附培养肝细胞的生物学特性及其移植治疗大鼠急性肝衰竭的实验研究[D]. 徐哲. 第四军医大学. 2003
[9]. 骨髓间充质干细胞与肝细胞共培养的实验研究[D]. 顾劲扬. 南京医科大学. 2009
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