席泓[1]2002年在《凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞诱导细胞毒性T细胞抗肿瘤作用研究》文中提出机体的抗肿瘤免疫主要为T淋巴细胞所介导，T细胞的致敏、激活、扩增和对肿瘤细胞的杀伤作用均有赖于抗原递呈细胞肿瘤递呈相应的抗原肽及相关因子的参与。树突状细胞(DC)是体内功能最强的专职抗原递呈细胞，在机体免疫应答中起极其重要的作用。为了进一步研究DC在激发和诱导抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)中的作用及其机制，寻找以DC为基础的CTL体外有效扩增方案，我们采用外周血单个核细胞(PBMCs)来源的DC，负载由激发型CD40mAb联合~(60)Coγ辐照诱导B淋巴瘤细胞株Daudi的凋亡，成熟的肿瘤抗原肽-DC进一步激发和诱导自体的T细胞，联合激发型CD28mAb、IL-2、IL-15、IL-7等不同因子体外扩增肿瘤特异性CTL，在此基础上建立优化的体外扩增方案；ELISA检测所扩增T细胞上清中细胞因子IL-12、IL-10、IFN-γ的产生；~3H-TdR掺入试验和~(51)Cr释放试验分别测定CTL的增殖和细胞毒效应。结果显示(1)凋亡肿瘤细胞负载联合CD40mAb激发可使DC上调表达CDla、CD80、CD86和HLA-DR，并能促进IL-12的分泌；(2)凋亡肿瘤细胞负载后的DC在激发型CD40mAb作用下，能激发和扩增出高效、特异杀伤靶细胞的CTL；(3)肿瘤抗原负载DC联合激发型CD28mAb、IL-15、IL-2诱导扩增肿瘤特异性CTL效率最高。结论：CD40mAb激发的凋亡肿瘤细胞负载 DC在 CD28mAb、ILJ 和 IL上的联合作用下可有效激活和扩增肿瘤特异性CTh。
李旭奎, 周昌龙, 饶国州, 张引成[2]2007年在《腺样囊性癌细胞凋亡抗原负载的树突状细胞诱导抗肿瘤效应的体外研究》文中研究指明目的探讨负载腮腺腺样囊性癌细胞凋亡肿瘤抗原的树突状细胞,诱导淋巴细胞介导的免疫反应,观察其体外杀伤腺样囊性癌细胞的细胞毒性效应。方法外周血单核细胞,在粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GM-CSF)+白细胞介素-4(Interleukin-4IL-4)的诱导下体外培养,用凋亡肿瘤细胞抗原冲击后,流式细胞仪检测树突状细胞抗原负载前后CD1a、CD83表达量的变化。采用MTT比色法检测同种混合淋巴细胞反应和诱导细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte CTL)反应。结果凋亡肿瘤抗原刺激后,CD83表达急剧增加(P<0.01),而CD1a表达量下调(P<0.01)。负荷凋亡肿瘤抗原树突状细胞体外诱导出明显的细胞毒性反应,并刺激同种T淋巴细胞增殖。结论GM-CSF+IL-4诱导的单核细胞来源的树突状细胞,能在体外摄取凋亡肿瘤抗原而进一步成熟,通过激活淋巴细胞杀伤癌细胞。
王丹辉[3]2006年在《热休克蛋白70-多肽负载的树突状细胞在骨肉瘤免疫治疗中的作用实验研究》文中研究说明骨肉瘤是人类原发性恶性骨肿瘤中发病率及恶性程度最高的,易发生转移及浸润生长而难以彻底根治,因此,探索一种新的免疫治疗方法以提高骨肉瘤的治愈率,成为骨科研究中的重点和难点。热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)是一组具有重要生理功能,高度保守的蛋白质分子家族。热休克蛋白70是热休克蛋白家族中的一员,具有HSP家族的特征,对细胞的生长、应激、以及在肿瘤的发生、发展中具有重要的作用。树突状细胞(dendritic cell, DC)是体内功能最强的抗原提呈细胞,DC细胞表面存在热休克蛋白高亲和力受体CD91,HSP多肽通过与DC细胞上的受体结合而内化,经MHC I类途径将抗原肽呈递在DC细胞表面,进而激活基于抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes, CTL),杀伤肿瘤细胞。基于以上发现:本研究构建了HSP70的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出HSP70基因,经过纯化得到HSP70蛋白。我们选用脐血为原料来诱导扩增DC,用不同组合的细胞因子诱导脐血单核细胞生成DC,再用肿瘤抗原热休克蛋白多肽复合物负载DC,使其诱导特异性的T细胞杀伤活性,杀伤骨肉瘤细胞。实验结果证实:①成功的在骨肉瘤细胞中表达出HSP70基因并纯化出HSP70蛋白。②人脐血经过GM-CSF、IL-4、TNF-α联合培养后,脐血单核细胞可生成大量的DC,高表达CD1a和HLA-DR。③HSP-70多肽负载的DC能产生明显的特异性杀伤骨肉瘤细胞的作用。这一研究成果为骨肉瘤的免疫治疗提供了理论依据。
赖朝辉[4]2012年在《体外诱导DC-CIK的实验研究》文中认为目的：探讨白细胞介素-15(Interleukin15,IL.15)及骨髓来源树突细胞(Dendritic Cell,DC)对细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokone-Induced Kilker,CIK)细胞增殖能力,免疫表型,以及杀伤肝癌细胞的作用。方法：体外培养小鼠骨髓源性DC,通过流式细胞术(Floweytometry,FCM)检测鉴定DC细胞CD80、CD86.MHC Ⅱ、CDllc表达情况。分为IL-15处理和未处理条件下培养CIK、DC-CIK细胞,通过FCM鉴定CIK细胞中CD3+、CD3+CD8+、 CD3+NK1.1+表达情况。培养分组：CIK,CIK+IL-15,CIK+DC,CIK+IL-15+DC观察IL-15及DC对CIK细胞增殖能力的影响,通过FCM用流式细胞仪检测其免疫表型的变化。将CIK细胞及IL-15刺激后的CIK分别与DC以5：1效靶比进行培养,用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,FCM检测其表型变化,同时通过测定乳酸脱氢酶(LDH)检验杀伤活性。数据通过用SPSS统计软件包进行数据分析。结果：每只小鼠骨髓细胞可培养出(5.5±0.5)×106个DC,且FCM检测显示DC高表达CD80(95.0＋1.2%).CD86(88.5±1.4%).MHC-Ⅱ(89.2±1.2%)及CDllc(83.3±1.7%).每只小鼠脾脏可获得约(4.5±0.5)×106个CIK细胞,在第14天时35.0±2.7%的细胞为CD3+、18.8±2.4%的细胞为CD3+CD8+、17.1±2.5%的细胞为CD3+NK1.1+。.骨髓源树突细胞刺激及培养体系中加入IL-15后的CIK细胞增殖能力高于常规对照组,CD3+和CD3+CD8+、CD3+NK1.1+双阳性细胞比率均高于常规对照组(P<0.05)。培养后小鼠脾源CIK细胞总数在第10、15天分别为(2.1±0.1)×107,(2.4±0.2)×107,与对照组(0.5×107)相比具有显着性差异(P<0.05)。在2.5：1～20：1的效靶比范围内,IL-15刺激的CIK及DC-CIK细胞对肝癌细胞的杀伤率显着高于CIK细胞(P<0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关。在效靶比20：1时,共IL-15刺激的DC-CIK细胞对Hepal-6肝癌细胞杀伤率为(58.75±4.34)%。结论：培养基细胞因子选择法培养可收获大量的骨髓源DC,在多种细胞因子作用下可培养大量脾脏来源的CIK。IL-15和骨髓源性DC均可增加CIK细胞的增殖能力及膜表面抗原的表达率,且二者具有迭加效应。DC刺激增加CIK细胞抗肿瘤细胞的活性,IL-15作用下DC-CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性进一步增强。
杨新静[5]2006年在《凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞疫苗抗肺癌的实验研究》文中研究说明第一部分凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞疫苗抗肺癌的实验研究目的:从健康人外周血中诱导树突状细胞(dendritic cells,DCs),通过凋亡肿瘤细胞负载联合CD40单抗促进DCs成熟构建DCs疫苗,并用DCs疫苗激活抗原特异性的细胞毒性T细胞(CTL),观察其体内外抗肺癌的特性。方法:采用常规Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),培养2小时后贴壁细胞采用含GM-CSF(100μg/L)﹑IL-4(50μg/L)、10%FCS的RPMI-1640培养DCs,在DCs培养的第6天,以诱导凋亡的A549进行抗原负载(DCs:凋亡细胞=5:1),24 h后加入激发型CD40单克隆抗体(5mg/L)继续诱导2d,诱导DCs成熟;收集成熟的DCs与自体T细胞按1:50的比例混合共育7天,诱导抗原特异性的CTL细胞;流式细胞仪检测细胞表型的变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞毒活性;用人肺癌细胞株A549建立荷瘤裸鼠模型研究CTL体内的抗肺癌的活性。结果:凋亡肿瘤细胞负载可使DCs上调表达CD1α、CD80、CD83、CD86和HLA-DR,联合CD40mAb可进一步促进DCs的成熟;成熟DCs和自体的T细胞共育活化抗原特异性CTL;与未活化前相比,CTL的CD8+T细胞大幅度上调(P<0.05),并上调表达CD3、CD25、CD28、CD8/CD28分子;CTL对A549具有高效特异的杀伤力,明显强于CTL对肝癌细胞HepG2的作用(P<0.01);体内实验表明,CTL可有效抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,与生理盐水组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论:体外成功构建树突状细胞疫苗,其诱导的抗原特异性的CTL在体内外均能够有效的抑制肺癌细胞的生长。
王军民[6]2010年在《肿瘤干细胞树突细胞疫苗治疗脑胶质瘤的体外实验及作用机制研究》文中研究指明目的：目前通过树突状细胞诱导机体抗肿瘤免疫已经成为肿瘤免疫治疗的一种重要途径,通过热休克凋亡脑胶质瘤细胞抗原制备树突状细胞疫苗,可增强树突状细胞抗原提呈功能,诱导细胞毒性T淋巴细胞产生肿瘤杀伤作用；同时探讨胶质瘤细胞系U251细胞中肿瘤干细胞的培养和鉴定方法；研究应用脑胶质瘤干细胞抗原制备的树突状细胞疫苗在体外对胶质瘤细胞的杀伤作用并探讨其机制。方法：采用改进Inaba法在rmGM-CSF和rhIL-4作用下体外诱导扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞,电镜、流式细胞仪鉴定其生物学特性；经恒温43℃、44℃、45℃分别处理U251细胞1h、2 h、3 h、4 h继续常规培养12小时,进一步在体外制备凋亡U251细胞致敏的DC瘤苗,后观察疫苗的混合淋巴细胞反应和细胞杀伤作用；将U251细胞置于DMEM/F12+10%FBS的培养基中培养,对数生长期时0.25%胰蛋白酶消化,洗涤,加入无血清DMEM/F12培养基(含LIF 10ng/ml, EGF 20ng/ml,FGF 20ng/ml,B27 20ul/ml)培养。每日观察细胞球生长情况,每周传一代。收集培养4周的细胞球,行免疫细胞化学染色,检测神经干细胞标志Nestin和CD133的表达。使用流式细胞仪分别检测含血清培养条件下的肿瘤细胞,无血清培养1周、2周、4周和8周的肿瘤细胞中CD133＋和nestin+细胞含量。收集培养4周的细胞球在DMEM/F12+10%FBS培养基中培养5-10天,应用免疫细胞化学染色,检测NSE、MAP2和GFAP的表达；从脑胶质瘤临床标本中培养获得肿瘤干细胞,应用反复冻融法获得胶质瘤干细胞冻溶物。诱导小鼠间充质干细胞分化为树突状细胞,将冻溶物和树突状细胞共培养,获得胶质瘤干细胞疫苗,流式细胞仪检测树突状细胞表面标志的变化。应用CCK-8法检测疫苗的促T细胞增殖能力以及对胶质瘤细胞的杀伤作用,应用ELISA法检测培养基中干扰素-Y的含量。结果：在细胞因子作用下,培养6-7天即可诱导出DCs,经倒置显微镜和电镜证实膜表面具有典型树突状结构；流式细胞仪证实其表达特征性表面标记CDllc,同时高表达功能相关抗原CD80、CD86、MHC-Ⅱ；应用倒置显微镜和流式细胞仪确定热诱导凋亡胶质瘤细胞的最佳条件是44℃处理3小时并常规培养12小时；凋亡肿瘤细胞能更好的负载DCs,混合淋巴细胞反应表明负载后DC疫苗有较强的刺激同种淋巴细胞反应的能力,DC疫苗活化抗原特异性CTL具有很强的杀伤肿瘤细胞能力；U251细胞在无血清培养基中1周可形成细胞团。传代后,能形成新的细胞球,并随传代次数的增多,细胞球逐渐变得规则。U251细胞系中部分细胞具有单克隆性质。培养4周的细胞球,免疫细胞化学染色提示Nestin和CD133均呈阳性表达。流式分析,CD133阳性率在肿瘤细胞0.5%,悬浮培养1周2.4%,悬浮培养2周3.0%,悬浮培养4周10.0%,悬浮培养8周可达17.7%。细胞球在含血清培养基中培养5-10天,免疫细胞化学染色提示神经元特异性标志MAP2与NSE和胶质细胞标志GFAP阳性表达,部分细胞MAP2和GFAP均表达，细胞异质性明显；经脑胶质瘤干细胞胞溶物的强烈刺激,树突状细胞表面标志表达显着提高,包括CD80、CD86、CD11C和MHCⅡ；胶质瘤干细胞疫苗能强烈刺激T细胞增殖；该疫苗诱导的免疫反应,能有效杀灭胶质瘤细胞,并能促进干扰素-γ的分泌。结论：在rmGM-CSF和rmIL-4的作用下体外成功诱导、扩增小鼠骨髓源性功能性的DC,热诱导凋亡胶质瘤细胞负载的DC疫苗在体外能有效刺激自体T淋巴细胞增殖,并诱导抗原特异性CTL产生较强的杀伤胶质瘤细胞功能；U251细胞系中存在少量肿瘤干细胞,具有神经干细胞样特性,可在无血清培养基中培养扩增,对胶质瘤的发生和进展有重要作用；应用胶质瘤干细胞制备的树突状细胞疫苗能有效诱导特异性细胞毒性T细胞,表现出较强的抗肿瘤特性。
黄胜兰[7]2014年在《AFP基因修饰的DC细胞的分泌的exosome抗肿瘤作用研究》文中指出【目的】原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是中国常见的恶性肿瘤之一。由于肝癌起病隐匿，缺乏有效的早期诊断方法，而且复发率高、预后差，因而总的治疗效果并不理想，目前肝癌生物治疗逐渐成为研究热点之一。其中，树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗的实验研究已取得相当大的进展，然而在实际应用仍存在很多不足，效果往往不如预期理想,其中缺乏有效抗原刺激是重要的影响因素之一，为此众多学者尝试运用不用抗原负载方式增强DC疫苗诱导抗肿瘤免疫反应,这其中包括人工合成的抗原肽、全肿瘤裂解物、基因载体转染DC等等，虽然基因转染DC可在一定程度上解决抗原来源问题，但基因载体在人体应用的安全性未能得到保障，因此最近人们尝试用新型亚细胞瘤苗exosome等来调节或替代DC功能。Exosome是DC细胞分泌一种膜性囊泡,其重要特性是携带DC细胞的各种功能蛋白,因而具有相应的诱导主动免疫应答功能，其抗肿瘤作用已经在非小细胞肺癌、黑色素瘤等治疗中取得一定的效果,但应用于肝癌的研究尚处于探索阶段。本实验首先构建携带AFP基因慢病毒质粒，包装成慢病毒感染DC，分离纯化DC分泌的exosome，分析exosome的特异性抗肿瘤免疫作用。为开拓新型非细胞性肝癌疫苗提供实验依据，避免直接病毒基因导入人体，以便研制出更具临床应用前景的肿瘤疫苗。【方法】1.应用慢病毒质粒系统和包装细胞Lenti-X293T，构建包装能使AFP稳定表达的重组慢病毒颗粒。2.取健康人外周血，分离培养单核细胞，用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4及LPS诱导培养DC，显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪鉴定DC表型。3.分别用合成的已知序列的AFP肽、肝癌细胞株HepG2反复冻融全抗原、携带AFP重组慢病毒颗粒负载DC，分别制备DC疫苗。4.用超滤及密度梯度离心法提取纯化DC分泌的exosome，制备exosome疫苗，透射电镜下观察exosome形态，western blot分析其功能蛋白分子。5. WST-1法比较叁种DC疫苗、exosome疫苗刺激T淋巴细胞增殖情况，LDH法比较叁种DC疫苗、exosome疫苗诱导的CTL对HepG2特异性细胞毒效应，ELLSA法比较DC疫苗、exosome疫苗活化T淋巴细胞培养上清中分泌INF-γ的浓度。6．将携带AFP抗原的exosome致敏DC，WST-1法、LDH法、ELISA法检测DC抗肿瘤免疫学活性。【结果】1.成功构建了慢病毒表达载体PRV3-AFP，能有效的感染树突状细胞并使其分泌AFP蛋白。2.mDC成典型的树突状细构，表面HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD1a分子的表达明显高于imDC。3.成熟DC分泌的exosome(Dex)在电镜下为直径在50nm-100nm之间圆形或椭圆形小体，携带与DC功能相关的分子：ICAM-1、HLA-DR、CD86分子。4.慢病毒感染的DC刺激T淋巴细胞增殖能力显着高于AFP肽、全抗原处理组（P<0.05），前者刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ和对肝癌细胞HepG2特异性杀伤作用显着高于其他两组（P<0.05）。5.慢病毒处理组制备的DC疫苗和其分泌exosome疫苗比较，exosome疫苗刺激T淋巴细胞增殖能力和诱导的T细胞对HepG2细胞特异性杀伤能力稍强于DC疫苗（P<0.05），exosome疫苗刺激T细胞分泌IFN-γ能力和与DC疫苗比较差别无显着意义（P>0.05）。6. exosome致敏的DC能更有效的刺激T淋巴细胞增殖和产生细胞毒作用。【结论】1.成功构建AFP慢病毒，慢病毒负载DC和AFP肽、细胞裂解抗原负载方式比较能更有效的诱导抗肿瘤免疫，是一种更为有效的制备DC疫苗方式。2. Dex作为一种具有抗原提呈能力的亚细胞结构，可诱导外周血中T细胞增殖并发挥特异性抗肿瘤作用。exosome致敏的DC能产生更有效的抗肿瘤免疫作用。
朱登彦[8]2017年在《负载K-ras抗原的树突状细胞诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）对肺癌细胞的杀伤作用》文中提出目的:肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一,也是当前我国肿瘤死亡的主要原因之一。由于早期肺癌患者往往缺乏明显的临床症状,导致75%的患者就诊时已失去根治性手术的机会,而姑息性手术或常规放化疗仅能够部分改善症状,无法获得良好的缓解率,从而使得肺癌患者的中位生存期仅能达到12~18个月。除此之外,生物治疗也已经在临床治疗肺癌方面得到了广泛的应用,主要包括基因治疗及免疫治疗。而免疫治疗主要包括有细胞因子治疗、特异性主动免疫治疗和过继性细胞免疫治疗等。在人体内存在许多种抗原提呈细胞(Antigen presenting cell,APC,其中功能最为强大的是树突状细胞(Dendritic cells,DC),因此人们也越来越注意到树突状细胞在肺癌治疗中的作用。近年来,大量研究表明K-ras基因突变是非小细胞肺癌发展过程中的一个重要的负性预后因素,而K-ras基因已成为肺癌生物治疗的一个重要靶位。本研究拟通过在体和体外实验,探讨负载不同抗原的DC诱导的肿瘤特异性CTL对肺癌细胞的杀伤效应及其对荷瘤裸鼠的抑制作用。方法:联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rh GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导外周血树突状细胞(DC),分别使用表达K-ras突变体的肺癌细胞抗原、单纯K-ras突变体抗原表位肽和K-ras突变体抗原表位肽阳离子纳米颗粒致敏DC,进而通过诱导刺激T淋巴细胞得到特异性的CTL。流式细胞仪测定DC细胞表面标志,MTT法检测CTL细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤作用,ELISA试剂盒检测IL-12和IFN-γ表达水平。分别使用肺癌A549、NCH-446细胞系建立荷瘤裸鼠模型评价CTL体内抗肿瘤活性。结果:在体外实验中,与单纯K-ras突变体多肽相比,K-ras突变体表位肽阳离子纳米颗粒在低浓度时即可被DC有效提呈(P<0.05);与负载单纯K-ras突变体多肽和K-ras突变体表位肽阳离子纳米颗粒组相比,负载全瘤抗原组DC诱导产生的CTL对A549(K-ras+)和NCH-446(K-ras-)均有明显杀伤活性(P<0.05);而负载单纯K-ras突变体多肽、K-ras突变体表位肽阳离子纳米颗粒的DC诱导产生的CTL对A549(K-ras+)有特异性杀伤作用,而对NCH-446(K-ras-)细胞无杀伤作用(P>0.05)。体内实验结果显示,负载全瘤抗原的DC诱导产生的CTL对表达K-ras阳性(A549)的肺癌细胞具有较好的抑制作用,而对K-ras表达阴性(NCH-446)的肺癌细胞抑制作用与对照组相比无明显差异(P>0.05)。结论:低浓度的K-ras突变体表位肽阳离子纳米颗粒作用后,短时间内即可被DC有效提呈,且其诱导产生的CTL对表达K-ras突变体的肺癌细胞有特异性的杀伤作用;而负载肿瘤抗原的DC诱导CTL能够显着抑制肿瘤的生长速度进而提高荷瘤裸鼠的生存时间,这一结果为以后的研究奠定了基础,进而可以用于临床。
鲍传庆[9]2010年在《大肠癌患者自体树突状细胞免疫治疗技术临床应用研究》文中进行了进一步梳理大肠癌包括结肠癌和直肠癌,是最常见的消化道恶性肿瘤之一。在世界范围内,大肠癌发病率居恶性肿瘤第4位,已占全身恶性肿瘤的12%-15%,每年有102万新发病例和53万死亡病例。自上世纪70年代以来,我国大肠癌发病率和死亡率有不断上升趋势(以结肠癌上升为主),并且青年期(<30岁)大肠癌发病率高是我国大肠癌的一个显着临床特点。因大肠癌早期症状不明显,多数患者就诊时已发生区域或远处转移,单纯手术治疗不能显着改善患者预后,因此综合治疗成为目前治疗大肠癌的重要方法。生物治疗作为大肠癌综合治疗的组成部分,即可以独立运用,又可与手术及放、化疗结合,具有疗效高、特异性强、副作用小等优点,已成为研究的热点之一。树突状细胞(DC)是目前已知功能最强大的专职抗原递呈细胞,是机体T细胞特异性免疫应答的直接启动和调控者。它最大的特点是能够显着刺激初始型T细胞的增殖,在免疫反应的诱导中具有独特的地位。DC在外周组织中摄取抗原,加工分解成抗原肽与MHC-I/II类分子结合,然后移行到周围淋巴器官通过MHC分子递呈抗原给T淋巴细胞,激发特异性抗肿瘤免疫反应。与其他抗原递呈细胞相比,DC表达MHC-I/II类分子、共刺激分子和粘附分子的水平更高,因此在刺激T细胞增殖,抗肿瘤免疫中起重要作用。早在1995年国外学者就开展了DC治疗肿瘤的I期临床试验,以DC为载体开发的DC肿瘤疫苗在前列腺癌、恶性黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、脑胶质瘤、肾细胞癌等恶性肿瘤患者治疗中取得了显着的疗效。DC肿瘤疫苗用于结直肠癌的研究也表明其安全有效,不仅可降低结直肠癌患者癌胚抗原(CEA)水平,甚至可使肺部转移病灶消失。以DC为载体开发的DC肿瘤疫苗已成为现今最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗方法之一。由于大肠癌是一种免疫原性较弱的肿瘤,且肿瘤细胞缺乏共刺激分子或某些粘附分子,并可通过抗原调变、下调MHC分子表达等机制介导肿瘤免疫逃逸,从而影响免疫治疗效果。另有研究表明,肿瘤患者体内DC数量减少及功能缺陷,使其无法有效递呈肿瘤抗原,亦是肿瘤免疫逃逸的主要原因之一。因此,提高肿瘤患者体内DC的数量并维持其强大的抗原识别、呈递功能是实施抗肿瘤免疫治疗的关键措施之一。正因为此,应用足够数量和功能正常的DC细胞进行细胞免疫治疗或基于DC细胞的抗肿瘤疫苗研究工作越来越受到重视。对肿瘤患者提供外源性DC细胞进行细胞免疫治疗的方法现已经历了以下阶段的发展:早期多采用已知肿瘤相关抗原肽或肿瘤细胞mRNA修饰致敏DC,但疗效不佳。随着研究的深入,改用肿瘤全抗原致敏DC的方法,即,将肿瘤细胞与DC融合或用肿瘤细胞裂解物负载DC制成杂交疫苗,用于胃癌、肝细胞癌及大肠癌治疗的临床研究取得较好的抗肿瘤效果。而最近研究发现,DC表面表达多种热休克蛋白(HSP)受体(如CD91,CD40,TLR2/4或LOX1),HSP可作用于DC或单核细胞,刺激其产生细胞因子(IL-12,TNFa,IL-6等),增强机体非特异性免疫反应。2004年免疫学权威杂志《Immunity》报道,与多肽负载的DC相比,HSP70-抗原肽复合物负载的DC在体外激发CD8+ T的能力远远高于前者(1000倍)。提示如果将HSP与DC进行有机结合,发挥二者各自的优势,将会产生更强的免疫激发作用。有鉴于此,本研究对大肠癌患者热休克凋亡自体的大肠癌细胞抗原制备、自身的树突状细胞体外诱导、以及抗原负载方法等进行了初步探讨,并比较了分别负载热休克诱导凋亡大肠癌细胞株和肿瘤细胞裂解物两种不同抗原的DC对大肠癌细胞的杀伤效果,并探讨了热休克凋亡的人自体大肠癌细胞致敏自体的树突状细胞疫苗对大肠癌患者术后免疫功能的影响,为制备大肠癌细胞肿瘤疫苗研究提供技术基础。研究共分为叁个部分:第一部分自体大肠癌细胞负载树突状细胞的方法研究目的:建立自体热休克凋亡大肠癌(包括结肠、直肠癌)细胞抗原制备、树突状细胞体外诱导、以及抗原负载方法,为制备树突状细胞肿瘤疫苗提供技术基础。方法:采用酶消化法从手术切除的14例大肠癌新鲜组织获得单细胞悬液,热休克处理后用桦脂酸诱导其凋亡制备成细胞抗原;采集外周静脉血,分离单个核细胞,经GM-CSF与IL-4体外诱导成未成熟树突状细胞,负载细胞抗原后制备成DC肿瘤疫苗;苔盼蓝染色进行细胞总数及活细胞计数,计算细胞活率;用FITC-Annexin-Ⅴ和PI标记细胞,流式细胞仪检测,计算细胞凋亡率。软琼脂克隆法检测细胞体外成瘤能力;按《中华人民共和国药典》2005版第叁部规定的方法进行内毒素检测。结果: (1)肿瘤细胞抗原得率:(11.81±0.65)×106/g组织;平均凋亡率:(93.16±2.31)%;(2)imDC平均得率为(9.75±0.82)×106(/121.64)×106个PBMC,细胞活率>95%;imDC表型分析:CD11c+CD14-、CD11c+HLA-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+、CD11c+CD86+表达率分别为(87.58±2.56)%、(87.97±0.98)%、(2.21±0.69)%、(4.85±1.22)%、(5.02±0.95)%;(3)DC平均得率为(6.76±0.98)×106/(9.75±0.82)×106个imDC,细胞活率>95%,DC表型:CD11c+CD14-、CD11c+HLA-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+、CD11c+CD86+表达率分别为( 93.45±1.25 ) %、(89.79±1.35)%、(87.85±1.62)%、(70.74±6.45)%、(95.54±2.18)%。内毒素检测均合格(≤5 IU/mL)。结论:本方法稳定、安全、可靠,可制备出成熟DC。第二部分两种不同方式负载大肠癌细胞株的树突状细胞体外刺激淋巴细胞抗肿瘤活性的比较目的:比较树突状细胞以两种不同方式负载大肠癌细胞株体外刺激淋巴细胞的抗瘤活性。方法:分离30例大肠癌患者外周血单核细胞体外诱导DC,分别负载热休克诱导凋亡大肠癌细胞株和肿瘤细胞裂解物,以此刺激淋巴细胞作为效应细胞,大肠癌细胞株为靶细胞,MTT法测定效应细胞对靶细胞的杀伤作用。结果:负载热休克大肠癌细胞的DC与负载肿瘤细胞裂解物的DC都显示对靶细胞的杀伤活性,但前者的杀伤率显着高于后者(P<0.05)。结论:负载热休克肿瘤细胞的DC是一个更为有效的负载方式。第叁部分自体DC治疗对大肠癌患者术后免疫功能的影响目的:探讨热休克凋亡的人自体大肠癌细胞致敏的树突状细胞疫苗对大肠癌术后免疫功能的影响。方法:从大肠癌患者外周血单个核细胞中诱导DC,并用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4刺激活化,经热休克凋亡自体大肠癌细胞致敏制备DC疫苗。将28例大肠癌术后患者随机分为DC疫苗治疗组14例,化疗对照组14例。对两组病例治疗前后免疫功能、临床疗效进行观察比较。结果:DC疫苗组治疗后外周血CD3+、CD4+/CD8+及NK细胞比率较治疗前明显升高(P<0.05),且明显高于对照组化疗后的CD3+、CD4+/CD8+及NK细胞比率(P<0.05);DC疫苗治疗后患者血清IL-2、IL-12、IFN-γ水平较治疗前明显升高(P<0.05),且明显高于对照组(P<0.05),生存时间明显延长。结论:大肠癌术后行热休克凋亡自体大肠癌细胞致敏的DC疫苗治疗,可提高患者的细胞免疫水平。
古涛[10]2003年在《CD40配基化的肿瘤特异性树突状细胞的免疫治疗作用及其相关机制研究》文中认为树突状细胞(dendritic cells，DCs)是已知体内功能最强的专职性抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APC)，DCs能有效摄取、加工及递呈抗原，并能刺激未致敏T细胞的增殖和活化，是启动、调控并维持特异性免疫应答的中心环节。制备肿瘤特异性DCs疫苗免疫肿瘤患者，可有效地激发特异性的、持久的肿瘤免疫应答。这已成为目前肿瘤免疫治疗一个热点，并在临床试验中取得一些令人振奋的结果。然而，DCs临床应用仍有诸多关键问题亟待解决：DCs体外诱导的最佳途径及成熟调控；DCs疫苗接种的数量、次数及免疫途径；DCs疫苗体内的免疫原性和迁移能力；有效佐剂的配合使用和毒副作用的评价及解决方案等。 本研究首先评价了独特型免疫球蛋白负载的DCs(idiotype immunoglobulin pulsedDCs，Id-DC)疫苗和凋亡肿瘤细胞负载的DCs(apoptotic tumor cells pulsed DCs，AP-DC)疫苗的主动免疫治疗作用，继而着重研究CD40配基化的DCs激发肿瘤特异性免疫应答的机制，率先提出负性共刺激分子PD-L1和PD-L2的适度表达对于激发和维持肿瘤特异性免疫应答有着至关重要的作用，并对相关信号转导机制进行探讨。 第一部分 独特型免疫球蛋白负载的树突状细胞在B细胞淋巴瘤免疫治疗中的作用 目的：评价Id-DC疫苗在B细胞淋巴瘤荷瘤小鼠中的主动免疫治疗作用。 方法：利用细胞融合技术制备并筛选获得分泌Id的阳性克隆；体内诱生腹水和体外无血清培养法制备Id，优球蛋白沉淀法结合凝胶Suphecray-200过滤纯化Id；对Id-KLH络和物负载小鼠骨髓前体细胞来源的DCs，分别采用mCD40L-CHO细胞、TNF-α、LPS或单纯培养基刺激48h，制备四种Id-DC疫苗。体外采用~3H-TdR掺入试验和~(51)Cr释放试验测定DCs体外刺激T细胞增殖和CTL细胞杀伤毒效应。同时C D40配基化的肿瘤特异性树突状细胞的免疫治疗作用及其相关机制研究中文提要应用四种Id一DC疫苗开展SB4和SBS荷瘤小鼠的主动免疫治疗，观察肿瘤生长情况及小鼠生存期;并检测血清抗Id抗体的分泌。结果:获得2株稳定分泌Id的Baib/c小鼠B细胞淋巴瘤细胞SB4和SBS;四种成熟的ld一DC疫苗，均可以抑制肿瘤生长，延长生存期，从总体上评价CD40配基化的Id一DC疫苗疗效最佳护<0.05)，但均未有肿瘤完全缓解(compl改e remission，cR)的荷瘤小鼠。Id一DC联合Id一 KLH治疗可以激发更强的体液免疫应答，但不同Id一DC疫苗组之间结果无显着性差异(P>认05)。结论:CD4O配基化的Id一DC疫苗可以有效地延长荷瘤小鼠的生存期、抑制肿瘤生长，但针对单一Id位点激发不能诱导有效抗肿瘤免疫应答，整体疗效不佳，未有CR的荷瘤小鼠。
参考文献：
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[5]. 凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞疫苗抗肺癌的实验研究[D]. 杨新静. 苏州大学. 2006
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[7]. AFP基因修饰的DC细胞的分泌的exosome抗肿瘤作用研究[D]. 黄胜兰. 福建医科大学. 2014
[8]. 负载K-ras抗原的树突状细胞诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）对肺癌细胞的杀伤作用[D]. 朱登彦. 郑州大学. 2017
[9]. 大肠癌患者自体树突状细胞免疫治疗技术临床应用研究[D]. 鲍传庆. 苏州大学. 2010
[10]. CD40配基化的肿瘤特异性树突状细胞的免疫治疗作用及其相关机制研究[D]. 古涛. 苏州大学. 2003
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