王三斌[1]2000年在《TJU103对异基因骨髓移植移植物抗宿主病的抑制作用》文中指出目 的： 探讨小分子有机化合物TJU103对异基因骨髓移植GVHD的影响，为进一步研究新的抗GVHD药物提供实验依据。 方 法： 1．建立完全异基因骨髓移植及半相合骨髓移植GVHD的动物模型。以近交系C57BL/6（H-2~b）小鼠作为供者，BALB/c（H-2~d）作为受者，给予受者9.0Gy全身照射，进行骨髓细胞、脾细胞移植，建立完全异基因骨髓移植GVHD模型；以C57BL/6（H-2~b）作为供者，以（BALB/c×C57BL/6）F_1（H-2~(d/b)（以下简称CB6F1）作为受者，预处理及移植方法同前，建立半相合骨髓移植GVHD模型。 2．用单向混合淋巴细胞培养方法检测TJU103对T淋巴细胞增殖的影响。 3．利用C57BL/6→BALB/c和C57BL/6→CB6F1 GVHD模型评估TJU103降低GVHD发生的作用。 结 果： 1．将供者4.5×10~6骨髓细胞、3×10~7脾细胞移植给受者，完全异基因移植和半相合移植均全部出现典型GVHD症象，并于移植后11～17天内相继死亡。表明已成功建立了具有典型GVHD表现的动物模型。 2．JU103具有显著抑制T细胞活化增殖效应的作用。抑制作用呈剂量依赖性，在25μg/ml浓度时，抑制83％的细胞增值效应。 3．移植后第一周每日注射50μgTJU103，可使完全异基因移植小鼠3O天生存率由0n0增至8门0（＜0刀1），中位生存期由15天延长至3O天以上①＜O．01）；可使半相合移植小鼠30天生存率由0八0增至9／10（＜0．of），中位生存期由 14 天延长至 30天以上（＜0．of）。 结 论： 1．C57BL／6—BALB／c，C57BL／6—CB6FI 是良好的完全异基因及半相合移植GVHD动物模型。 2．TW103在体外可显著抑制T淋巴细胞的增殖效应。 3．TW103可显著降低G删的发生率。
张磊[2]2007年在《靶向CD4分子的小分子免疫抑制剂的筛选及活性鉴定》文中进行了进一步梳理同种异体器官(骨髓、肾、肝、胰腺等)移植已成为治疗恶性肿瘤或器官衰竭的有效治疗手段之一，但移植后的并发症如移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)仍是影响移植成功率的主要因素之一。研究证明T淋巴细胞及它所介导的免疫应答效应与GVHD的发生和发展有着密切的关系；通过对免疫系统包括T细胞功能的抑制可有效预防或治疗GVHD已得到证实。近年来的研究表明CD4~+T细胞是启动移植物排斥反应中最重要的细胞亚群，CD4~+T细胞表面CD4分子与MHC-Ⅱ类分子之间的相互作用是CD4~+T细胞激活并介导免疫应答反应的关键。研制靶向CD4分子的小分子药物，特异性阻断由MHC-Ⅱ类分子与CD4~+T细胞相互作用所介导的移植排斥反应是目前免疫学和药学所关注的焦点。基于CD4分子与MHC-Ⅱ类分子之间相互作用的立体构型的理论分析，李松教授研究组应用计算机虚拟筛选以及分子对接技术从非肽类有机化合物库中筛选获得了一组靶向CD4分子D1功能表位的小分子化合物，为本研究课题提供了可用于免疫抑制研究靶向CD4的小分子化合物。本课题拟通过体外生物学试验从19种化合物中筛选具有免疫抑制作用的小分子化合物，并建立同种异基因骨髓移植动物模型，体内进一步评价靶向CD4分子的小分子化合物对GVHD的预防作用。本课题首先应用表达CD4分子的HPB-ALL细胞(T淋巴白血病细胞系，CD4~+阳性率≥90％)和表达MHC-Ⅱ类分子的Daudi细胞(B淋巴白血病细胞系，MHC-Ⅱ类分子阳性率≥90％)、健康人外周血单个核细胞的混合淋巴细胞培养(MLR)方法，对虚拟筛选获得的19个小分子化合物进行检测，MTT法结果证实19个化合物中的5个(JK、E4、J4、A5和J2)化合物具有剂量依赖性的免疫抑制作用，外周血MLR ~3H-TdR掺入法的结果进一步验证了JK、E4、J4、A5和J2的良好免疫抑制作用。为了进一步验证具有较好免疫抑制作用的J2化合物对GVHD的预防和治疗效应，本课题以近交系C57BL／6(H-2~b)小鼠作为供者，BALB／c(H-2~d)小鼠作为受者，给予受者鼠8Gy~(60)Co全身照射，4-6小时后进行骨髓细胞与脾细胞移植。通过对受体鼠H-2~b基因的检测、生存周期和器官组织的病理学分析，结果初步证实本课题所建立的异基因骨髓移植动物模型具有急性移植物抗宿主病(aGVHD)的基本特征，可用于对以上小分子化合物预防或治疗aGVHD的评价。在此动物模型上观察了化合物J2口服给药后对移植后aGVHD的预防和治疗作用，结果表明化合物J2能够有效延长GVHD小鼠的生存时间，并能减轻aGVHD所至的组织病理损伤程度。提示小分子化合物J2具有良好的免疫抑制作用。以上结果初步证实了基于CD4分子与MHC-Ⅱ类分子之间相互作用的立体构型为依据筛选获得的CD4靶向小分子J2化合物，具有较好免疫抑制作用，并对异基因骨髓移植所致的aGVHD有预防和治疗作用。
陈永乐[3]2003年在《Tju103和CTLA4Ig联合诱导MHC非匹配同种异基因小鼠骨髓移植免疫耐受》文中认为MHC不相合骨髓移植移植失败和相关并发症明显加重。其中，移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是主要并发症和致死原因。应用非特异性免疫抑制剂或者剔除移植物中T细胞均能明显降低GVHD的发生，但是出现移植失败率、原发病复发率和感染率增高。因此，有必要保留移植物中的T细胞，对其进行调节，使其对受者产生特异性免疫耐受。通过阻断共刺激信号的传导，诱导T细胞无能是肯定、有效的诱导特异性耐受方法。但因为共刺激信途径众多，难以完全阻断，效果有限，因此需要进行多途径的调节。最近合成的Tju103是特异结合CD4分子上与MHC-Ⅱ结合的位点的小分子有机化合物，调节抗原信号，能有效降低同种异基因皮肤移植排斥和同种异基因骨髓移植GVHD发生。CTLA4-Ig是最有效的共刺激信号阻断剂之一。联用Tju103和CTLA4-Ig，同时调节抗原和共刺激双信号传导，可能对T淋巴细胞免疫抑制更深入，但能否保持CTLA4-Ig的特异性免疫耐受的诱导作用，不清楚。本实验联合应用Tju103和CTLA4-Ig进行T细胞活化的双信号调节，观察调节对供者T细胞的表型、功能以及异基因小鼠骨髓移植后GVHD、GVL(graft versus leukemia)效应和抗感染的影响，旨在探索一条能降低GVHD而保留GVL效应和抗感染能力的异基因骨髓移植特异性免疫耐受途径。 实验方法 (1)供鼠T淋巴细胞无能的诱导及表型和功能鉴定：分离供者(C57BL／6~(H-2b)鼠)T淋巴细胞，在受者抗原(经MitC处理的BALB／c~(H-2d)或CB6F1~(H-2bd)鼠巨噬细胞)存在下和CTLA4-Ig及Tju103一起孵育，进行T细胞活化双信号调节。FCM检测经调节的供者T细胞的表型的改变，甲基琼脂造血祖细胞集落培养观察对造血的作用，MLR和MTT法鉴定对增殖反应性和细胞毒效应的影响。 (2)EL%11红白血病小鼠模型建立:从尾静脉给受鼠(BALB/c鼠和CB6FI鼠)接种可移植EL%H红白血病细胞，建立小鼠红白血病模型并进行鉴定。 (3)异基因小鼠骨髓移植GVHD模型建立:以C57BL/6鼠为供者，BALB/。和cB6FI鼠经“0C0全身照射后作为受者，进行C57BLz6H一Zb~BALBzeH一Zd和C57BL/6H一Zb~CB6FIH一Zbd小鼠骨·髓移植，建立完全异基因和半相合小鼠骨髓移植GVHD模型并进行鉴定。 (4)异基因小鼠骨髓移植实验:以C57BU6鼠为供者，以BALB/c或CB6FI鼠为受者，在上述模型基础上进行小鼠完全异基因和半相合骨髓移植实验，观察经cTLA4一Ig和Tju103联合调节的供鼠T细胞对移植后骨髓植入、GVHD、GVL效应、抗感染和皮肤移植耐受的影响 实验结果(1)T细胞增殖反应和杀伤效应:在耐受诱导源存在下，CTLA4一19和cTLA4一I留Tju103显著抑制C57BL/6鼠T细胞对己接触抗原 (BALB/c或CB6FI鼠)的增殖反应(抑制率:完全异基因移植为77.67士0.58%、87.67士1.16%;半相合移植为80.76士2.68%、89.54士3.15%)，但保持对未接触抗原和白血病的反应性(抑制率:完全异基因移植分别为4.33士0.58%、4.67士1.16%，4.27士0.巧%、4.67士0.58%;半相合移植为4.41士0.95%、5.42士0.94%，6.10士0.88%、6.73士0.91%)，显著抑制对己接触抗原的杀伤活性(抑制率:完全异基因移植分别为71.n士1.07%、76.85士2.69%;半相合移植为87.80士1.14%、95.12士2.56%)，而保留对未接触抗原和白血病细胞的杀伤活性(抑制率:完全异基因移植分别为0.69士0.69%、1.27士0.27%，1.24士1.38%、2.07士1.32%;半相合移植为3 .31士0.49%、3.04士0.52%，2.20士0.96%、3.35士1.04%);Tjul03则表现为非特异性的抑制(对接触抗原、未接触抗原和白血病的增殖反应和杀伤抑制:完全异基因移植分别为80.33士1.16%、80.33士0 .58%、80.67士0.58%，72.61士0.63%、74.25士0.74%、71.09土1.66%:半相合移植为81.36士2.84%、79.52士1.67%、79.59士1.75%，87.68士0.92%、83.58士1.57%、88.72士1.84%)。提示有耐受诱导源时CTLA4Ig和CTLAI岁Tjul03诱导特异性免疫耐受(p<0.05)，两者组合效果最好(p<0.05);而Tjul03则诱导非特异性免疫耐受 (P<0.05)。没有耐受诱导源，CTLA4一Ig、两者联合和Tju103一样诱导非特异性免疫抑制(P>0.05)。(2)细胞集落培养:无处理、CTLA4一lg、芍ul03和两者联合处理的供者T细胞，对CFU一GM形成的影响没有明显差别(p>0.05)，CTLA4一Ig、Tjul03和两者联合明显提高BFu一E形成(完全异基因移植分别提高51.12士8.45%、35‘71士11，3%和59.18士14.57%，半相合移植分别提高79.27士10.%%、74.39士13.15%和93.90士18.320/0)印<0 .05)，但两两间无显著差别印>0.05)。(3)供鼠T细胞表面标志:CTLA4一Ig、Tjul02及两者联合均明显抑制供者T细胞CD69表达(抑制率:完全异基因移植分别为78.06士5.37%、79.58士16.62%和89.39士21.18%，半相合移植分别为78.17士9.55%、77.82士14.40%和89.26士13.07%)(P<0.05)，以两者组合最显著(P<0.05)。CTLA4一Ig和两者联合提高供鼠T细胞高表达儿唯y49C)(完全异基因移植分别增加表达4.07士0.57倍和5.35士0.68倍，半相合分别增加5.37士0.87倍和6.04士1 .03倍) (P<0.05)?
王三斌, 郭坤元, 胡灯明, 尹波[4]2006年在《TJU103对小鼠同种异基因造血干细胞移植模型GVHD的预防作用》文中研究指明目的探讨TJU103对小鼠同种异基因造血干细胞移植模型移植物抗宿主病(GVHD)是否起预防作用。方法(1)用单向混合淋巴细胞培养方法检测TJU103对T淋巴细胞增殖的影响;(2)以BALB/c(H-2d)、CB6F1(H-2d/b)分别作为完全异基因移植和半相合基因移植的受鼠,给予9.0Gy全身照射后4h,单纯照射组经尾静脉注射0.3mlD-Hank's液,不进行细胞移植;对照组经尾静脉注射C57BL/6小鼠混合细胞悬液(4.5×106骨髓细胞+3.0×107脾细胞),但不进行其他治疗处理;实验组经尾静脉注射C57BL/6小鼠混合细胞悬液(4.5×106骨髓细胞+3.0×107脾细胞)+TJU103(终浓度25μg/ml),此后腹腔注射TJU10350μg/d,共7d,然后观察其造血恢复、植入及GVHD的情况。结果(1)TJU103可以显著抑制T细胞活化增殖,其抑制作用呈剂量依赖性,在25μg/ml浓度时,可以抑制83%细胞增殖。(2)由于没有给予GVHD防治措施,对照组受鼠GVHD的发生率和死亡率分别为10/10和10/10;而完全异基因移植实验组小鼠GVHD发生率仅为2/10,30d生存率增加至8/10(P<0.01),中位生存期延长至30d以上(P<0.01);半相合基因移植实验组小鼠GVHD发生率为1/10,30d生存率增加至9/10(P<0.01),中位生存期延长至30d以上(P<0.01)。结论TJU103不仅可以显著抑制体外T淋巴细胞增殖效应,而且可显著降低小鼠同种异基因造血干细胞移植模型GVHD的发生率。
张立成[5]2004年在《TJU103联合CTLA4-Ig诱导HLA半相合移植供者T细胞免疫耐受实验研究》文中研究表明异基因骨髓移植(allo-BMT)是目前治疗恶性血液病、再生障碍性贫血，以及遗传性疾病等的最有效方法。但是，HLA完全相合供源严重不足，迫使人们转向HLA半相合allo-BMT研究。与HLA全相合allo-BMT相比，遗传上的差异加大，使得移植物抗宿主病(GVHD)发生率和严重程度明显增加，严重影响受者的生活质量，甚至导致死亡。目前普遍认为，移植物中的T细胞，在引发和放大GVHD病理过程中发挥重要作用，但供者T细胞同时又是移植物抗白血病(GVL)的效应细胞。因此，常规非特异性免疫抑制剂的应用，或者移植物中T细胞的去除，尽管明显降低了GVHD发生率，但白血病复发、移植失败和感染发生率却相应增加，如何诱导供者T细胞保留GVL效应，而又不引发GVHD，其核心问题是建立allo-BM的特异性免疫耐受。 免疫耐受是机体免疫系统在接触某种抗原后，所产生的对该抗原的特异性免疫无应答状态，它只针对耐受原具有特异性，而对于其它抗原仍具有反应性。目前的研究大多采用单克隆抗体，或CTLA4-Ig阻断B7／CD28、CD40／CD40L共刺激通路诱导免疫耐受，均显示出了初步的效应，但对于HLA半相合allo-BMT而言，这种免疫耐受的强度是不够的，有必要探索新的方法和组合。T细胞活化需要两种信号共同参与，第一信号是由TCR介导的抗原特异性信号，第二信号为共刺激信号。T细胞激活的双信号理论，为我们联合应用TJU103和CTLA4-Ig调节信号传递，诱导免疫耐受奠定了理论基础。TJU103是一种异烟腙类小分子有机化合物，能够特异性地与CD4分子的CDR3区结合，阻断CD4／MHC-Ⅱ的相互作用。体内外研究证实TJU103能够抑制超抗原诱导的CD4~+T细胞的活化、增殖和炎性细胞因子的分泌。动物体内应用能够明显延长异基因小鼠皮肤移植存活时间，但TJU 103能否与CTLA4一Ig联合在诱导免疫耐受中发挥作用，尚需进一步研究。 本研究根据T细胞激活的双信号理论，选择人外周血单个核细胞为研究对象，在受者正常组织抗原作为耐受原的条件下，联合应用TJU103和CTLA4一Ig作为干预因素，通过HLA半相合供受者单相混合淋巴细胞反应(MLR)体系，进行了体外对照性研究。利用供者T细胞活化、增殖和细胞因子分泌等效应功能变化作为评价指标，观察了TJU 103联合CTLA4一Ig应用，在诱导供者T细胞免疫耐受中的作用，为临床HLA半相合移植保留GVL、减轻GVHD提供理论和实验依据。 实验方法 L TJU103或CTLA4一1g单独应用对供者T细胞增殖活性的影响 以亲缘HLA半相合健康供者(父母巧例，子女3例，同胞2例)外周血单个核细胞(P BMC)为反应细胞。急性白血病完全缓解期患者正常PBMC为刺激细胞和耐受原，体外建立HLA半相合供、受者单相混合淋巴细胞培养(MLC)体系，分别取100匹反应细胞和刺激细胞接种%孔培养板，每个样本接种5个复孔，在37℃、体积分数为5%的coZ条件下培养24小时后，实验组各孔分别加入各自不同浓度(1林g/ml、10林g/ml、.50林留ml、1 00林g/ml)的TJU 1 03和CTLA4一19，反应细胞和刺激细胞组为对照组。相同条件下继续培养5天，培养结束前6h加入20林L浓度为smg/ml的MTT液，离心培养板，弃上清100林L，加入等量DMso，震荡5分钟，酶标仪测492nm处吸光度值(A492)。MTT法检测供者T细胞在单相MLC体系中的增殖反应，观察单独应用TJU103或CTLA4一Ig对供者T细胞增殖活性的影响。计算淋巴细胞增殖抑制率。 淋巴细胞增殖抑制率(%)=(1一实验组A御对照组A值)xloo%。 2、TJU103联合CTLA4一1g应用对供者T细胞增殖活性的影响 相同方法体外建立HLA半相合供、受者单相MLC体系。根据方法一的结果，固定一种TJU 103浓度，分别与4种不同浓度cTLA4一Ig (1林g/ml、10林留血1、50林g/ml、100林留ml)联合，加入MLe体系，利用MTT法检测供者T细胞在MLC体系中的增殖反应，根据单相混合淋巴细胞增殖反应的结果和淋巴细胞增殖抑制率，筛选TJu 103和cTLA4一Ig一4一联合应用的最佳组合，观察联合应用TJu 103和cTLA4一Ig对供者T细胞增殖活性的影响。 3、TJu103联合cTLA4一Ig应用对供着T细胞特异性增殖和细胞毒活性的影响 以供者单个核细胞为反应细胞，取等量丝裂霉素C灭活的受者单个核细胞为刺激细胞和耐受原，体外建立单相MLC体系。在37℃、体积分数为5%的COZ条件下培养24小时后，实验组加入TJU103和cTLA4一Ig在6孔培养板中行初次混合淋巴细胞培养，继续培养48h后收集细胞转移到%孔板作为反应细胞，加入不同刺激细胞后行再次混合淋巴细胞培养72h，MTT法检测各组淋巴细胞的增殖反应。根据刺激细胞的不同，实验可分为以下3组:①刺激细胞为同源受者单个核细胞;②刺激细胞为受者原代白血病细胞;③刺激细胞为第三方供者单个核细胞，同时设相应的对照组。 以上述初次混合淋巴细胞培养72h后的供者单个核细胞为效应细胞，新鲜分离的同源受者单个核细胞和第三方供者单个核细胞，以及解冻的受者原代白血病细胞分别作为靶细胞，接种%孔板，每个标本设5个复孔，各加入浓度为smg八nl的MTT液20匹，培养6小时后弃去100匹培养液，加入与培养液等量的DMSO，震荡10分
参考文献：
[1]. TJU103对异基因骨髓移植移植物抗宿主病的抑制作用[D]. 王三斌. 第一军医大学. 2000
[2]. 靶向CD4分子的小分子免疫抑制剂的筛选及活性鉴定[D]. 张磊. 中国人民解放军军事医学科学院. 2007
[3]. Tju103和CTLA4Ig联合诱导MHC非匹配同种异基因小鼠骨髓移植免疫耐受[D]. 陈永乐. 中国人民解放军第一军医大学. 2003
[4]. TJU103对小鼠同种异基因造血干细胞移植模型GVHD的预防作用[J]. 王三斌, 郭坤元, 胡灯明, 尹波. 南方医科大学学报. 2006
[5]. TJU103联合CTLA4-Ig诱导HLA半相合移植供者T细胞免疫耐受实验研究[D]. 张立成. 第一军医大学. 2004
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