古涛[1]2003年在《CD40配基化的肿瘤特异性树突状细胞的免疫治疗作用及其相关机制研究》文中研究说明树突状细胞(dendritic cells，DCs)是已知体内功能最强的专职性抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APC)，DCs能有效摄取、加工及递呈抗原，并能刺激未致敏T细胞的增殖和活化，是启动、调控并维持特异性免疫应答的中心环节。制备肿瘤特异性DCs疫苗免疫肿瘤患者，可有效地激发特异性的、持久的肿瘤免疫应答。这已成为目前肿瘤免疫治疗一个热点，并在临床试验中取得一些令人振奋的结果。然而，DCs临床应用仍有诸多关键问题亟待解决：DCs体外诱导的最佳途径及成熟调控；DCs疫苗接种的数量、次数及免疫途径；DCs疫苗体内的免疫原性和迁移能力；有效佐剂的配合使用和毒副作用的评价及解决方案等。 本研究首先评价了独特型免疫球蛋白负载的DCs(idiotype immunoglobulin pulsedDCs，Id-DC)疫苗和凋亡肿瘤细胞负载的DCs(apoptotic tumor cells pulsed DCs，AP-DC)疫苗的主动免疫治疗作用，继而着重研究CD40配基化的DCs激发肿瘤特异性免疫应答的机制，率先提出负性共刺激分子PD-L1和PD-L2的适度表达对于激发和维持肿瘤特异性免疫应答有着至关重要的作用，并对相关信号转导机制进行探讨。 第一部分 独特型免疫球蛋白负载的树突状细胞在B细胞淋巴瘤免疫治疗中的作用 目的：评价Id-DC疫苗在B细胞淋巴瘤荷瘤小鼠中的主动免疫治疗作用。 方法：利用细胞融合技术制备并筛选获得分泌Id的阳性克隆；体内诱生腹水和体外无血清培养法制备Id，优球蛋白沉淀法结合凝胶Suphecray-200过滤纯化Id；对Id-KLH络和物负载小鼠骨髓前体细胞来源的DCs，分别采用mCD40L-CHO细胞、TNF-α、LPS或单纯培养基刺激48h，制备四种Id-DC疫苗。体外采用~3H-TdR掺入试验和~(51)Cr释放试验测定DCs体外刺激T细胞增殖和CTL细胞杀伤毒效应。同时C D40配基化的肿瘤特异性树突状细胞的免疫治疗作用及其相关机制研究中文提要应用四种Id一DC疫苗开展SB4和SBS荷瘤小鼠的主动免疫治疗，观察肿瘤生长情况及小鼠生存期;并检测血清抗Id抗体的分泌。结果:获得2株稳定分泌Id的Baib/c小鼠B细胞淋巴瘤细胞SB4和SBS;四种成熟的ld一DC疫苗，均可以抑制肿瘤生长，延长生存期，从总体上评价CD40配基化的Id一DC疫苗疗效最佳护<0.05)，但均未有肿瘤完全缓解(compl改e remission，cR)的荷瘤小鼠。Id一DC联合Id一 KLH治疗可以激发更强的体液免疫应答，但不同Id一DC疫苗组之间结果无显着性差异(P>认05)。结论:CD4O配基化的Id一DC疫苗可以有效地延长荷瘤小鼠的生存期、抑制肿瘤生长，但针对单一Id位点激发不能诱导有效抗肿瘤免疫应答，整体疗效不佳，未有CR的荷瘤小鼠。
陈成[2]2005年在《CD40信号对小鼠树突状细胞极化Th细胞和上调B7-H3分子表达的作用及其生物学意义》文中指出树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是目前已知的体内最重要的专职性APC,能摄取、加工及提呈抗原,刺激初始型T细胞的活化和增殖,是启动、调控并维持特异性免疫应答的中心环节。DCs介导的T细胞免疫应答在机体抗肿瘤免疫中发挥主导作用,包括对抗原特异性T细胞的诱导、激发、扩增和功能介导等。业已表明,DCs和Th细胞的极化诱导密切相关,不同的抗原致敏和致DCs成熟信号可能会赋予DCs不同的介导T细胞极化能力。凋亡肿瘤细胞可以提供DCs丰富的肿瘤抗原,能够提供多个MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ两类途径的抗原表位,因而采用凋亡肿瘤细胞作为抗原可以有效获得肿瘤特异性树突状细胞。CD40/CD40L信号被认为是DCs发育成熟至关重要的信号,CD4~+T细胞与DCs表面CD40L-CD40的相互作用对T细胞和DCs的功能均产生重要影响。利用CD40信号激发在体外可望获得表型和功能上成熟的树突状细胞。 本研究第一部分利用共聚焦显微镜观察了未成熟树突状细胞对凋亡肿瘤细胞的摄取,采用流式细胞术和~3H-TdR掺入实验研究了CD40和TNFR信号对凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞表型的促成熟作用和促T细胞增殖效应,采用胞内染色、流式细胞术和ELISA探讨了CD40配基化的肿瘤特异性树突状细胞对Th细胞的极化作用,发现CD40较TNFR信号更能增强树突状细胞介导Th细胞向Th1细胞极化的能力。 论文第二部分试图从共刺激分子的激发和调节性表达角度探讨DCs对Th细胞极化的作用。首先采用RT-PCR和流式细胞术分析了CD40信号对树突状细胞表面B7-H3分子表达的调节作用,发现了CD40信号能上调树突状细胞上B7-H3分子的表达,并进一步采用特异性抗B7-H3抗体阻断实验、~3H-TdR掺入实验和ELISA发现了B7-H3分子的上调性表达有利于树突状细胞介导Th1型免疫应答。同时还发现CD40信号促进凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞IFN-γ的分泌,推测CD40信号上调树突状细胞上B7-H3分子的表达可能和其介导IFN-γ
周桓[3]2005年在《激发型CD40单抗联合CTL对人源化SCID小鼠B细胞淋巴瘤免疫治疗的实验研究》文中提出CD40分子属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员,为Ⅰ型跨膜糖蛋白。人CD40分子于八十年代中期被发现,分子量约为48KD,其基因定位于20q11-20q13.2,cDNA长约1.5KD编码277个氨基酸(AA),其中氨基末端193个AA构成胞外段,22个AA构成跨膜段,66个AA构成胞浆段。CD40分子介导的信号在特异性免疫应答中居于重要的上游位置。该分子广泛表达在免疫系统以及非免疫系统的许多类型的细胞表面,包括B细胞,树突状细胞,上皮细胞以及一些肿瘤细胞如B细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤是起源于B淋巴细胞的恶性肿瘤,常全身广泛转移,表现为多器官侵犯。随着肿瘤的放、化疗技术的发展,大约50%-60%的B细胞淋巴瘤病人获得临床缓解。然而残余的恶性细胞导致的肿瘤复发常有发生。本室研制的激发型CD40单克隆抗体5cll对B细胞淋巴瘤的生物学行为有多重影响,包括:生长抑制;膜表面粘附分子表达变化;凋亡敏感性的提高等等。体外实验结果提示了5cll对B细胞淋巴瘤具有潜在治疗价值。 SCID小鼠即重症联合免疫缺陷(Severe Combined Immune deficiency)小鼠,1983年由美国学者Bosma首先发现于C.B-17近交系的小鼠,是由于位于16号染色体的单个隐性基因突变所致。SCID小鼠的所有T、B淋巴细胞功能测试均为阴性,对外源性抗原无细胞免疫及体液免疫应答,体内缺乏携带前B细胞、B细胞和T细胞表面标志的细胞。SCID小鼠由于T、B淋巴细胞的缺失,为人类淋巴系统在其体内的重建提供了可能,即SCID小鼠的人源化。这种人、鼠嵌合体为在小鼠体内有效地研究人类免疫系统的功能及其机制成为可能,同时也为肿瘤免疫学治疗的研究提供了一个独特的动物模型。 本课题的研究目的是建立人源化SCID小鼠人B细胞淋巴瘤模型,在此基础上探讨激发型抗人CD40单克隆抗体5cll联合CTL对B细胞淋巴瘤的免疫治疗作用。
李敏[4]2004年在《激发型4-1BB单抗联合肿瘤特异性树突状细胞的免疫治疗作用及其相关机制研究》文中研究指明树突状细胞(dendritic cells，DCs)是体内最重要的专职性抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)，能摄取、加工及递呈抗原，刺激初始型T细胞的增殖和活化，是启动、调控并维持特异性免疫应答的中心环节。制备肿瘤特异性DCs疫苗免疫肿瘤患者，可有效地激发机体特异性的、持久的肿瘤免疫应答。4-1BB分子为TNFR超家族成员，主要表达于活化T细胞表面，与其配体4-1BBL结合所介导的共刺激信号能促进T细胞的活化和增殖，增加细胞因子的分泌，同时还可维持T细胞的长期生存，从而在T细胞介导的抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。值得注意的是，DCs上可共表达4-1BB和4-1BBL，并且DCs表面4-1BB分子的活化有助于IL-12等细胞因子的分泌。其促T细胞增殖的能力也有所增强。通过激发型抗体增强4-1BB信号可望成为肿瘤免疫治疗的新策略。 本研究首先采用流式细胞检测技术、RT-PCR和real-time PCR等方法对小鼠髓系DCs在分化发育过程中4-1BB分子的表达进行分析。结果表明，骨髓前体细胞及未成熟DCs表面均有4-1BB分子的表达，经凋亡肿瘤细胞负载并经TNF-α刺激成熟后，4-1BB分子的表达进一步上调。其在蛋白水平的变化与在mRNA转录水平的变化趋势一致。在此基础上，应用激发型4-1BB单抗激发DCs表面4-1BB分子后，能促进DCs的分化成熟，并可增强DCs促T细胞增殖活化的能力。同时本研究还发现，TNF-α与激发型4-1BB单抗联合应用对DCs的分化成熟及功能介导可起到协同增强的作用。 在体外实验的基础上，联合应用激发型4-1BB单抗与肿瘤特异性DCs疫苗对B细胞淋巴瘤荷瘤小鼠开展免疫治疗，可有效抑制肿瘤生长，延长荷瘤鼠生存期，并获得了62.5％的肿瘤完全缓解率。进一步研究发现，联合治疗后荷瘤鼠T细胞体外增殖能力及分泌IL-2和IFN-γ的能力都明显增强，而抑制性细胞因子IL-10的分泌则大大降低。此外，联合治疗组荷瘤小鼠脾脏中CD4~+IFN-γ~+T细胞的比例也有明显激发型4-IBB单抗联合肿瘤特异性树突状细胞的免疫治疗作用及其相关机制研究中文摘要增加。同时，联合治疗组荷瘤小鼠髓系DCs体外促T细胞增殖及分泌IL一2和IFN叮的能力也明显提高。 综合上述实验结果:小鼠髓系DCs上可表达的4一1 BB分子具有功能性，该分子的活化有助于DCs的分化成熟及功能增强。并且初步证实，TNFR超家族分子促DCs成熟的作用具有协同性。同时，4一IBB分子在DCs上表达这一机制，在肿瘤免疫中具有至关重要的意义，能有效促进Thl型免疫应答的发展。
朱一蓓[5]2004年在《肿瘤特异性DCs体外诱导调节因素及其生物学功能研究》文中认为树突状细胞(dendritic cells，DCs)是机体内最重要的、功能最强的一群专职性抗原提呈细胞(APC)，能有效摄取、加工及提呈抗原，刺激初始型T细胞(naive T cell)的增殖和活化，是启动、调控并维持免疫应答的中心环节。近年来，DCs在肿瘤免疫、移植免疫和抗感染免疫等方面日益受到人们的重视。DCs的分化成熟经历了一系列复杂而精细的过程，进一步探讨调节DCs分化、成熟和功能的生物因子、影响因素及其机制，将有助于以DCs为佐剂的生物治疗的开展。 本研究首先分析了人外周血单核细胞来源的DCs(MDDC)分化成熟过程中，共刺激分子、趋化因子受体的表达及其相互作用，比较CD40和TNF-α两条信号途径对MDDC分化成熟及功能的影响，并探讨IL-2及其受体在DCs活化和功能介导中的作用；继而以CD40和TNF-α信号激发的DCs联合细胞因子体外激发、扩增肿瘤特异性CTL，探讨共刺激信号对肿瘤特异性CTL生物学功能的影响及其机制，评价肿瘤特异性CTL体外趋化和杀伤肿瘤细胞的能力：最后研究肿瘤患者外周血单核细胞来源的DCs的体外诱导及其功能，分析IL-10对DCs分化和功能介导的影响及其机制，以此为恶性肿瘤的免疫治疗提供实验和理论依据。 第一部分 共刺激分子和趋化因子受体在树突状细胞中的表达及其相关生物学效应 目的：比较分析在TNF-α和CD40两种信号途径下，相关共刺激分子和趋化因子受体在人外周血单核细胞来源的DCs分化成熟过程中的表达，探讨共刺激信号和IL-2在肿瘤抗原特异性DCs生物学行为中的作用及其机制。 方法：采用透射电镜观察DCs超微结构：免疫荧光标记检测DCs分化发育过程中共刺激分子和趋化因子受体的表达：RT-PCR和Realtime-PCR检测PD-L1、PD-L2、4-1BB肿瘤特异性DCs体外诱导调节因素及其生物学功能研究中文提要和4一IBBL n1RNA的转录;ELISA检测IL一2、IL一12、IL一10的分泌水平;肠朋swell实验评价DCs对T细胞的趋化能力;Westem一blotting检测IL一2受体丫链的表达。结果:在CD4OmAb(5Cll)和TNF一a刺激成熟的人MDDC中，CD40、CD80、CD86、HLA一DR、GL50、PD一LI和PD一LZ等随着DCs成熟均逐渐上调表达，4一IBB和4一IBBL在抗原负载的 DCs上呈现共表达;CD40mAb激发的DCs中CD25和CD83的表达明显高于TNF一a组且高表达PD一LZ、中度表达PD一Ll(p<0.05);CD40mAb激发的DCs分泌IL一2和IL一12的量明显高于TNF一a组(P<0.05):CD40mAb诱导的Dcs适度表达CXCR4和CCR7，对T细胞的趋化能力明显高于TNF一a组护<0.05);DCs表达功能性几一2助链，IL一2能促进DCs增殖和分泌IFN一Y。结论:共刺激分子和趋化因子受体在人MDDC的分化、成熟和功能介导中起着重要的调节作用，CD40信号对人MDDC分化成熟起到至关重要的作用，DCs表达功能性IL一ZRY链，IL一2及其受体在DCs活化和功能介导中有重要意义。DCs通过4一IBB/4一IBBL共表达的形式可建立激发DCs和功能介导的新途径。
吴明媛[6]2005年在《脐血衍生的树突状细胞体外诱导调节因素及其生物学功能研究》文中研究指明树突状细胞(Dendritic eells,DCs)是目前所知的机体内功能最强的专职性APC,能够有效地摄取、加工及提呈抗原,通过其表面B7、MHC-Ⅱ和ICAM-1等分子的表达,刺激CD4~+T细胞的活化增殖,促进IL-2的分泌,在双信号刺激下,最终活化CD8~+T细胞,产生免疫应答效应。脐血中富含的CD34~+造血祖细胞与骨髓和外周血相比,数量更多,具有更强的增殖潜能,是DCs的理想来源。体外,不同细胞因子联合可诱导CD34~+造血祖细胞分化为DCs,在肿瘤免疫、移植免疫和抗感染免疫等方面发挥效应。脐血CD34~+造血祖细胞来源的DCs分化发育和成熟经历了一系列复杂而精细的调节过程,探讨DCs分化发育、成熟过程的调节因素及其生物学功能,将有助于开展以DCs为佐剂的生物治疗。 本研究优化了体外扩增、诱导CD34~+造血祖细胞产生DCs的方案,首次系统分析脐血CD34~+造血祖细胞来源DCs分化成熟过程中共刺激分子的表达及其相互作用,比较CD40、TNF-α和4-1BBL叁条信号途径对DCs分化成熟和生物学功能的影响,探讨脐血贴壁细胞来源DCs相关抗原和共刺激分子的表达及其生物学功能,以期扩大DCs的来源,通过干预CD40/CD40L、4-1BB/4-1BBL、PD-1/PD-L1/PD-L2等几对重要的共刺激分子来调节脐血衍生的DCs生物学功能,为肿瘤免疫和移植免疫的临床应用提供实验和理论依据。 第一部分 脐血CD34~+造血祖细胞体外诱导树突状细胞的优化方案及其调节因素 目的:体外定向诱导CD34~+造血祖细胞产生髓系DCs,比较不同细胞因子组合对CD34~+造血祖细胞扩增效率及其生物学功能的影响,建立体外扩增诱导脐血CD34~+造血祖细胞产生DCs的优化方案。
张烽[7]2006年在《4-1BB分子在小鼠树突状细胞上的表达及作用研究》文中研究指明树突状细胞(DCs)是目前所知体内功能最强的抗原提呈细胞(APCs)，其特点是能够显着刺激初始T细胞增殖。作为机体免疫应答的始动者，DCs在免疫应答的诱导中具有独特的地位。未成熟DCs能摄取抗原并将其处理成免疫原性多肽，以MHC分子-抗原肽复合物的形式表达于细胞表面，供抗原特异性T细胞受体(TCR)识别。在这过程中未成熟DCs逐渐发育成熟。成熟DCs与T细胞之间通过共刺激分子受体与配体间的相互作用激活抗原特异性T细胞，启动免疫应答。 DCs在摄取抗原或接受到某些刺激因素(主要是炎性信号如LPS、IL-1、TNF-α)后，可以分化成熟，其MHC分子、共刺激分子、粘附分子的表达显着提高，激发T细胞的能力得到增强，但其抗原摄取加工能力大大降低。 4-1BB与其配体4-1BBL是一对重要的共刺激分子，对于活化T细胞，参与T细胞介导的免疫应答具有重要意义。4-1BB为TNFR超家族成员，表达于T细胞、NK细胞、NKT细胞和DCs等细胞表面，4-1BBL表达在B细胞、T细胞、巨噬细胞和DCs等细胞上。4-1BB和4-1BBL在DCs上的共表达及它们对于DCs功能的影响正日益受到人们的关注。 本研究第一部分采用小鼠髓系树突状细胞(BMDCs)开展研究。首先证实了BMDCs表面共表达功能性4-1BB及4-1BBL，进而研究了TNF-α、LPS、IFN-γ、CD40配体(CD40L)等成熟活化因子刺激48h后，BMDCs上4-1BB和4-1BBL的表达变化。结果表明，各成熟活化因子均能显着上调BMDCs上4-1BB和4-1BBL的表达，并能有效拮抗负性调控因子IL-10下调DCs上4-1BB和4-1BBL表达的作用。 第二部分研究了激发型4-1BB单克隆抗体2A对BMDCs及小鼠DC细胞系(DC2.4)成熟活化的影响。结果显示，2A刺激BMDCs 48h后，细胞表现出成熟DCs的表型和功能特征，即共刺激分子CD40、CD80、CD86上调表达；摄取Dextran能力
马倩茹[8]2006年在《4-1BB和CD40信号对TLR4表达调节的研究》文中研究表明Toll样受体(TLR)是固有性免疫应答中的重要成分，不但在感染性免疫中发挥重要作用，而且参与了肿瘤的免疫应答和免疫逃逸过程，TLR家族中受到广泛关注的是TLR4分子。树突状细胞(DC)作为机体免疫应答的始动者，在对多种疾病应答中，尤其是在对肿瘤的免疫应答中发挥了不可替代的作用。已有研究表明多种因素可以影响单核细胞及树突状细胞上TLR4的表达，但共刺激分子CD40和4-1BB对TLR4表达的影响尚未见报道。本研究旨在通过激活DC或单核细胞上CD40或4-1BB分子后，观察TLR4分子表达的变化，以期为肿瘤免疫治疗提供新的方法与思路。 1．4-1BB信号对小鼠树突状细胞TLR4表达的调节 目的：探讨激发型小鼠4-1BB(CD137)单克隆抗体2A对小鼠骨髓来源未成熟DC(imDC)及树突状细胞株DC2.4表面TLR4表达的调节。方法：在imDC中加入不同剂量2A(联合兔抗大鼠IgG-Fc段抗体，CL)、LPS、2A(+CL)与LPS联合后作用6h，流式细胞术(FCM)检测TLR4表达；或在以上处理因素作用后不同时相(0h、3h、6h、12h、24h)，以及先用LPS刺激imDC 6h再加入2A(+CL)作用6h后，以FCM检测imDC表面TLR4表达。结果：LPS可下调imDC上TLR4的表达，作用可维持24h。单独使用2A无明显效应，但与CL联合后2A可使imDC上调TLR4分子的表达，作用可维持12h。2A(+CL)与LPS联合作用仍可使imDC上调表达TLR4分子。先用LPS预处理imDC6h再加入2A作用6h，2A仍可拮抗LPS的下调作用。在树突状细胞株DC2.4细胞表面也得到相似的结果。结论：4-1BB信号可上调小鼠骨髓来源未成熟DC和树突状细胞株DC2.4表面TLR4的表达，上调效应具有时间和剂量依赖性，并可拮抗LPS介导的TLR4下调效应。 2．CD40信号对人单核细胞和树突状细胞TLR4表达的调节 目的：探讨人激发型CD40单克隆抗体5C11对人单核细胞和树突状细胞TLR4
沈丽琴[9]2003年在《人可溶性4-1BB配体在毕氏酵母中的高效表达及其生物学功能的研究》文中研究表明4-1BB配体(4-1BB ligand，4-1BBL)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，主要表达在抗原递呈细胞(APC)，包括CD40活化的B细胞，γ-IFN活化的巨噬细胞和树突状细胞，还可在B细胞性恶性肿瘤细胞株及单核细胞上表达。其相应受体4-1BB则诱导表达于活化的T淋巴细胞表面，4-1BB／4-1BBL的相互作用在促发和调节机体免疫应答，特别是在机体的抗肿瘤免疫、移植免疫和自身免疫应答中发挥关键性的作用。近年来，4-1BBL分子在肿瘤免疫治疗中的潜在应用价值正倍受关注。但迄今为止，国内尚无商品化的4-1BBL重组产品。鉴此，我们在国内率先采用基因工程技术克隆了编码人4-1BBL胞外段的cDNA，并在毕氏酵母GS115中进行表达，同时对获得的重组人可溶性4-1BBL蛋白潜在的生物学功能进行了系列探讨。 4-1BBL由255个氨基酸组成，是Ⅱ型跨膜糖蛋白，有膜结合型和可溶性两种形式。膜型分子可被蛋白酶裂解以可溶性形式(soluble 4-1BB ligand，s4-1BBL)存在，而185个氨基酸组成的胞外段则构成了s4-1BBL。 s4-1BBL作为一种新型共刺激分子在T细胞的活化、增殖、存活和对树突状细胞的体外诱导扩增及在肿瘤生物治疗方面的作用和价值则是本研究的重点；此外，成功构建了人4-1BB分子的转基因细胞，并通过此细胞对4-1BBL分子介导的反向信号传导亦做了初步的探讨，以期为4-1BBL和4-1BB分子在自身免疫和移植免疫中的作用提供理论依据。 一．重组人可溶性4-1BB配体(rhs4-1BBL)在毕氏酵母中的高效表达及鉴定 采用RT-PCR，PCR方法从CD40单抗活化的人扁桃体淋巴细胞中扩增出4-1BBL全长和胞外段基因，后者即为可溶性4-1BBL cDNA，并将之克隆入PUCTm载体；此cDNA序列经测序证实正确后再导入表达质粒pPICZαA的α信号肽序列中，构建成重组人可溶性4一IBB配体在毕氏醉母中的表彝及其生物学功能的研究中文摘要分泌型表达载体PPIc及认ees4一IBBL;Sacl限布雌内切酶酶切使之线性化，再电转化法将线性化的pPIcZaAees4一IBBL质粒导入毕氏酵母菌株GSll5，并以同源重组形式整合到酵母染色体的A0x位点，经ze。。i。抗性扮选阳性克隆。同时，挑取阳性克隆在含甲醇的培养基中诱导表达，并分别于培养的第24h，48h，矜h分别吸出酵母上清，离心后进行1挑DS一PAGE电泳和western Blotting分析鉴成s4一IBBL的表达情况，得到能在甲醇诱导下稳定分泌rhs4一IBBL的基因工程菌GSllswepPIczaA一s4一IBBL。应用全自动发酵装置进行发酵，经阴离子交换层析方法分离、纯化，获得纯度达9巩以上，分子蛋约21Kda的rhs4一IBBL重组蛋白，紫外分光光度仪定量其最高表达量达25 pg/ml。二.重组人可溶性4一IBB配体(rhs4一IBBL)的生物学功能探讨1 .rhs4一IBBL刺激T细胞特性的研究 T细胞的活化需要双重信号，即除A『川C复合物提供的特异性抗原刺激信号外，还需要非抗原特异的和非阳C限制的共刺激信号，T细胞只有获得这二个信号后，才能发生有效的活化、增殖，进而发挥其效应功能，如分泌细胞因子或细胞毒性T细胞(口L)的溶细胞效应。若无第一信号，可导致T细胞失活和死亡。同样若缺乏共刺激信号，T细胞将进入无反应状态，甚至发生凋亡。活化T淋巴细胞在宿主防御病毒感染、抗肿瘤和移植排斥中发挥重要作用，并参与自身免疫病的发展过程。因此，4一IBB/4一IBBL协同刺激信号对T细胞的激发和功能介导起着极其重要的调节作用。本研究结果显示: (1)纯化T细胞经cD3激发型单护喇激后12h，细胞呈现活化状态，显微镜下观察细胞增大增多，逐渐成团生长，T细胞表面4-- IBB分子开始表达，约48h达活化高峰，4一IBB分子表达阳性率达6既，并能维持4币d。(2)rha4一IBBL对T细胞存活和增殖的影响:cD3单抗激发的T细胞在一周内逐渐凋亡，加入 rhs4一1 BBL重组蛋白、cD28单抗(CD28InAb)或外源性IL--2后T细胞存活均明显延长(P<0 .05)，虽然二种共刺激分子对T细胞作用相仿(P>0 .05)，但和I卜2均具有协同效应，而且其联合后和I卜2共同作用更明显(P<0 .05)，最长可使T细胞存活6--7周。另外，3[Hl一dR结果也显示，rhs4一1 BBL和CD28InAb可以协同刺激活人可溶性今IBB配体在毕氏醉母中的表达及其生物学功能的研究中文摘要化T细胞体外增殖。以上结果均证实4一IBBL信号独立于CD28信号之外，并与CD28分子一样为T细胞的活化、增殖和进一步延长其存活提供了强有力的第二信号。(3)rhs4一IBBL和CD28InAb可以使活化T细胞产生白细胞介素2(I卜2)。1 L--2为淋巴细胞生长因子，在体外可以促进T细胞存活。rhs4一IBBL加CD28InAb联合促进T细胞分泌IL--2效应明显强于两者单独使用(P<0 .05)。另外，研究还发现，T细胞培养第2天分泌的I卜2高于第5天(P<0 .05)，此现象说明IL一2的分泌具有时效性，随时间的延长其含t下降是因为T细胞在生长过程中消耗了I卜2。这也进一步说明T细胞自分泌I卜2是影响T细胞扩增的主要因子。(4)rhs4一IBBL和CD28mAb对T细胞凋亡和细胞周期的影响:凋亡率检测结果显示，CD3单抗活化72一96h的T细胞平均凋亡率为37.5士3.5%，大部分细胞已开始进入凋亡期
时宏珍[10]2001年在《人可溶性CD40配体在毕氏酵母中的高效表达及其生物学功能的研究》文中进行了进一步梳理CD40配体（CD40 ligand，CD40L）是TNF超家族成员，表达于人活化的CD4~+T细胞表面，与存在于B细胞、抗原递呈细胞（APC）表面的相应受体CD40分子相互作用，参与促发并调节机体的特异性体液免疫和细胞免疫应答；其在免疫应答中的作用已在X-性连锁高IgM血症及CD40L基因敲除小鼠中得到充分体现；近年来，CD40L在肿瘤免疫治疗中的潜在应用价值正倍受关注。但迄今为止，国内、外尚无商品化的CD40L重组产品。鉴此，我们在国内率先采用基因工程技术克隆了编码人CD40L胞外段cDNA并在毕氏酵母GS115中进行表达，同时对重组的人可溶性CD40L潜在的生物学功能进行了系列探讨。 CD40L是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，由261个AA组成；46至261位AA构成CD40L分子的胞外段，具有与其相应受体CD40分子相互作用的结构域（receptor binding domain, RBD）；胞外段可被蛋白酶裂解以可溶性形式（soluble CD40 ligand, sCD40L）存在。sCD40L是否具有膜型CD40L（mCD40L）的生物学功能引起我们的极大兴趣；与此同时，sCD40L作为一种新型免疫调节因子在体外树突状细胞的诱导扩增及在肿瘤生物治疗方面的作用和价值亦是本研究的宗旨之一。 — — 一．＠WW－… 采用RTPCR法从活化的人T淋巴细胞中扩增CD40L胞外段编码 CDNA，即可溶性CD40L编码CDNA，并克隆入pSK质粒；CDNA序列经 测序证实正确后再导入 pPICZaA质粒的a信号肽序列中，重组构建成分泌 型表达载体叩＊＊0入s＊D4 M；8腑限狲性内切酶反应使之线性化，电转 化法将线性化的 pPICZaA七CD40L载体导入 GSlls毕氏酵母菌株，以同源 重组形式整合到酵母染色体的AOX位点，经Zeocin抗性筛选，得到能在 甲醇诱导下稳定分泌rhsCD40L的基因工程菌。应用全自动发酵装置进行发 酵，rhS删0L浸滴演运互酋加峪水发巨b袄经FPLC分离、纯化，获 得纯度达95％以上，分子量约30Kda的重组蛋白。矗顷【狸固日曲功哮进 snMtW＆＆ NM200 hi H．功SML助恻ie砒、成她功能的彤响 DC是己知体内功能最强的专职性抗原递呈细胞（APC人 能摄取、加工 并递呈抗原，刺激未致敏w ye）T细胞的增殖和活化从而启动机体的特异性 免疫应答。CD40信号不仅有助于DC的分化与成熟，反之DC的CD40信 号又能促进CD4ty细胞甚至直接促进CD87细胞的活化与效应功能的产 生。因此DC作为一种具有独特功能的免疫佐剂在肿瘤免疫治疗及感染性 疾病治疗中的作用倍受瞩目。但DC在体内含量甚微，众多学者正致力于 探索体外DC诱导和扩增的最佳途径及细胞因子的优化组合。‘本研究结果显示：在无 M。存在时，GMCSF＋K－4＋thSCD40L可有 效地诱导人外周单核细胞向DC的分化和成熟。诱导的DC具有典型的细胞 学形态特征和特殊的成熟表面标志（CD，CD80，CD83，HLADR等） 及摄取FITC血一、刺激同种混合淋巴细胞体外增殖反应（MLR）和分 4 rhsCD40L在毕氏酵母中的表达及其生物学功能的研究 中文摘要 泌nl 的能力；经rhsCD40L刺激的DC其细胞表面分子KDla、CD80、 CD83、HLAAIR）的表达水平高于经典的细胞因子组合组（GM（SF＋In－ 4＋M a人 更为有意义的是：hsCD40L激发的 DC表面趋化因子受体 CXCR的表bg呶平及对自体外周 T淋巴细胞的趋化（Lallswell test）能力 均高于或强于 INTF Q或 FL激发的 DCS。 尽管DC及DC疫苗的发展和应用前景令悯舞，然而令人棘手的是在 体内及肿瘤微环境中存在一些抑制性因子对DC成熟和功能产生的负性作 用，严重制约着DC的肿瘤兔疫治疗效果。fiq 可能是最主要的肿瘤性抑 制因子，它具有明显的抑制DC成熟和促进其异向分化的效应。本凋铂深汐 1霎CD4MBDC占聋廷厚旁田烙弦MO斑陆粥朗团囚欧错”尸人而日％卧 寄庙亵茄wC及茵泅囚迫垮蛀愧磁访bC… 研究 结果发现：在 GMCSF瓜4诱导第 4天的 P删中加入 nl Q0n咖） 培养至第8天，细胞多贴壁生长并呈巨噬细胞样形态，nd 显着地抑制了 DC的分化、成熟、抗原的摄取、MLR及IL－12的产生。若在GM（SF＋IL． 4诱导第4天的PBMC（未成熟DC）中同时加入rhsCD40一）和IL－ 10p加咖），或在经GMl SF瓜4什地CE吐OL诱导成熟的DC中再加入L－ 10，DC的分化、成熟及功能正常。实验结果表明：reCD40L的应用将为 体外大量而有效地扩增DC开辟一条新途径；而且经rhsCD40L激发的DC 具有桔抗 n1 对 DC负性作用的功能，从而能提高 DC肿瘤免疫治疗的效 果。鉴此，我们设想在临床输注DC时，可同时给予rhsCD40L，不仅可
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[10]. 人可溶性CD40配体在毕氏酵母中的高效表达及其生物学功能的研究[D]. 时宏珍. 苏州大学. 2001
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