雄激素受体和心型脂肪酸结合蛋白在心肌梗死者心肌中的表达
张曙光1，王显慧2，苏丽娟1，贾富全1，荣 荣1，刘长海1,*
（1.内蒙古医科大学基础医学院法医学教研室，呼和浩特 010059；2.齐齐哈尔市公安局刑事技术支队，黑龙江 齐齐哈尔161000）
摘 要： 目的 通过比较心肌梗死猝死组与正常对照组心肌组织中雄激素受体（AR）和心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的表达以及相关研究，探讨二者与心肌梗死猝死之间的关系，为心肌梗死的法医病理学诊断提供客观依据。方法 从内蒙古医科大学司法鉴定中心2011年至2014年尸检案例中筛选心肌梗死猝死者42例（实验组）、无冠心病其他死因者20例（对照组），采用免疫组化SP法分别检测AR和H-FABP在心肌组织中的表达。结果 1）AR在实验组和对照组心肌组织中表达情况相比较，两组之间有显著差异（P ＜0.05）；2）H-FABP在实验组和对照组心肌组织中表达情况相比较，两组之间有显著差异（P ＜0.05）。结论 心肌梗死猝死者冠状动脉和心肌组织中AR表达明显降低，可为心肌梗死猝死死后诊断提供参考依据。H-FABP在梗死心肌组织中表达明显降低，有望为心肌梗死法医学诊断提供参考依据。
关键词： 法医病理学；心肌梗死；雄激素受体；心型脂肪酸结合蛋白；免疫组化
心肌梗死（myocardial infarction, MI）是由于冠状动脉血供减少或中断，导致供血区心肌严重而持久的缺血、缺氧引起的心肌局部或大片坏死。在法医学实践中，心肌梗死死后的诊断长期以来一直是法医病理学中死因鉴定的难点，猝死者心肌的组织病理学变化是心肌梗死猝死诊断的关键[1]。雄激素受体（androgen receptor, AR）是一种配体依赖性的反式转录调节蛋白，主要分布在靶细胞的核内，是参与雄激素在靶细胞中发挥作用的重要组成部分。AR的异常表达，与心肌的收缩功能、心肌梗死密切相关[2]。心型脂肪酸结合蛋白（heart-type fatty acid-binding protein，H-FABP）是心肌细胞胞浆中丰富的蛋白质之一，在心肌梗死早期，由于心肌缺血、低氧等因素的影响，H-FABP可较早从心肌细胞内漏出。本实验采用免疫组化方法，对心肌梗死猝死案例中心肌组织中AR、H-FABP的表达情况进行观察，分析这两种因子对心肌梗死死后诊断的法医学意义。
1 材料
1.1 标本来源及分组
1）自2011年1月至2014年12月内蒙古医科大学司法鉴定中心尸检档案中，根据下述世界卫生组织（ICD-10）心肌梗死猝死诊断国际标准挑选42例心肌梗死猝死病例及组织石蜡块，作为实验组：a.排除暴力、窒息、中毒等原因致死；b.排除心肌炎等其他心脏疾病致死；c.冠状动脉粥样硬化致管腔狭窄Ⅲ级及以上。另选其他死因案例及组织蜡块20例为对照组。所有案例均为男性，并按不同年龄段进行分组。
一铵市场弱稳运行，企业报价变化不大，成交观望氛围浓郁，内销进入收尾阶段，部分企业主要供应前期预收订单发货；预计短期内盘整运行。二铵市场延续平稳走势，东北市场价格已经逐步明朗，受经销商库存低位影响，企业惜售心态明显，看好后市。因市场当前观望氛围较浓，部分企业二铵价格调整或推迟至本月底，预计幅度在50-100元/吨，个别企业或有150元/吨的上调意向。
2）所有标本用4%福尔马林溶液固定。
3）实验组及对照组冠状动脉取材以左前降支为主，两组心肌均取左心室前壁心肌层切面。
目前学界对动态逻辑的研究比较多，但从人工智能视角研究动态逻辑则相对较弱。人工智能的动态逻辑研究拓展了经典逻辑的研究范围，人工智能的应用验证了非经典逻辑的合理性和发展的必然性。因此，从人工智能角度研究自然语言的动态逻辑具有重要意义。
1.2 实验组基本资料
实验组42例中，年龄最小为24岁，最大81岁，平均（52.24±14.93）岁；发病后平均存活时间为(0.57±0.59) h，符合猝死时间范围（国际心脏联合会规定）。其中4例发现时已死亡，经法医病理学检查排除其他死因后鉴定为心肌梗死猝死；23例存在精神刺激、暴力、体力活动等明显诱因；15例死亡发生前有急性冠脉综合征的临床表现。
1.3 对照组基本资料
兔抗人AR多克隆抗体、枸橼酸盐缓冲液粉剂（武汉博士德生物技术公司），苏木素、兔抗人H-FABP多克隆抗体（武汉三鹰生物技术公司），SP免疫组化染色试剂盒、DBA显色试剂盒（福州迈新生物技术公司），石蜡包埋机（德国SM公司），光学显微镜（BH型，日本OLYMPS公司）、显微镜摄像系统（AH.V型，日本OLYMPS公司）。
表1 两组不同年龄分布
Table 1 Age distribution in two groups
1.4 主要试剂及设备
对照组20例中，年龄最小22岁，最大73岁，平均（46.10±14.39）岁。两组不同年龄的比较见表1。
2 实验方法
实验数据应用SPSS13.0统计软件进行统计分析。实验组和对照组之间年龄比较应用t 检验，两组之间缺失面积的比较应用t 检验，检验水准α＝0.05。
2.1 HE染色（常规染色）
阳性对照：AR和H-FABP以正常人体心肌组织切片作为阳性对照。阴性对照：采用PBS代替一抗作为阴性对照。
2.2 免疫组化染色（SP法）
实验组与对照组案例年龄分布如表1，经t 检验分析，两组之间年龄差异无统计学意义。
2.3 免疫组化对照设定和结果评定
1）切片：取出预冷蜡块，置于切片机上，调整切片厚度为3 μm，45 ℃展片贴于防脱载玻片上；晾干水分后放到72 ℃烤片机上2 h；2）脱蜡；3）苏木精-伊红染色；4）常规脱水，二甲苯透明；5）封片，显微镜观察。
参照Fromowitz等[3]的综合计分法，根据阳性细胞数比例及染色程度综合判断染色结果。以心肌细胞核和细胞质出现黄色、棕黄色和棕褐色为阳性细胞。采用Leica Application Suite-LAS软件在200倍下行图像处理，测量视野内染色缺失面积。
2.4 统计方法
两组62例石蜡标本中，每个标本连续制作三张切片，切片厚3 μm，其中一张进行免疫组化（SP法）染色，一张作为免疫组化阴性对照染色，另一张做HE染色供病理诊断确诊。
3 结果
3.1 两组年龄的统计学分析
1）切片常规脱蜡至水。2）PBS浸泡3次。3）抗原修复：切片浸没于枸橼酸盐抗原修复溶液中高压3 min后取出，待液体冷却至室温。4）PBS冲洗2次。5）除去PBS，切片滴加SP免疫组化染色试剂盒中的试剂A。PBS冲洗3次。6）去除PBS后滴加试剂B。7）除去血清，滴加适当稀释的一抗（AR和HFABP），将切片放于湿盒内4℃冰箱中过夜。8）第二日PBS洗涤。9）除去PBS，滴加1滴试剂C，室温下孵育。10）PBS洗涤。11）除去PBS，滴加1滴试剂D。12）PBS洗涤。13）除去PBS，滴加新鲜配制的DBA显色试剂，室温显色，镜下控制反应时间，及时流水冲洗终止显色。14）苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗反蓝。15）梯度酒精脱水。16）二甲苯透明，封片。
3.2 AR的免疫组织化学染色结果
岩性以古生界的二叠系砂页岩、泥岩为主，砂页岩、泥岩往往含蒙特石和高岭土矿物，该两种矿物具有见风易风化、失水干裂和遇水膨胀而崩碎的特性，强度低，属较软岩，软化系数0.42～0.95，是所谓的“烂石头”，详见表2。基岩单轴抗压强度：中、细砂岩为9.5～19 MPa，泥质粉砂岩2.5 MPa，受基岩裂隙水和出渣车辆碾压的影响，洞底岩石软化、泥化严重，影响正常施工。
3.3 H-FABP的免疫组织化学染色结果
H-FABP免疫组化染色的检测结果显示：HFABP主要表达于正常心肌细胞胞浆中，染色为均匀一致浅棕色、棕黄色，呈片状分布；部分细胞核见少量棕黄色着色。H-FABP在血管壁内不表达。在梗死心肌细胞胞浆中表达较弱，呈片状或灶状染色缺失。经过统计学比较发现：H-FABP在正常心肌组织中表达情况与其在心肌梗死猝死心肌组织中的表达相比较，实验组缺失面积为(8 700.24±758.40) μm2，相比对照组的(269.98±42.88) μm2，差异具有统计学意义（P ＜0.05，表 3 及图 1i～j）。
在此次研究中,选择了SPSS 22.0的统计学软件展开数据分析、归档处理。对于计数资料的表示为%,以χ2检验;对于计量资料的表示则为(±s),使用T进行检验,当两组的数据存在差异的时候,且P<0.05则表示有可比性。
42例心肌梗死猝死心肌组织和20例正常心肌组织中AR免疫组化染色的检测结果显示：AR主要表达于正常冠状动脉内皮和细胞胞浆中，表现为浅棕褐色或棕黄色颗粒；正常冠状动脉内皮细胞可见条形黄褐色着色，胞浆内可见黄色颗粒；部分正常心肌细胞胞核可发现少量棕黄色着色。AR在正常心肌组织中呈明显阳性表达，在梗死心肌组织中表达较弱。阴性对照未见浅棕褐色或黄色颗粒。经过统计学分析发现：AR在正常心肌组织中表达情况与其在心肌梗死猝死心肌组织中的表达相比较，实验组缺失面积为（9 400.38±642.37）μm2，相比对照组的（370.42±58.87）μm2，差异具有统计学意义（P ＜0.05，表 2 及图 1e～h）。
表2 两组心肌AR的缺失面积比较
Table 2 The missing area of AR in the myocardia of two groups
图1 心肌组织染色汇总图（a：正常心肌组织〔HE×200〕；b：正常心肌组织〔HE×400〕；c：梗死心肌组织〔HE×200〕；d：梗死心肌组织〔HE×400〕；e ：AR在正常心肌组织表达〔SP×400〕；f：AR在正常心肌血管表达〔SP×400〕；g：AR在梗死心肌组织表达〔SP×400〕；h：AR在梗死心肌血管表达〔SP×400〕；i：H-FABP在正常心肌组织表达〔SP×400〕；j：H-FABP在梗死心肌组织表达〔SP×400〕）
Fig.1 Myocardial tissues stained (normal myocardial tissue： a [HE×200]and b [HE×400]； infarcted myocardium： c [HE×200] and d [HE×400]；expressed AR [SP×400] in e： normal myocardium and f： normal myocardial blood vessel； expressed AR [SP×400] in g： infarcted myocardium and h： infarcted myocardial blood vessel； expressed H-FABP [SP×400] in i：
normal myocardium and j： infarcted myocardium)
表3 两组心肌H-FABP的缺失面积比较
Table 3 The missing area of H-FABP in the myocardium of two groups
4 讨论
4.1 AR在心肌组织中的表达与意义
AR参与构成机体多个系统并发挥重要的作用，有报道证实心血管系统存在AR[4]。AR在没有配体的条件下，主要与细胞质内热休克蛋白（heat shock protein，HSPs）和其他伴侣蛋白结合发挥功能[2]。睾酮是一种雄激素，由胆固醇合成，具有抑制炎症[5]、扩张冠状动脉[6]的功能，同时具有保护冠状动脉的作用。由于睾酮主要与其相应受体（AR）通过基因及非基因效应发挥生物学效应，AR表达水平可以在一定程度上反映雄激素在组织中的水平和作用。雄激素—AR系统可对抗缺血缺氧对心血管系统造成的改变，AR在冠心病发生发展过程中具有保护作用[7]。AR可开放血管平滑肌上的钾离子通道，使细胞质中蛋白质扩散，染色质边集，蛋白质弥散至胞浆中，舒张冠状动脉，从而改善心肌缺血[8-9]。
刘恺怡等[8]对32例男性冠状动脉AR的表达情况进行实验研究，探讨了男性AR与心肌梗死的关系，指出低AR水平使雄激素的生物学效应降低，从而促进心肌梗死的发生，使心肌梗死猝死的发生率升高，其认为研究AR在男性心肌梗死患者冠状动脉中的表达可为心肌梗死的发生发展机制提供新的思路。本实验发现AR在正常心肌组织中的表达量显著高于心肌梗死组织心肌中的表达量，进一步地验证了AR在心肌梗死死后诊断中的作用。AR的减少可能与心肌梗死死后细胞膜通透性发生变化有关。
4.2 H-FABP在心肌组织中的表达与意义
FABP是一类广泛分布的可溶性小分子蛋白质，其分子量较低，仅为12～16 kD。Ockner首先发现，由于其多种类型的表位结合蛋白具有不同的抗原决定簇，决定了其在组织内的特异性分布，H-FABP是目前发现9种脂肪酸结合蛋白中的一种亚型，特异性存在于心肌细胞的胞浆中，主要分布在心室细胞中，心房细胞含量较少[5,10]。其在脂肪酸和长链脂肪酸的摄取、结合和运输，以及调节脂肪酸的代谢方面发挥主要作用。大量研究表明H-FABP能够在急性心肌梗死初期释放到血液中[11]。当心肌细胞缺血缺氧时，细胞膜结构发生改变，H-FABP透过受损细胞膜进入外周血液循环，血液中的H-FABP急剧增加，6 h便可达到高峰[12]，此现象可一定程度上反应心肌细胞受损情况。Kazuo等[13]使用免疫组化技术分析HFABP在正常心肌和急性心肌梗死心肌组织中分布的差异，确认了H-FABP在心肌微小损伤的表达中具有较高的敏感性。通过血浆中心型脂肪酸结合蛋白在正常心肌和损伤心肌中含量的比较，发现血浆中HFABP水平越高，心肌损伤越为严重，以此可评价心肌不可逆损伤的程度[14]。有学者利用犬建立心肌缺血再灌注模型，比较H-FABP的血浆含量与梗死面积的大小关系，结果表明，H-FABP的血浆水平与心肌组织染色面积缺失程度呈正相关[15]。
采用SPSS统计学软件对数据进行处理。计量资料以“±s”表示，计数资料以百分数（%）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。
本实验中H-FABP在实验组和对照组心肌组织的表达结果显示：H-FABP主要表达于正常心肌组织细胞浆中，呈强阳性表达，在正常心肌组织中的表达明显高于心肌梗死猝死者心肌组织中的表达，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。统计学结果提示心肌组织中H-FABP的表达降低与心肌梗死的发生有关。
4.3 展望
H-FABP主要分布在心肌细胞质中，且它们含量较多，心肌损伤后较cTnT、CK-MB和MB因子提前释放入血，且敏感性高[16-18]，AR主要存在于冠状动脉血管内皮细胞核中和心肌细胞质中，H-FABP和AR具有良好的器官特异性[19-20]。尽管H-FABP和AR在心肌梗死死后诊断的稳定性、特异性还需要进一步的实验研究，但是比较心肌细胞内H-FABP和AR的变化情况可作为诊断心肌缺血缺氧的手段之一，对于法医病理检案中死后早期诊断AMI具有较大的应用前景。
1.电力工程电气自动化是在计算机信息处理技术，电力网络技术以及网络通讯技术等多种技术的基础上发展而来的。是综合性非常强的技术门类。目前，我国的电力系统的远程监控以及远程管理，都依赖于电力自动化技术，电力系统的安全，高效、平稳的运行，也依赖于电力自动化技术。
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Expression of Androgen Receptor and Heart-type Fatty Acid Binding Protein in Infarcted Myocardia
ZHANG Shuguang1, WANG Xianhui2, SU Lijuan1, JIA Fuquan1, RONG Rong1, LIU Changhai1,*
(1. Forensic Clinic, School of Basic Medicine, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, China；2. Criminal Technology Detachment of Qiqihar Public Security Bureau, Qiqihar 161000, Heilongjiang, China)
ABSTRACT： Objective To explore the correlation between heart-type fatty acid binding protein (H-FABP) or androgen receptor(AR) and sudden death after myocardial infarction through comparing the expression of AR and H-FABP in the group of sudden death of myocardial infarction against the control group so that an objective basis might be provided for forensic pathological diagnosis of myocardial infarction. Methods 42 cases of sudden death of myocardial infarction (the experimental group) and 20 cases of death of non-coronary disease (control group) were selected from the autopsied cadavers collected during 2011 to 2014 by the judicial identification center of Inner Mongolia medical university. The expressions of both AR and H-FABP in cardiac tissues from either the experimental or control group were detected with immuno-histochemical SP method. Results A significant difference was revealed in the expression of both AR and H-FABP between the experimental and control group (both of P ＜0.05).Conclusion The expression of AR was significantly reduced in both the coronary arteries and myocardial tissues of the cadavers died suddenly of myocardial infarction, suggesting that AR has protective effect to the cardiovascular system, capable of providing reference for the postmortem diagnosis of myocardial infarction. The expression of H-FABP was also significantly decreased in the infarcted myocardia, therefore eligible for a postmortem diagnostic indicator about myocardial infarction, too.
KEY WORDS： myocardial infarction； forensic pathology； heart-type fatty acid binding protein； androgen receptor；immunohistochemistry
中图分类号： DF795.1
文献标识码： A
文章编号： 1008-3650(2019)06-0507-05
基金项目： 内蒙古自治区高等学校科学技术研究项目（No.NJZY108）；内蒙古医科大学青年创新基金项目（No.YKD2016QNCX016）
第一作者简介： 张曙光，男，内蒙古赤峰人，硕士，讲师，研究方向为法医病理学和法医临床学。E-mail：475852508@qq.com
* 通讯作者简介： 刘长海，男，内蒙古赤峰人，硕士，讲师，研究方向为法医病理学和法医临床学。E-mail：435926924@qq.com
DOI： 10.16467/j.1008-3650.2019.06.007
收稿日期： 2018-01-31；修回日期：2018-08-01
引用 本文格式：张曙光，王显慧，苏丽娟，等. 雄激素受体和心型脂肪酸结合蛋白在心肌梗死者心肌中的表达[J]. 刑事技术，2019,44(6)：507-511.
标签：法医病理学论文; 心肌梗死论文; 雄激素受体论文; 心型脂肪酸结合蛋白论文; 免疫组化论文; 内蒙古医科大学基础医学院法医学教研室论文; 齐齐哈尔市公安局刑事技术支队论文;