（1 暨南大学药学院 中药及天然药物研究所 广州 510632；
2 暨南大学理工学院 食品科学与工程系 广州 510632；3 深圳凯联健康科技有限公司 深圳 518000）
摘要：目的 研究石金钱龟龟甲粉对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。方法 构建免疫抑制小鼠模型，将小鼠随机分为5组，即空白对照组、模型对照组及石金钱龟龟甲粉高、中、低剂量组。小鼠以灌胃的方式给予不同剂量石金钱龟龟甲粉溶液后，分别测定各组脾脏指数、脾组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）和总抗氧化能力（T-AOC）水平，MTT法测T、B淋巴细胞增殖，ELISA法测脾细胞上清TNF-α和IL-2含量。结果 与模型组相比，石金钱龟龟甲粉各剂量组均能在一定程度上提高小鼠脾脏指数，T、B淋巴细胞增殖，提升SOD、CAT、T-AOC水平和降低MDA含量；石金钱龟龟甲粉高剂量组在提高TNF-α含量和IL-2含量方面较显著。结论 石金钱龟龟甲粉能有效拮抗环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制作用，提高免疫抑制小鼠的免疫力。
关键词：石金钱龟龟甲粉；免疫调节；免疫力
石金钱龟（Mauremys mutica），又名黄喉拟水龟，隶属爬行动物纲、龟鳖目、龟科、拟水龟属，国内主要分布于南方地区，国外主要分布于越南等地[1]。石金钱龟属于珍稀龟类，具有一定的观赏价值；以其为主要原料与中药配伍，既能起到抗癌解毒的功效，又能作为滋阴壮阳和延年益寿的高级滋补品，可以防治多种疾病和疑难杂症，且无任何副作用，民间常作为“药龟”进行食用，经济价值和营养价值极高[2]。目前，对石金钱龟已经成功进行殖和繁育[3]，但有关其龟肉、龟甲，龟肉深加工产品的生理活性成分的研究尚属空白。再者，人们在食用石金钱龟时也是多其龟甲丢弃。鉴于此，本实验将研究石金钱龟龟甲粉在增强机体免疫力方面的作用，旨在为石金钱龟的精深加工及其综合开发利用提供理论依据。
1 实验材料与方法
1.1实验材料及试剂
环磷酰胺：广东岭南制药有限公司，盐酸左旋咪唑：成都通德药业有限公司，四甲基偶氮唑蓝溶液（MTT）、胎牛血清、RPMI-1640培养基：美国Sigma公司，SD大鼠、大鼠IL-2、ACTH、IL-6、TSH、CORT、TNF-α ELISA试剂盒：南京建成生物工程研究所，超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、谷胱甘肽（GSH）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、一氧化氮（NO）试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒：碧云天生物技术有限公司。
1.2 石金钱龟龟甲粉制备
取新鲜石金钱龟龟甲（背甲和腹甲），洗净、晾干，粉粹，过100-200目筛，烘干，辐照灭菌，保存备用。
1.3 动物给药实验
SD大鼠50只，经过7天适应后，将动物随即分成空白对照组、模型对照组、实验组（石金钱龟龟甲粉低、中、高剂量组，其中低剂量组：100 mg/kg/d、中剂量组：200 mg/kg/d，高剂量组：400 mg/kg/d）。除空白对照组外，各组小鼠第1、2、3天腹腔注射环磷酰胺60 mg/kg，建立免疫抑制小鼠模型。造模后高、中、低剂量组分别灌胃石金钱龟龟甲粉溶液，连续灌胃30天，空白对照组、模型对照组给予等体积的生理盐水，记录体重及摄食量[4]。
1.4小鼠脾淋巴细胞的转化实验
取脾脏（无菌操作），研磨过200目网，制备成无菌单细胞悬液，加入到96 孔培养板中，每孔细胞为5×105个。设空白对照组（只加细胞悬液），石金钱龟龟甲粉组（低中高剂量组，低剂量组：100 mg/kg、中剂量组：200 mg/kg，高剂量组：400 mg/kg），每组设3个复孔。置37℃、5% CO2孵箱中培养60 h[5]。取出培养板，每孔加入15 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h后，每孔加入200 μL二甲基亚砜，微量振荡器混匀，待紫色结晶完全溶解后于570 nm波长处测OD570nm.
1.5 样本收集
大鼠连续服用30天后将大鼠乙醚麻醉后处死，取各组大鼠的脑组织、肾组织、胸腺和脾脏，称重。动脉取血5 mL，注入抗凝管中，3200 r/min，5 min离心得到血浆[2]。
1.6免疫指标测定
根据体重，利用肾上腺（胸腺/脾脏）指数肾上腺（胸腺/脾脏）重（体重，计算各组大鼠的肾上腺、胸腺和脾指数。利用ACTH、IL-2、IL-6、CORT、TSH、TNF-α等试剂盒测定大鼠血浆干扰素、白细胞介素、促甲状腺激素、促肾上腺皮质激素、皮质酮，肿瘤坏死因子等。
1.7 抗氧化作用研究
用冷生理盐水制成10 %组织匀浆，3000 r/min离心15 min，收集上清液，分别按照NO、SOD、CAT、MDA、NKC和T-AOC试剂盒操作说明，测定脾脏中SOD、NO、NKC、CAT、MDA和T-AOC水平。
1.8 数据处理
测定结果以x ±s表示，采用SPSS16.0软件对结果进行t检验分析。
2 结果分析
2.1 石金钱龟龟甲粉对小鼠脾脏指数的影响
由表Ⅳ可知，模型对照组小鼠脾脏组织SOD、CAT、T-AOC活力均低于空白对照组，MDA含量则高于空白对照组，说明我们成功构建免疫抑制模型。与模型对照组相比，石金钱龟龟甲粉高剂量组SOD、CAT、T-AOC活性均明显升高，MDA含量明显减少，具有显著性差异（P＜0.05）。
3 讨论
脾脏是动物重要的免疫器官，脾脏质量的增加，相对表明机体免疫功能增强。环磷酰胺是一种烷化类的免疫抑制剂，能抑制免疫反应，引起肝脏和抗氧化酶的损害。因此本实验通过腹腔注射环磷酰胺，建立免疫低下小鼠模型[6]。当灌胃石金钱龟龟甲粉后，各剂量组小鼠脾脏指数均增加，并且随着剂量升高作用增强，说明石金钱龟龟甲粉能改善环磷酰胺引起的小鼠脾脏萎缩。石金钱龟龟甲粉各剂量组T、B淋巴细胞转化均显著增强，并呈一定的剂量依赖，说明石金钱龟龟甲粉能提高脾淋巴细胞转化能力，石金钱龟龟甲粉能增加IL-2和TNF-α分泌量来调节机体免疫功能。
正常机体拥有一套完整的抗氧化防御体系，包括SOD、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶等，从而机体内自由基保持一种动态平衡。但当抗氧化系统遭到破坏时，就会产生过量的MDA等脂质过氧化物，从而引起细胞损伤[7-8]。小鼠皮下注射环磷酰胺后，脾组织中T-AOC、SOD、CAT水平明显低于空白对照组，MDA含量显著高于空白对照组，表明机体抗氧化功能显著降低，自由基清除能力减弱。当灌胃石金钱龟龟甲粉后，发现石金钱龟龟甲粉各剂量组小鼠脾组织中T-AOC、SOD、CAT活性提高和MDA含量降低，并随剂量增加作用明显，说明石金钱龟龟甲粉可以通过提高免疫抑制小鼠抗氧化酶活力、降低MDA含量、恢复机体抗氧化能力从而增强机体免疫功能。
综上所述，石金钱龟龟甲粉能促进T、B淋巴细胞增殖，促进细胞因子分泌，提高抗氧化酶的活力，全面发挥对免疫抑制小鼠的免疫调节作用和增强其抗氧化能力。本实验通过对石金钱龟龟甲粉免疫调节和抗氧化作用的体内研究，为进一步探讨其作用机制及两者的关联性提供了理论依据，也为石金钱龟龟甲粉的开发利用提供了一定的参考。
参考文献：
[1] 龚世平，葛研，陈国玲，刘莉，陈银洁，刘惠宁. 广东鼎湖山国家级自然保护区爬行动物多样性与保护[J]. 四川动物. 2012（03）.
[2] 郑光明，马丽莎，朱新平，刘毅辉，陈永乐，罗建仁. 平胸龟年龄与生长及雌雄差异的比较[J]. 华南农业大学学报. 2008（03）.
[3] 朱新平，编著. 淡水龟高效养殖技术一本通[M]. 化学工业出版社，2010.
[4] Jacob D. Estes. Role of collagen deposition in lymphatic tissues and immune reconstruction during HIV-1 and SIV infections[J]. Current HIV/AIDS Reports . 2009（1）.
[5] 李映菊. Th17型细胞在乙型肝炎病毒感染小鼠模型中的作用及其分化机制[D]. 南华大学 2013.
[6] 陈明发. NOD1/NOD2介导的天然免疫应答对HBV持续复制的影响及其机制[D]. 华中科技大学 2012.
[7] 秦绪军，何伟，海春旭，梁欣，张晓迪，赵康涛，陈宏莉，刘瑞. 复合抗氧化剂对荷瘤大鼠60Coγ射线局部照射时血液氧化损伤的影响[J]. 第四军医大学学报. 2002（09）.
[8] 万云焱. 重组人血管内皮抑素在博来霉素诱导肺纤维化大鼠模型中的作用及机制研究[D]. 山东大学 2013.
论文作者:刘杰1,邱瑞霞2,单凯3
论文发表刊物:《健康世界》2017年第5期
论文发表时间:2017/5/8
标签：龟甲论文; 小鼠论文; 金钱龟论文; 脾脏论文; 剂量论文; 免疫论文; 对照组论文; 《健康世界》2017年第5期论文;