方法:本实验以高脂饲料喂养后，继以左冠状动脉前降支结扎术复制近似心肌缺血痰浊血瘀证大鼠模型。随机分成空白组、模型组、加味温胆方低剂量组、加味温胆方中剂量组、加味温胆方高剂量组各20只。中药低剂量组、中剂量组、高剂量组，同时分别以生理盐水及各剂量加味温胆方灌胃，用加味温胆方治疗7周，在第49天施冠状动脉结扎术；实验结束后，测定Caspase-7蛋白及mRNA水平。
结果: 与空白组比较，模型组及加味温胆方组各剂量Caspase-7 mRNA、蛋白表达水平升高（P<0.05）；中药高、中、低剂量组，与模型对照组相比，加味温胆方组各剂量组Caspase-7 mRNA、蛋白表达水平降低，剂量-效应关系明显(p<0.05)。可抑制大鼠心肌细胞凋亡。
结论: 加味温胆方能够减轻冠心病大鼠的病理损伤,抑制心肌细胞肥大, 抑制心肌细胞凋亡,从而对心肌缺血痰浊血瘀证起到一定的防治作用。
关键词: 加味温胆方
心肌缺血痰浊血瘀证
细胞凋亡
Caspase-7
Abstract
Objective: To investigate Effect of Jiawei Wendan decoction on cell apoptosis and expression levels of Caspase-7 in myocardial ischemia rats with blood stasis syndrome. The mechanism of prevention and treatment of myocardial ischemia.
Methods: After the experiment was fed with high fat diet, the rat model of myocardial ischemia phlegm and blood stasis syndrome was replicated by ligation of the left anterior descending branch of the coronary artery. rats were randomly divided into 5 groups, 20 in each group, namely, blank group, model group, modified Wendan Fang low dose group, modified Wendan Fang middle dose group, Jiawei Wendan Fang high dose group. Low dose group, middle dose group and high dose group were treated with modified Wei Dan Fang for 7 weeks. After the experiment, the levels of caspase-7 protein and mRNA were measured.?
Results: Compared with the blank group, the expression levels of Caspase-7 mRNA and protein, and the apoptosis optical density and area of cardiomyocytes were increased. (p<0.05);Compared with the model group, the expression level Caspase-3 mRNA and protein, the optical density of cardiomyocyte apoptosis and area were increased. Decreased, and with the increase in the dosage of Wendan Recipe, the expression levels of Caspase-7 mRNA and protein expression levels, and the optical density and area of cardiomyocyte apoptosis gradually increased. Reduced, dose-effect relationship was significant (p<0.05) .
Conclusions Jiawei Wendan Fang can alleviate pathological damage, inhibit myocardial cell hypertrophy and inhibit cardiomyocyte apoptosis, and play a preventive role in myocardial ischemia, phlegm turbidity and blood stasis syndrome.
Key words: Jiawei Wendan decoction;
Myocardial ischemia rat with blood stasis syndrome;
apoptosis；
Caspase-7
心肌缺血是各种原因导致冠状动脉痉挛或冠状动脉狭窄，心肌供血减少，心脏供氧减少，不能满足心脏血供和身体正常功能的病理状况。近年来，心肌缺血的发病率逐年上升，且发病年龄趋于低龄化趋势，与人们的生活节奏和生活压力有关 [1]。中老年人高发心肌缺血，对中老年人的生活生命都有威胁。冠状动脉狭窄是的心肌缺血的根源所在[2]。动脉粥样硬化、斑块形成又是冠状动脉狭窄的主要原因[3]。其病因与不健康的生活方式，高脂饮食，高盐饮食，作息不规律和吸烟饮酒等因素有关。近年来心肌缺血的发病率呈逐年上升的趋势，严重危害人类的身心健康，亦给家庭及社会都带来了沉重的经济负担[4]。因此，人们应该提高对心肌缺血认识程度，才能积极的防治疾病。有研究表明，凋亡一直存在心肌缺血的过程中，心肌损伤也是由凋亡导致的，是心肌缺血发生的重要机制之一[5]。心肌梗死后心肌大面积坏死，心肌细胞数量显著减少，胶原支架断裂，心肌细胞肥大，心室壁增厚、心脏扩张，心脏代偿功能减低，心脏收缩舒张功能障碍，最终出现心力衰竭，细胞凋亡参与其中。早期干预治疗，减少细胞凋亡的发生，降低心肌损伤中可以发挥重要作用[6]。在缺血缺氧过程中，心肌细胞的死亡包括凋亡和坏死两种完全不同的方式。细胞凋亡的生物分子学机制是非常复杂的，对于调亡机制一直在探索中[7]。近年来对凋亡相关蛋白的研究不少，Caspases-7[8]是Caspases家族中成员，是细胞凋亡的执行者，细胞凋亡的执行者在活性位点上具有半胱氨酸结构，半胱氨酸蛋白酶是胞质溶胶中的物质，参与了细胞凋亡的过程，蛋白酶很少具有这种特性。祖国医学认为，治疗疾病首先抓病机，辩证论治整体治疗，发挥中医特色优势，临床疗效显著且副作用少[9]，可作用于心肌缺血的多个病理环节[10]；提高生活质量，减少致死率。因此，利用中药在心肌缺血防治方面所具有的优势，建立理想动物模型，深入研究其发病机理，探索防治新途径，开发有效的预防和治疗药物，将有深远的理论意义和重要的实际意义。温胆汤是中医经典方剂之一，出自唐代孙思邈《备急千金要方》[11-14]和王焘编撰的《外台秘要》中，主要用于治疗痰浊血瘀症。原方由生姜、半夏、橘皮、竹茹、枳实、炙甘草六味药物组成，加味温胆方在其基础上加减，增加其益气活血化痰的力度，本实验以高脂饲料喂养后，继以左冠状动脉前降支结扎术复制近似心肌缺血痰浊血瘀证大鼠模型。通过对大鼠心肌缺血痰浊血瘀证细胞凋亡相关蛋白Caspase-7及基因表达的影响，探讨加味温胆方防治心肌缺血的作用机理。
材料和方法
1.实验动物及药物
SD大鼠，雄性 ，220-240g。 均购自黑龙江省中医药科学院实验动物中心。分笼饲养，每笼20只，室温26±3℃，均食用高脂饲料。实验药物：加味温胆方组成：半夏、陈皮、茯苓、甘草、胆星、竹茹、苍术、元胡、丹参、川芎、赤芍、牛膝、黄芪、节菖蒲等组成的中药复方制剂，由黑龙江省中医药科学院制剂室加工而成。功效：化痰活血、益气养心，主治：心肌缺血痰浊血瘀证。
2.模型制备
将100只SD大鼠随机分成5组，每组20只，即空白组、模型组、加味温胆方低剂量组、加味温胆方中剂量组、加味温胆方高剂量组。实验大鼠在普通条件下饲养，空白组普通饲料喂养，其余4组高脂饲料饲养。空白组和模型组以等容积的生理盐水灌胃。加味温胆方低剂量组、中剂量组、高剂量组，分别以一定浓度的中药灌胃，灌胃7周，在第49天结扎冠状动脉左前降支，监测心电图。实验结束时，用电子天平称取大鼠体重。处死大鼠，置于盛70%的乙醇中浸湿其体毛，然后滤纸吸干，开胸，无菌取心脏，4℃生理盐水冲洗血污，滤纸吸干，电子天平称取心脏重量。将心肌组织置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋后作病理学检查。
3.实验方法
3.1 免疫组化法测定Caspase-7蛋白在心脏中的表达
简要步骤：石蜡组织切片经常规脱蜡脱水后，用蛋白酶K(Roche)室温孵育30 min，PBS洗片后与0．3% H2O2甲醇溶液室温孵育30 min，PBS冲洗2次，加入TUNEL反应混合溶液在湿盒中37℃室温孵育60 min ，PBS冲洗3次，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。每张切片于400倍光镜下， Caspase-7蛋白计数呈棕黄色的细胞核。Caspase-7 Elisa试剂盒(批号：KIT10176-2、KIT10452-7、KIT10541-1、KIT10098-2)购于上海邦奕生物科技有限公司， Caspase-7一抗、二抗(购于上海信帆生物科技有限公司）
3.2大鼠心脏Caspase-7蛋白及mRNA表达的检测
应用Elisa法检测各组大鼠心脏组织中的Caspase-7蛋白水平。心脏组织存放在低温冰箱，取出并称取0.2g心脏组织解冻，加入液氮，应用微波碾磨仪（5000r/s）碾碎成粉末；组织粉末装到1mL Eppendorf管中，加入PBS液，充分振荡混匀离心。收集心脏组织匀浆，提取心脏组织总RNA并检测RNA纯度和浓度。
4.统计学处理
应用SPSS19.0 for Windows统计软件进行录入、统计分析。计量资料应用±s表示，多组均数间的比较应用方差分析，两两比较应用q检验。
结果
加味温胆方对大鼠Caspase-7蛋白及mRNA表达水平的影响
与空白组比较，模型组及加味温胆方组各剂量Caspase-7蛋白及mRNA升高（p<0.05）；与模型组比较，加味温胆方组各剂量组Caspase-7蛋白及 mRNA降低，且随着加味温胆方组给药剂量的增加，Caspase-7蛋白及 mRNA逐渐降低，剂量-效应关系明显(P<0.05)。
讨 论
凋亡是生命的基本现象，是细胞自主的死亡过程，是维持细胞数量的一种方式，受基因控制和调节，细胞凋亡贯穿了生命的始终。分为生理性和病理性凋亡两种情况，在生理情况下,为了保持身体的健康，避免疾病的发生，清除体内多余的和衰老的细胞，维持体内细胞环境的平衡。在病理情况下,一旦细胞凋亡的程序性环节，传导途径遭到破坏,可引起疾病的发生,研究细胞凋亡发生的机制对于探讨疾病的病因病机和治疗疾病的新方法具有重要意义。研究发现，心肌在在各种疾病状态下如：缺血、梗死、外力损伤等情况都存在心肌细胞凋亡，凋亡的心肌细胞排序破坏，降解，被吞噬。实验已经证实，应用抗凋亡药物治疗心肌缺血，疗效显著，与凋亡因子、抗凋亡因子的紊乱表达有关，心肌细胞凋亡一直参与其中并且发挥重要作用[15]。其中Caspase在凋亡的作用是破坏细胞结构和框架，阻断细胞DNA复制和修复，干扰mRNA剪切，损伤DNA与核结构，干扰细胞传导的信号，并降解为凋亡小体。已独特的方式切断细胞与周围的联系，凋亡因子通过抑制Caspasc-7的活性，来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程，本实验在此基础上复制了心肌缺血痰浊血瘀证动物模型观察心肌细胞凋亡相关蛋白Caspasc-7表达的情况。除此之外，动物试验研究表明，DNA修复酶、mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白，这些酶和蛋白能够被Caspase抑制和灭活，发生细胞凋亡，因此通过药物抑制心肌细胞的凋亡能有效治疗心肌缺血 [18-19]。
加味温胆方具有化痰活血、益气养心的功效，能够活血通络[20-21]，经现代药理研究加味温胆方具有保护血管内皮功能、改善心肌供血、调脂、降血压等药理学功效[22-23]，本研究结果显示与空白组比较，模型组及加味温胆方组各剂量Caspase-7 mRNA、蛋白表达水平升高；与模型组比较，加味温胆方组各剂量组Caspase-7 mRNA、蛋白表达水平降低，且随着加味温胆方组给药剂量的增加，说明加味温胆方能抑制Caspase-7 mRNA、蛋白的表达，进而抑制心肌细胞细胞凋亡，且具有明显的剂量-效应关系。尤以中药高剂量组的作用最为明显。由此可见，通过抑制心肌细胞凋亡可以减轻心肌缺血对心肌细胞的损害，改善心肌组织的功能，对防治冠心病起到了一定的治疗作用，加味温胆方高剂量效果尤为明显。
综上，加味温胆方能抑制心肌缺血痰浊血瘀证大鼠细胞凋亡，从而改善心肌缺血，其机制与加味温胆方能抑制Caspase-7 mRNA、蛋白的表达有关。
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论文作者:李雁1,,靳艳江2,, 张丽丽1▲通讯作者
论文发表刊物:《中国结合医学》2019年11期
论文发表时间:2020/1/16
标签：加味论文; 心肌论文; 细胞论文; 凋亡论文; 剂量论文; 蛋白论文; 大鼠论文; 《中国结合医学》2019年11期论文;