上海市普陀区中心医院检验科 上海市200062
摘要：
目的 了解自动化操作对于提高血清(1-3)-β-D葡聚糖检测的准确度的意义。
方法 收集205例我院2019年1月21日至2019年1月28日一周时间的疑似真菌感染患者的血清标本，分别采用手工操作和自动化操作检测血清(1-3)-β-D葡聚糖水平，以临床诊断结果作为评价标准，对结果进行统计分析。
结果 手工操作、自动化操作与临床诊断结果的符合率分别为97.56%和95.12%。手工操作结果与自动化操作结果比较，差异有统计学意义（P<0.05）。重复性结果显示，自动化操作优于手工操作。
结论 自动化操作在封闭反应舱内进行，排除了环境及操作污染，消除了人员对实验结果，省时省力，重复性更佳，有效提高了血清(1-3)-β-D葡聚糖检测的准确度，优于手工操作。
关键词：自动化；(1-3)-β-D葡聚糖；重复性；准确度；真菌
Abstract
Objective：To investigate the significance of automated procedures for improving the accuracy of serum (1-3)-β-D glucan detection.
Methods: The serum of patients with suspected fungal infection in X cases of XX hospitals was collected. The serum (1-3)-β-D glucan levels were detected by manual operation and automated operation. The clinical diagnosis results were used as evaluation criteria. Statistical analysis of the results.
Results: The coincidence rates of manual operation, automated operation and clinical diagnosis were X and X, respectively. The results of manual operation were compared with the results of automated operation, and the difference was statistically significant (P<0.05). Repeatability results show that automated operations are superior to manual operations.
Conclusion：The automated operation is carried out in a closed reaction chamber, which eliminates environmental and operational pollution, eliminates personnel's experimental results, saves time and effort, and has better repeatability, effectively improving serum (1-3)-β-D glucan detection. The accuracy is better than manual operation.
Key words: automation; (1-3)-β-D glucan; repeatability; accuracy; fungus
侵袭性真菌病（Invasive Fungal Disease, IFD）具有发病率高、病情进展快、诊断困难、死亡率高等特点，严重威胁着人类健康[1-4]。对IFD治疗的成败关键在于早期诊断。研究发现，检测人体无菌体液如血清中的(1-3)-β-D葡聚糖水平可作为诊断IFD的有效证据[5]。
目前医院使用的操作方法大多采用手工操作进行实验测定，但手工操作耗时耗力，且容易受到操作人员水平/状态的影响，从而影响检测的准确度。此外，目前医院使用的诊断试剂盒大多采用加热稀释法对样本进行前处理，研究表明该法有时很难使样本中(1-3)-β-D葡聚糖形态（单链形式、双股螺旋或三股螺旋形式）均一化，从而影响检测的特异性。对此，本研究将系统地比较碱处理全自动化操作和稀释加热法手工操作对(1-3)-β-D葡聚糖检测准确度的影响。
1材料和方法
1.1研究对象
收集我院2019年1月21日至2019年1月28日疑似深部真菌感染患者的血清205例。患者男106例，女99例。患者接受广谱抗菌药物治疗无效、部分患者曾使用免疫抑制剂或糖皮质激素治疗，或接受过静脉插管、实体器官移植术或其它插入性操作。
1.2 仪器与试剂
真菌/细菌动态检测仪MB-80X购于北京金山川科技发展有限公司；真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测试剂盒（光度法）-GKT294 购于北京金山川科技发展有限公司；真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测试剂盒（显色法）-GC190424 购于天津喜诺生物医药有限公司；全自动真菌/细菌动态检测仪（IGL-800）购于天津喜诺生物医药有限公司。
1.3方法
1.3.1 全自动操作
用一次性无菌热原真空采管取静脉血4ml，3000rpm离心10-15min，将采血管打开盖子插入试剂载架，扫描样本信息，填写质控和批号信息，打开试剂盖子放置在试剂区相应位置同时摆放好实验耗材，点击“采集”，依据弹出对话框点击“确定”，仪器进入自动运行过程。反应结束后检测系统自动计算待测样本中(1-3)-β-D葡聚糖含量。
1.3.2手工操作
用一次性无菌无热原真空采血管取静脉血4ml，3000rpm离心10-15min，分得血清。取上述血清0.1ml，加入装有0.9ml 的样品处理液中，混匀后70℃孵育10分钟，取出后立刻放入冷却槽中冷却5min，取处理后冷却的血清0.2ml直接加入反应主剂中，溶解后全量转移至无热原平底试管中（不要产生气泡），插入真菌/细菌动态检测仪MB-80X中进行反应（插入前应填写好信息并点击“采集”），反应结束后检测系统自动计算出待测样本中(1-3)-β-D葡聚糖含量。
1.3.3临床诊断
根据患者自身及治疗状态，依据各类诊断及临床指征，综合判定病人IFD患病状态。
1.4 统计学方法
依据临床诊断结果，分别计算2轮碱处理法全自动操作与2轮加热稀释法手工操作的敏感度和特异度，计算两种操作模式下的试验重复性。
2. 结果
2.1 碱处理全自动操作与临床诊断结果的比较
在205例样本中，碱处理全自动操作检出葡聚糖阳性38例，灰区5例，阴性162例，阳性率为20.97%。在碱处理全自动操作的43例阳性中，有38例为真阳性，阳性符合率为88.37%，在临床诊断为真阴性的167例样本中，碱处理全自动操作162例阴性，阴性符合率为97%。
2.2 加热稀释手工操作与临床诊断结果的比较
在205例样本中，加热稀释手工操作检出葡聚糖阳性37例，灰区6例，阴性161例，阳性率为18.05 %。在加热稀释手工操作的43例阳性中，有36例为真阳性，阳性符合率为83.72%，在临床诊断为真阴性的167例样本中，碱处理全自动操作161例阴性，阴性符合率为96.41%。
2.3 碱处理全自动操作与加热稀释手工操作检测结果的比较
2.3.1 试验重复性
在205例样本中，加热稀释手工操作两轮实验有4个结果不一致，其中2个为溶血样本，1个为黄疸样本，1个为多发性骨髓瘤病人，整体重复性为98.05%；而碱处理全自动操作两轮实验结果全部一致，整体重复性为100%。
2.3.2 临床一致性
由2.1，2.2，2.3的结果可以看到，碱处理全自动操作的临床一致性和准确度明显高于加热稀释手工操作，重复性也优于加热稀释手工操作。
3. 讨论
近年来，随着免疫抑制剂、糖皮质激素和广谱抗菌药物的广泛应用，以及侵入性操作诊疗技术的发展和器官移植的普及，很多危重患者的生存时间得以延长，但也导致IFD的并发，致使IFD的发生率和死亡率逐渐升高[6]。因此，IFD的早期快速诊断尤为重要。
(1-3)-β-D葡聚糖是由D-葡聚糖合成的细胞壁多糖，占真菌细胞壁成分50%以上，研究表明，除接合菌外，所有真菌的细胞壁上都含有(1-3)-β-D葡聚糖，其它微生物、动物以及人的细胞成分和细胞外液都不含这种成分[7-8]。当真菌进入人体血液或深部感染组织，经吞噬细胞的吞噬和消化处理，(1-3)-β-D葡聚糖可从胞壁释放，使血液和其它体液（尿、CSF、腹水、胸水等）含量增高；体内真菌含量减少时，机体可迅速清除(1-3)-β-D葡聚糖。浅部真菌感染或真菌定植时，(1-3)-β-D葡聚糖未被释放，故其在体液中的含量不增高[9-10]。（1-3）-β-D-葡聚糖有2种存在形式：一种是以单链形式存在的低级结构，另一种是以双股螺旋或三股螺旋形式存在的高级结构 (1-3)-β-D-葡聚糖呈中性，并含有少量的β-1, 6-连接结构，在 分子内多羟基作用下，形成致密的三螺旋结构，具有高免疫活性低溶解度的特点[11]。国内外研究表明，检测血清(1-3)-β-D葡聚糖水平对IFD具有重要的诊断价值[12]。
目前医院采用的检测方式多为加热稀释法试剂盒手工操作，一方面加热稀释处理法很难将样本中的1, 3-β-D-葡聚糖高级结构完全转变为低级结构，因此反应体系中（1-3）-β-D-葡聚糖的存在形态多样，即单链线状低级结构和双股螺旋、三股螺旋高级结构，而三股螺旋的免疫活性强于其单链结构，致使检测结果不可靠。此外，加热稀释法无法消除乳糜、黄疸、溶血等因素的干扰。碱处理法使用KOH和KCI混合溶液处理样本，使得样本中(1-3)-β-D葡聚糖全部转化为单股螺旋结构，消除样本中被测物差异的影响[13]。另一方面，随着人口老龄化、后抗生素时代的来临、感染控制的需要、循证医学的发展，实现微生物诊断的自动化势在必行，同时也是解决手工操作费时费力且易受操作人员影响的根本途径。
本研究检测了205例样本，样本分别经碱处理自动化操作和加热稀释手工操作，碱处理自动化操作的阳性符合率、阴性符合率、重复性分别为88.37%、97%、100%，加热稀释手工操作的阳性符合率、阴性符合率、重复性分别为83.72%、96.41%、98.05%，碱处理自动化操作与临床的符合度更高。碱处理法抗干扰能力更强，可在一定程度上消除内毒素、乳糜、黄疸等因素的影响，提高检测的特异性，还可失活丝氨酸蛋白酶和一些抑制因子，提高检测准确度。实验结果显示，自动化操作在省时省力的基础上具备较好的重复性。
综上所述，碱处理自动化操作可以使检测体系中的(1-3)-β-D葡聚糖以单一的低级结构存在，消除高级结构的影响，并在一定程度上消除黄疸、乳糜、内毒素等因素的影响，提高检测的特异性[14]。结合自动化操作，在排除环境和人为因素的情况下，省时省力，重复性好，检测准确度高。因此，碱处理自动化操作大大优于加热稀释手工操作，对深部真菌感染的诊断具有重要的应用价值。
参考文献
1. Tortorano A M, Dho G, Prigitano A, et al. Invasive fungal infections in the intensive care unit: a multicentre, prospective, observational study in Italy (2006–2008)[J]. Mycoses, 2012, 55(1): 73-79.
2. Meersseman W, Vandecasteele S J, Wilmer A, et al. Invasive aspergillosis in critically ill patients without malignancy[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2004, 170(6): 621-625.
3. Morrell M, Fraser V J, Kollef M H. Delaying the empiric treatment of Candida bloodstream infection until positive blood culture results are obtained: a potential risk factor for hospital mortality[J]. Antimicrobial agents and chemotherapy, 2005, 49(9): 3640-3645.
4. Lass‐Flörl C. The changing face of epidemiology of invasive fungal disease in Europe[J]. Mycoses, 2009, 52(3): 197-205.
5. KARAGEORGOPOULOS D E, VOULOUMANOU E K, NTZIORA F, et al. Beta-D-glucan assay for the diagnosis of invasive fungal infections: a meta- analysis[J]. Clin Infect Dis, 2011, 52（6）:750-770.
6. Hsu L Y , Ng S T , Koh L P . Common and Emerging Fungal Pulmonary Infections[J]. Infectious Disease Clinics of North America, 2010, 24(3):557-577.
7. Theel E S, Doern C D. β-D-glucan testing is important for diagnosis of invasive fungal infections.[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2013, 51(11):3478-3483.
8. Chamilos G, Luna M, Lewis R E, et al. Invasive fungal infections in patients with hematologic malignancies in a tertiary care cancer center: an autopsy study over a 15-year period (1989-2003).[J]. Haematologica, 2006, 91(7):986.
9. Pickering J W , Sant H W , Bowles C A , et al. Evaluation of a (1->3)-beta-D-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections.[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2005, 43(12):5957-62.
10. 吕沛华, 赵蓓蕾, 施毅,等. 侵袭性肺部真菌感染动物模型制作及血浆β-葡聚糖检测的诊断价值[J]. 中华医院感染学杂志, 2007, 17(11):1328-1331.
11. 王忠, 呙于明, 袁建敏. β-1，3-D-葡聚糖的免疫调节作用及其机制研究进展[C]// 家禽营养与饲料科技进展——第二届全国家禽营养与饲料科技研讨会论文集. 2007.
12. Kedzierska A . (1→3)-β-D-glucan—a new marker for the early serodiagnosis of deep-seated fungal infections in humans[J]. Polish journal of microbiology / Polskie Towarzystwo Mikrobiologów = The Polish Society of Microbiologists, 2007, 56(1):3-9.
13. Saitô H, Yoshioka Y, Uehara N, et al. Relationship between conformation and biological response for (1-3)-β-D-glucans in the activation of coagulation factor G from limulus amebocyte lysate and host-mediated antitumor activity. Demonstration of single-helix conformation as a stimulant[J]. Carbohydrate Research, 1991, 217(1):181-190.
14. LIU Juanjuan, XUE Zhixin,等. 降低血清中脂多糖测定干扰因素的分析[J]. 检验医学, 32(2).
论文作者:欧海鸿
论文发表刊物:《医师在线（学术版）》2019年第17期
论文发表时间:2019/10/28
标签：聚糖论文; 操作论文; 真菌论文; 手工论文; 样本论文; 血清论文; 阳性论文; 《医师在线（学术版）》2019年第17期论文;