【摘要】目的：探讨尪痹片含药血清对TNF-α刺激下的大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的相关成骨标志物的影响。方法：制备以下含药血清：空白组大鼠、尪痹片高剂量组大鼠、尪痹片中剂量组大鼠、尪痹片低计量组大鼠、仙灵骨葆胶囊组大鼠，甲氨蝶呤组大鼠。使用以上含药血清和一定浓度的肿瘤坏死因子阿尔法(TNF-α)干预大鼠骨髓间充质干细胞，使用MTT法检测细胞增殖情况，用茜素红染色法检测成骨钙化结节情况，检测成骨标志物碱性磷酸酶活力情况。结果：MTT比色法观察到，与正常组比较，其他各组均出现了增值率降低，茜素红染色法观察到，尪痹片中剂量组大鼠的成骨细胞基质矿化部分较多。尪痹片低剂量组的碱性磷酸酶分泌值高于其他组。结论：尪痹片具有促进骨生成的作用，导致这种促进作用的一条可能的机制是能够保护和促进TNF-α刺激下的BMSCs的成骨分化能力。
【关键词】尪痹片；骨髓间充质干细胞；成骨细胞；MTT比色法；茜素红染色法
【中图分类号】R286 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2019）29-0205-03
尪痹片由著名国医大师焦树德教授创立，是国家六类新药痹病系列药之一，为中华中医药学会风湿病分会协定处方，临床用于治疗类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）疗效显著，病理研究和临床研究均表明该药可减轻骨破坏程度,促进骨形成[1,2]，骨形成的重要细胞为成骨细胞，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)可分化为成骨细胞[3]，因此本研究使用尪痹片含药血清体外干预骨髓间充质干细胞，探讨其对成骨分化的保护作用。
1.资料与方法
1.1 药物与试剂
尪痹片，仙灵骨葆胶囊，甲氨蝶呤片，SD大鼠骨髓间充质干细胞株（中国科学院），成骨分化培养基，茜素红，肿瘤坏死因子α，TNF-α，一步法快速WB（HRP）试剂盒，高灵敏度化学发光检测试剂盒，蛋白膜印迹再生液，TRNzol总RNA提取试剂，PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR? Premix Ex Taq? Ⅱ,ROX plus，DL2,000 DNA Marker，康为世纪SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（CW0022），碱性磷酸酶（AKP）测试盒。
1.2 实验仪器
No：164-5050电泳仪，Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System蛋白电泳槽，Mini Trans-Blot，蛋白转印系统，TY-80脱色摇床。ZS-2板式酶标仪，202-2AB电热恒温箱，ABI7500荧光定量PCR仪，SK-D1807-E Analog 3D Shaker，RS-25S超声波细胞粉碎机，LIDE 200扫描仪，ST60-4微孔板恒温振荡器，AUW-220D电子分析d平。
1.3 含药血清的制备
清洁级SD大鼠雄性60只（中国人民解放军第三军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK2012-0011），随机分成6组，每组10只，分别为空白组、尪痹片高剂量组、尪痹片中剂量组、尪痹片低剂量组、仙灵骨葆胶囊组，甲氨蝶呤组，每组10只。尪痹片高剂量组(9630 mg/kg)，尪痹片中剂量组(4815 mg/kg)，尪痹片低剂量组(1070 mg/kg)，仙灵骨葆胶囊组(1320 mg/kg)，甲氨蝶呤组(11mg/kg)，空白组给予生理盐水2 mL,高剂量是人常规剂量的18倍，中剂量是人常规剂量的9倍，低剂量组、仙灵骨葆组和甲氨蝶呤组均为人常规剂量的5倍，连续给药10日，每日一次。取血前禁食12小时，使用摘眼球取血法，取血后静置30 min，放入离心机中低速离心3分钟，分离血清与血细胞，弃血细胞，将血清置于-80℃冰箱保存。
1.4 细胞培养
待所用培养的细胞中有90%左右已经生长，按4×103/cm2铺1个96孔板，待细胞融合约50%时进行实验；配置7种不同含药血清成骨细胞诱导分化培养基，正常对照组，空白血清组，尪痹片高剂量组，尪痹片中剂量组，尪痹片低剂量组，仙灵骨葆胶囊组，甲氨蝶呤组，除了正常对照组，其他培养基中均加入浓度为3.125ng/ml的TNF-α溶液，每个药物3个复孔，96孔板细胞弃上清，用1×PBS洗2～3次，加入100 μL/孔对应的含药血清成骨细胞诱导分化培养基，放入37℃ 5% CO2恒温培养箱培养；每隔2 d换一次液，第7 d取出细胞，进行各项检测。
1.5 MTT法检测细胞增殖率
取出96孔板，弃液，加入30 μL/孔MTT，37℃ 作用24 h，弃MTT，加入150 μL/孔 DMSO，37℃恒温震荡仪孵育15min测OD540，分析结果。增殖率%＝（1-（正常对照组OD值－实验组OD值）/（正常对照组OD值-调零OD值））×100
1.6 茜素红染色法检测成骨矿化情况
①成骨诱导分化结束后，弃细胞培养基，室温固定30 min；②弃4%多聚甲醛，用用1×PBS洗2次，每孔加入500μL茜素化结束后，弃细胞培养基，用1×PBS洗2次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，红染液染色3min；③弃茜素红染液，用1×PBS洗3～5次，将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。
1.7 碱性磷酸酶测试盒测试碱性磷酸酶活性
原理：碱性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。检测步骤：按照碱性磷酸酶测试盒说明书的操作方法进行。
2.统计学方法
用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料以（x-±s）表示，组间比较采用方差分析，方差齐性时采用LSD法检验，方差不齐时用Tamhance’s T2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
3.结果
3.1 细胞增殖情况
如图1和表1所示，与正常组相比较，其他各组的增殖率均低于正常组(P＜0.01)，空白血清组与尪痹片低剂量组的增殖率的差异没有统计学意义(P＞0.05),尪痹片低剂量组较高、中剂量组高(P＜0.01)，仙灵骨葆组与甲氨蝶呤组的差异没有统计学意义(P＞0.05)。
3.讨论
细胞碱性磷酸酶活力和矿化结节的形成是成骨细胞早期和中晚期分化的标志,对BMSCs而言则是表明BMSCs骨向分化的特征[4]。本研究的模型为在成骨分化培养基中加入3.125ng/ml的肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor alpha，TNF-α），是RA病程中最早产生的炎症细胞因子之一，在发病机制中起主导作用,是炎症瀑布的上游分子,通过作用于多种细胞在RA的滑膜炎症、血管新生及骨质破坏中起重要作用[5]。RA患者的血清中TNF-α水平显著上调，且与类风湿性关节炎的活动性呈显著正相关[6]，在RA患者的关节液亦出现TNF-α的高表达[7]。本研究的结果提示，BMSCs细胞在炎症因子和药物的刺激之下，均出现了细胞增殖减少,尪痹片高，中剂量组对细胞增殖的阻碍作用比较大，尪痹片低剂量组对细胞增殖的阻碍作用比其他组低，甲氨蝶呤组和仙灵骨葆组均对细胞增殖有阻碍作用，但是其阻碍作用比尪痹片低剂量组要大。说明尪痹片的低剂量对细胞的毒性相对较小。在成骨分化标志物方面，尪痹片中剂量组表现出碱性磷酸酶活力增加，茜素红染色的钙化结节明显增多。表明尪痹片中剂量组对TNF-α刺激下的成骨分化保护作用较尪痹片其他剂量，仙灵骨葆胶囊和甲氨蝶呤效果好。RA主要为炎症性关节病，但是又以伴发骨代谢异常骨质疏松症为特点，表现为关节周围骨丢失及骨侵蚀、全身性骨质疏松症,患者的骨折风险明显增加[8]。骨质疏松的原因之一在于骨生成不足[9]，有报道称尪痹片可以增加RA患者的骨密度以及骨钙素、血清Ⅰ型胶原交联 C 末端肽等血清成骨标志物。甲氨蝶呤并不能阻止骨质疏松的发生[10]。本研究的结果进一步证实了尪痹片具有促进骨生成的作用，同时揭示导致这种促进作用的一条可能的机制是促进BMSCs向成骨分化，能够保护TNF-α刺激下的BMSCs仍然具有成骨分化能力。
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贵州省科学技术厅课题（编号：黔科合J字[2015]2024）
论文作者:刘益臻,李立章,王炎,付坤飞
论文发表刊物:《医药前沿》2019年29期
论文发表时间:2019/11/20
标签：细胞论文; 剂量论文; 血清论文; 磷酸酶论文; 茜素论文; 大鼠论文; 碱性论文; 《医药前沿》2019年29期论文;