1.沈阳医学院附属第二医院呼吸科 110002；2.沈阳医学院附属第二医院消化科 110002
【摘 要】目的：探讨DAPK基因甲基化在NSCLC检测中的临床意义。方法：采用基因测序法检测68例NSCLC、30例肺部良性疾病患者、15例健康体检者血清中DAPK启动子区域甲基化状况，分析其与临床特征的关系。结果：NSCLC患者DAPK甲基化检出率为39.70%，而肺部良性疾病患者和健康体检者未检出（P<0.05）。结论：DAPK基因甲基化可能被作为检测肺癌发生和发展的重要生物学指标。
【关键词】DAPK基因；非小细胞肺癌；甲基化
肺癌是当今导致肿瘤患者死亡的主要原因，其中，非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC）是最常见的癌症致死原因之一。已有研究表明，表观遗传学在NSCLC的发生和发展过程中起着重要作用。目前发现与人类疾病密切相关的表观遗过程主要有DNA甲基化、基因突变、DNA复制相关、染色体失活、非编码RNA等，其中，死亡相关蛋白激酶（Death-associated protein kinase，DAPK）是近年来新发现的抑癌基因，它是一种促凋亡丝氨酸/苏氨酸激酶，是参与凋亡过程的新型候选抑癌基因，在头颈部鳞癌[1]和胃癌[2]等肿瘤的发生、发展中起重要作用。本研究旨在探讨DAPK基因甲基化在NSCLC检测中的临床意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选择2014年9月-2015年12月于我院住院治疗的NSCLC患者68例，男42例、女26例，平均年龄55.5岁。均经组织病理学或细胞学证实，其中鳞癌29例、腺癌39例。TNM分期Ⅰ期1例、Ⅱ期13例、Ⅲ期27例、Ⅳ期27例，均未行放化疗。肺部良性疾病患者系我院呼吸科同期住院治疗的30例患者，其中肺部感染10例、慢性阻塞性肺疾病12例、气胸8例；15例健康志愿者为我院体检者。
1.2 方法
采集受试者清晨空腹静脉血5ml，4℃静置2h，离心分离血清，-80℃保存。采用QIAampBloodMiniKitDNA抽提试剂盒（QIAGEN公司，德国）提取血清DNA。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆将所提取的DNA中加入1μg鲑鱼精DNA（Sigma公司）作为载体，以终浓度为0.3mol/L的NaOH于40℃反应15min变性解链，依次加入新鲜配制的对苯二酚30μl和pH5.0的NaHSO3 520μl，轻柔混匀，以石蜡油覆盖，55℃避光反应14h。吸除石蜡油，提纯DNA，以终浓度为0.3mol/L的NaOH于室温处理10min脱硫，最后冷乙醇沉淀，所得DNA溶于30μl灭菌去离子水中，-80℃保存。
分别识别甲基化特异性（M）和非甲基化特异性序列（U）。DAPK具体序列为：M正义引物：5-GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC-3，M反义引物：5-CCCTCCCAAACGCCGA-3；扩增产物大小98bp。U正义引物：5-GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3，U反义引物：5-CAAATCCCTCCCAAACACCAA-3；扩增产物大小106 bp。PCR反应体系20μl，其中去离子水14.95μl，10×PCR缓冲液2μl，MgCl2（25mmol/L）1.2μl，dNTPs（10 mmol/L）0.25μl，上下游引物各0.2μl，修饰后的DNA模板1μl，TaqDNA聚合酶（10U/μl）0.2μl，充分混匀后置DNA扩增仪中扩增。反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s、62℃退火40s、70℃延伸40s，共33个循环，最后70℃延伸10min。将PCR产物经QIAquickPCR产物纯化试剂盒（QIAGEN公司，德国）纯化后，送上海生工公司进行测序。
1.3 统计学方法
采用SPSS12.0统计软件，定量资料采用t检验，分类资料采用χ2 检验或Fisher精确概率法检验。P<0.05为有统计学差异。
2 结果
68例NSCLC患者中，27例血清DNADAPK基因甲基启动子区域CpG岛发生异常的过度甲基化，检出率为39.70%；而良性肺部疾病患者和健康体检者血清未检出DAPK基因甲基化，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
DNA甲基化指DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶的过程。这种过程并没有改变基因序列，但能引起染色质结构、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达[3]。DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达，在疾病发生时，肿瘤细胞全基因组低甲基化是一个明显特征。总之，DNA的甲基化对维持染色体结构、X染色体失活、基因印记和肿瘤的发生都起着重要的作用。由此可见，去甲基化治疗原理是当前临床的热点研究，更是一个复杂的过程，尤其是在肿瘤严重威胁人类健康生活的今天，对于它的研究显得格外重要。
DAPK具有抑制细胞粘附、促细胞凋亡、抑制细胞迁移等作用，在肿瘤的发生、发展及转移中起到重要作用。DAPK 基因启动子区CpG 岛的甲基化，会导致DAPK表达的沉默，使一些凋亡信号不能通过DAPK诱导细胞凋亡，而使细胞有发展成肿瘤的可能性，这被认为是肿瘤发生的早期事件。在子宫颈癌，原发性中枢神经系统淋巴瘤中，DAPK基因启动子的甲基化明显高于正常对照组。DAPK基因启动子的甲基化还是判断复发和预后的重要指标，Tang 等在研究NSCLC基因启动子甲基化与其预后的关系时发现，DAPK基因启动子过甲基化的肿瘤患者5年生存率（56%）比非甲基化的肿瘤患者（92%）明显降低。DNA甲基化是肿瘤发生中的早期事件，可作为NSCLC早期诊断和筛查的主要手段。
总而言之，DAPK基因甲基化可能被作为检测肺癌发生和发展的重要生物学指标。更好地理解DAPK基因甲基化可能为肺癌的预防和干预治疗提供新的视野。
参考文献：
[1]李新敏，古雅丽，王香芝等.p16、DAPK和ESRβ基因启动子甲基化与宫颈癌的关系[J].诊断病理学杂志，2015，22（2）：78-81.
[2]龚喜云，陈静.大肠癌DAPK、FHIT基因启动子区的甲基化水平研究[J].河南医学研究，2014，23（1）：4-7.
[3]张云，薛绍礼，宋超等.非小细胞肺癌组织DAPK基因甲基化状态分析[J].现代检验医学杂志，2012，27（6）：17-18.
论文作者:徐曦1,王勇2
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2016年7月第8期
论文发表时间:2016/8/1
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