1.河南广电计量检测有限公司 河南郑州 450000;2.河南广电计量检测有限公司 河南郑州 450000
摘要:提高农村户用沼气的产气量和农牧业废弃物的利用率,同时解决冬季户用沼气的产气量低的问题。试验以低温分离驯化的产甲烷菌为接种菌种,用猪粪、牛粪、羊粪及秸秆作为发酵原料,研究在低温8℃条件下,各种物料配比及pH、底物浓度、盐度对产甲烷菌的产气量的影响。结果表明,在8℃条件下,猪粪:牛粪:羊粪:秸秆=2:1:2:1的配比组的产气量高于其他试验组,用正交试验法测得的最佳发酵条件是pH为7.2,底物浓度为8%,盐度为4%。
关键词:产甲烷菌;低温;分离;驯化;沼气
农村沼气已成为我国发展生态农业的一个重要环节,有着广阔的发展前景,对改善民生条件有重要的战略意义。但是,在沼气池的实际运行中也存在一些普遍性的问题,突出表现在:寒冷低温季节沼气产量明显减少,同样数量的沼气原料产气量常常不及夏季的1/3;沼气发酵原料在池内得不到充分的分解和利用,实际沼气转换率(原料产气率)较低,发酵原料的产沼气潜力得不到充分发挥而被浪费[1]。
基于沼气的发酵,国内外在这方面做了大量研究。刘德江研究表明,与羊粪、猪粪相比,牛粪能提高发酵气体中的CH4含量[2]。张瑞红在用稻草发酵产沼气中,采用研磨和切碎两种物理预处理方法处理稻草[3]。发现研磨比切碎的预处理方法可提高产气量12. 5%。罗清明等用NaOH化学处理玉米秸秆,秸秆细胞壁结构和化学成分发生了明显变化,提高沼气产量[4]。一般农作物秸秆的碳氮比为70︰1,畜禽粪便为15︰1,微生物产生沼气的最佳碳氮比为25︰1。吕淑霞等研究表明,发酵物中添加固体纤维素酶,甲烷产率可提高52.1%,添加液体纤维素酶,提高幅度可高达88.8%[5]。然而综合研究粪秆配比、温度及外源物质对沼气产量的研究较少。本试验研究在低温下,猪粪、牛粪、羊粪和秸秆的不同配比对沼气产量的影响,并探索pH、TS(总固体)浓度、盐度、尿素对沼气产量的作用,旨在为提高沼气产量提供理论依据。
1.1 试验材料
1.1.1 试验样品采集
沼液样品:从贵德沼气发酵池中采样而得。
发酵原料:猪粪、牛粪、羊粪、秸秆,从大通县采集而来。
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1.1.2实验试剂
刃天青、Na2S、NaHCO3、MgCl2、KH2PO4、K2HPO4、NH4Cl、半胱氨酸、酵母膏、乙酸钠、甲酸钠、甲醇溶液、胰蛋白胨、NaCl、尿素
1.1.3试验仪器
BX51荧光显微镜(泽仕光电科技上海有限公司)
YQX-III厌氧培养箱(上海跃进医疗器戒厂)
Trace GC Ultra气相色谱仪(北京绿绵科技有限公司)
SHP—1500型低温生化培养箱(上海金鹏分析仪器有限公司)
1.3 试验方法
1.3.1产甲烷菌的分离筛选
样品采集后带回实验室立即接种至产甲烷细菌液体培养基中,将长3cm的小玻管装满接种液(0.6mL)倒放入培养基中收集气体,25℃静置培养1~2周后,再将培养物以4%接种浓度接种至新鲜培养基。如此重复,直到CH4含量越来越稳定为止。再在每5mL培养液中加入1.6万个单位无氧青霉素液进行抗生素筛选,将一些对抗生素敏感的杂菌除掉。此过程重复5次富集产甲烷细菌。将培养液压片在荧光显微镜下观察是否有发荧光的菌体,并分析倒置小玻管中气体的甲烷含量。
1.3.2产甲烷菌的低温分离驯化
将液体培养基在YQX—III厌氧箱内以每4.5mL分装于15×150规格的试管中,共分装12支试管,使用前将其进行还原,用1mL医用注射器吸取0.5mL分离后菌液接种至液体培养基,最后试管中的培养基体积为5mL。将试管分为两组:一组在25℃恒温培养箱中培养作试验对比组;一组至于8℃恒温培养箱中培养。一周后压片观察荧光现象,在荧光显微镜下,用100倍镜选一较好视野,对发光菌体进行观察。如8℃条件下有荧光现象,说明有耐低温的产甲烷菌存在。再提取菌液,用固体培养基做滚管操作,置于8℃中培养,用荧光显微镜观察,选取显荧光菌种做富集培养,如此重复,直到得到较纯化的耐低温产甲烷菌。
1.3.3不同物料配比试验
试验前将猪粪、牛粪、羊粪做风干处理,待其水分风干后,用研钵研成粉末,秸秆用剪刀剪成0.5cm的小段,根据不同底物的配料比例,配制试验底物,转入100ml医用小瓶,培养液总体积为50ml。在厌氧培养箱中,接种菌液2%。每组设置两个平行样,8℃低温培养一周,用气向色谱法测定产气量。
2结果与分析
2.1样品微生物分离筛选
试管培养基在培养过程中,培养液的颜色在第一天由红色变为无色,随着时间的增长,培养液中的气泡数量逐渐增多;培养1周左右,液体表面开始出现白色薄膜,同时培养液逐渐变浑浊,这是产产甲烷菌群代谢产物所引起的正常现象。试验过程中在固体培养基上长出的菌落呈圆形、透明、边缘整齐,在荧光显微镜下观察,有很强的荧光现象。试验结果表明,在严格的厌氧环境下,培养出来的菌落属于产甲烷菌群,经过筛选及滚管等操作,分离出来了产甲烷菌。
2.2低温产产甲烷菌的分离驯化
将两组培养液压片后用荧光显微镜观察发现,25℃培养下有大量蓝色荧光,用气相色谱检测培养瓶中的气体,发现有CH4气体的存在,8℃培养下,有少量荧光,用气相色谱分析,有CH4气体的存在,说明有耐低温的产甲烷菌存在。
2.3底物配比实验
根据试验所测结果,在猪粪:牛粪:羊粪:秸秆=2:1:2:1的比例下,产气量最大,且最大产气量比平均产气量67.2%高出20.1%。
在pH在大于或小于7时,甲烷菌的活性就会受到影响,产气量降低。TS浓度在低于8%时,产甲烷菌能够吸收的养分不足,高于8%时,由于代谢产物的积累,同样会降低产甲烷菌的产气量。当盐度在4%时,产甲烷菌产气量最大,高于4%,则使产甲烷菌活性降低,低于4%,则会影响其产气量。
2.4 甲烷气增产试验
将猪粪、牛粪、羊粪、秸秆按2:1:2:1的比例作底物,初始PH为7.2,TS浓度为8%,盐度为4%,在厌氧操作箱中接种产产甲烷菌,于8℃的生化培养箱中培养,定期测定其10天,根据试验组生长曲线,在前三天产甲烷菌的产气量增加缓慢,是菌体生长的迟缓期,其后生长进入倍数期,产气量增加迅速,在第七天产产甲烷菌的产气量达到最大,其生长进入稳定期,产气量不再增加。
甲烷菌的生长受到碳氮元素的影响,增加培养液中的N素含量,促进了碳氮含量的合理配比,使产甲烷菌的产气速率显著增加。经计算,对照组的C:N=21.5:1,加尿素10%后,C:N=24:1,加尿素15%后,C:N=25.2:1,加尿素20%后,C:N=26.4:1。试验表明,在C/N比为25:1时,产甲烷菌生产的气体最大。
3结论
试验研究表明,原料配比及pH,TS浓度,盐度对发酵效果有显著影响,主要体现在产气含量的差异。在混合原料做底物时,其产气量比单独物料做底物时产气量要大,且在猪粪:牛粪:羊粪:秸秆=2:1:2:1时,产气量最大。发酵时,pH值对产气的影响最大,其次是TS浓度和盐度。在混合原料作底物时,沼气发酵最佳试条件为为pH为7.2,TS浓度为8%,盐度为4%的试验组。产甲烷菌生长的最佳C/N比为25:1。
参考文献:
[1]陆清忠,邓功成,等.农村沼气池接种低温驯化沼气发酵微生物试验.现代农业科技,2009(05):268-271.
[2]刘德江,高桂丽,朱妍梅,等.猪粪、牛粪、羊粪沼气发酵比较试验[J].塔里木大学学报,2005,17(2):11-13.(in Chinese with English abstract).
论文作者:邓峤1,谢少华2
论文发表刊物:《防护工程》2019年12期
论文发表时间:2019/9/4
标签:甲烷论文; 沼气论文; 气量论文; 培养液论文; 培养基论文; 牛粪论文; 盐度论文; 《防护工程》2019年12期论文;