保庭毅[1]1999年在《免疫耐受模型的建立与胰岛移植的研究》文中研究表明研究背景与目的： 胰岛素依赖型糖尿病(Insulin dependent diabetes mellitus，IDDM)是一种慢性的自身免疫性疾病，由于β细胞的破坏，胰岛素产生减少，机体代谢失调，大小血管，冠状血管，微血管病变及心脏植物神经功能改变，进而导致糖尿病性心脏病等一系列心血管并发症。外源性胰岛素的替代治疗虽可预防IDDM患者代谢紊乱所致的急性死亡，延长患者的生命，但不能阻止或消除间隙性代谢紊乱导致的心血管系统的损害。基因疗法，诱导免疫耐受和免疫调节是IDDM治疗的新领域，其治疗目的是提供接近生理状态下胰岛素释放系统，克服其自身免疫的损害。将有功能的胰岛移植到体内是IDDM基因疗法的有效手段之一，近期的研究显示胰岛移植不仅能逆转高血糖，而且还能预防和减轻IDDM患者并发症的发生。胰岛移植面临机体免疫排斥是限制其临床应用的障碍，而诱导机体对胰岛移植物产生供体特异性耐受将是解决这一问题的有效途径。故本研究试图建立供体特异性的免疫耐受动物模型，并应用这一模型探索胰岛移植与免疫耐受的关系，并探讨移植区生理环境与胰岛存活和功能的关系。以期为临床应用胰岛移植治疗IDDM及其心血管并发症探索有效的途径。 主要研究方法与内容：
保庭毅[2]1999年在《免疫耐受模型的建立与胰岛移植的研究》文中研究说明本研究试图建立供体特异性的免疫耐受动物模型，并探索胰岛移植与免疫耐受的关系，探讨移植区生理与胰岛存活和功能的关系。结果发现：①从免疫应答和皮肤、胰岛移植物存活等结果，证实了经胸腺或门脉植入细胞（脾细胞和骨髓细胞或肝细胞）抗原，是建立免疫耐受的有效途径；植入细胞抗原和联合应用免疫抑制剂（抗大鼠淋巴细胞血清加环磷酰胺）可诱导免疫耐受；②在建立免疫耐受模型基础上，发现脾内或肝（门脉内）胰岛移植物有功能存活期明显延长，且渡过了急性排斥期；胰岛在脾内或肝内生长良好；均能逆转受者的高血糖状态，提示脾内与门脉内一样是胰岛移植的适宜场所。③肝细胞能抑制胰腺细胞介导的受体淋巴细胞增殖，提示肝细胞具有抑制胰腺细胞介导的急性排斥反应作用。④在肝细胞－ 胰岛细胞共培养条件下，胰岛分泌胰岛素大幅度减少，其机制可能是肝细胞或来源于肝脏的某种因子具有抑制胰岛分泌胰岛素作用。⑤脾脏分布α１，α２ 受体，且α１ 受体亚型介导的收缩效应并不依赖细胞外 Ｃａ２＋ 的存在。门静脉分布以 α１ 受体为主，且 α１ 受体亚型的缩血管效应依赖于细胞外 Ｃａ２＋ 的存在。
王婷婷[3]2016年在《间充质干细胞与未成熟树突状细胞联合胰岛细胞移植治疗小鼠糖尿病》文中进行了进一步梳理胰岛移植手术操作简单,可减少外源胰岛素使用,降低并发症风险,有望成为糖尿病最终治疗方案。近年来,随着胰岛移植研究的广泛开展,胰岛移植技术也取得了很大进展,但是胰岛数量不足以及术后免疫排斥反应仍然是胰岛移植最终进入临床阶段的最大阻碍。本论文在探究建立高效胰岛分离技术以及胰岛移植治疗糖尿病小鼠的基础上,进一步探究了移植后利用未成熟树突细胞(immature dendritic cells,imDCs)与间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)诱导胰岛移植物免疫耐受的潜在机制和应用价值。本文的主要研究内容归纳如下：1.建立了糖尿病小鼠模型。本研究利用链脲佐菌(STZ)能选择性对胰岛p细胞造成损伤的特点,按照100mg/kg、 150mg/kg、200mg/kg的剂量,一次性腹腔注射小鼠,进行造模。研究结果表明,对于小鼠而言,150mg/kg剂量造模效果最佳,200mg/kg剂量的STZ虽然也能快速导致小鼠血糖升高,但是此剂量可能对于小鼠机体损伤较大,导致部分小鼠死亡,不利于模型的建立。2.建立了分离纯化大鼠胰岛细胞方法。胰岛移植物质量和数量不足是影响胰岛移植效果的重要原因,本研究通过改进胰腺胶原酶灌注消化和密度梯度离心方法纯化胰岛,提高了胰岛的产量和质量,获得了满意的效果。3.成功分离培养了未成熟树突细胞(imDCs)和骨髓间充质干细胞(BM-MSCs).将培养的树突细胞经流式细胞仪分析鉴定,结果发现小鼠骨髓来源的树突细胞高表达CDllc(89.9%),中度表达MHC-Ⅱ (36.61%),低表达CD80(5.03%)、CD86(1.5%),符合imDC表面标志物的特征；对培养的间充质干细胞进行体外成骨和成脂诱导分化,结果表明贴壁法培养的间充质干细胞同样具有多项分化潜能.4.将imDCs与MSCs应用于胰岛移植治疗糖尿病小鼠中,结果发现胰岛与未成熟树突细胞混合移植虽未显著延长移植物的存活时间(12+2.31 d),但能显著降低其血糖水平：胰岛与间充质干细胞可使血糖下降到较低水平,移植物存活时间达12±2.65天；胰岛与间充质干细胞、未成熟树突细胞共同移植可使糖尿病鼠血糖下降并显著延长移植物的存活时问(15.6±3.48 d)。结果说明联合移植在一定程度上可延长移植物的存活时间并使血糖维持在较低的水平,较单独移植胰岛治疗小鼠糖尿病有积极作用。
李姝蓉[4]2017年在《调节性B细胞与抗体诱导的移植耐受的相关性研究》文中进行了进一步梳理调节性免疫细胞网络是目前移植免疫领域研究热点内容之一,其中调节性B细胞(Regulatory B cells,Bregs)是新近发现的一群具有负向调节功能的B细胞,该类细胞可通过多种作用方式从而促进器官移植术后免疫耐受形成,以及维持耐受状态。Bregs的发现及作用机制的研究,为诱导移植耐受策略提供了新方向。但是目前对于Bregs细胞的表型、功能、及调节机制没有深入的认识,尤其在移植免疫中Bregs细胞发挥的作用至今尚未明确。在已有报道的基础上,我们进行了以下研究。首先,我们建立了同种异基因小鼠胰岛移植动物模型,按以下方式分组:对照组(n=5);单纯移植1周组(n=5);移植+双抗体1周组(n=5);单纯移植2周组(n=5);移植+双抗体2周组(n=5);长期耐受组(即移植物存活超过90天)(n=4)。流式细胞仪检测移植后受体小鼠脾细胞中CD19+CD5+CD1d+B10细胞和CD19+Tim-1+B细胞比例。结果表示,只有移植+双抗体2周组小鼠体内的B10细胞有明显增加,最高增加至5.9%(P<0.05)。单纯移植2周组、移植+双抗体2周组,以及长期耐受组小鼠体内的CD19+Tim-1+B细胞则均有明显增加(P<0.05)。为进一步明确Bregs是通过与哪些免疫细胞作用而促进耐受形成,我们同期检测了CD4+CD25+Tregs以及CD4+IFN-γ+Th1细胞和CD4+IL-4+Th2细胞。结果表明,移植+双抗体2周组小鼠体内的CD4+CD25+Tregs和CD4+IL-4+Th2均有显著增加(P<0.05),CD4+IFN-γ+Th1细胞则明显减少(P<0.05)。并且,除Th2细胞外,长期耐受小鼠的各淋巴细胞比例变化趋势都与术后2周数据一致。以上结果提示在抗CD45RB/抗Tim-1联合诱导的小鼠移植耐受过程中,调节性B细胞在耐受的初期及维持过程中都起到了重要作用,其具体机制可能是通过与调节性T细胞,Th1细胞以及Th2细胞的相互作用参与免疫调节。之后,我们对调节性B细胞的扩增条件进行了初步探索。结果表明LPS可刺激B10细胞在体外进行增殖,LPS的作用时间(72h)与细胞的增殖成正相关(P<0.05)。
李海民[5]2003年在《睾丸Sertoli细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中研究表明长期以来，急性和慢性排斥反应一直是困扰组织器官移植的一大难题，应用免疫抑制剂的方法有许多明显的毒副作用。目前认为解决这些问题的关键是在于诱导受体对供体组织器官的免疫耐受。 免疫豁免提出已有100多年历史，机体组织器官中迄今仅发现脑、眼角膜、睾丸、胎盘等组织器官为免疫豁免部位。现有的研究证实产生免疫豁免部位组织中某种细胞持续表达FasL是引起免疫豁免的重要原因之一。这一机制的发现，为移植免疫耐受的研究另辟新径，具有重要的意义。 睾丸支持细胞(Sertoli细胞)高表达FasL是睾丸成为免疫豁免器官的重要原因之一。本研究拟通过移植肝脏嵌合睾丸Sertoli细胞的方法，使移植肝脏高表达FasL，观察该方法对大鼠肝移植免疫耐受的诱导作用。 实验一：睾丸Sertoli细胞的制备及其对淋巴细胞的影响 目的：探讨睾丸Sertoli细胞分离纯化的方法及其体外对淋巴细胞免疫功能的影响。方法：①睾丸Sertoli细胞分离纯化：32只雄性SD幼鼠随机分为4组，每组8只，采用两种消化和两种筛网过滤方法，从睾丸组织分离Sertoli细胞。A组：用2.5g／L胶原酶V消化，两次筛网过滤。B组：用2.5g/L第四军医大学博士研究生学位论文 中文摘要胶原酶V消化，一次筛网过滤。C组：用工刀g／L胶原酶V消化，两次筛网过滤。D组：用 2．og／L胶原酶V消化，一次筛网过滤。对分离纯化的睾丸 Sertoli细胞进行记数，判断晕丸Sertoli细胞的活性；②细胞毒实验：取Wstar大鼠脾淋巴细胞 IX 106／ml，接种于 96孔培养板上孵育48h石D大鼠睾丸 Sertoli细胞经15GY 照射1卜，然后将IX f／ffilM组）、IX 10‘／ml＊组）、IX且／＊l （C组）和先经 FasL－mAb共同培养 30min的 IX 10＼ml（D组）晕丸 Sertoli细胞，分别加入含脾细胞的培养板内，再培养4～6h后，MTT比色法测OD值，判断睾丸Sertoli细胞对活性淋巴细胞的细胞毒作用。结果：①每只幼鼠获得的睾丸 Sertoli细胞数，A、B、C、D组分别为：（．95士 0刀6）XI 06个、（0．60士0．06）XIO‘个、（l．03士0．09） XIO‘个和（0．50士0．23）X 10‘个；存活率（O）分别为：88．8士2．5、89．7士2．7、89．8士二．3和 88．3土3．2。A组和 C组获得细胞数明显多于B组和 D组（P＜0刀1），其中 C组所获SOrtoli细胞数最高，达1刀3士0．09X 106个。四组中的睾丸 Sertoli细胞存活率相似，均在 88％以上；②体外宰丸Sertoli细胞对淋巴细胞有明显的毒性作用，各组比较有显著性差异J＜0刀1人随着 SCrtoli细胞数量的增加及共培养时间延长毒性作用逐渐增加，当 Sertoli细胞数量增加至 IX 106／ml、共培养 3d时作用最明显，以后这种作用不再增强而维持在一较高水平：结论：睾丸组织采用2．og／L的胶原酶V消化后，两次筛网过滤可获取数量较多的睾丸Sertoli细胞，并且可节省25％的胶原酶V，但不影响睾丸Sertoli细胞的存活率；体外Sertoli细胞对淋巴细胞的杀伤或抑制作用与Sertoli细胞数量和共培养时间有关。 实验二：嵌合睾丸SC悦d5细胞肝脏模型的建立 目的：建立嵌合Sertoli细胞肝脏模型，拟将嵌合Sertoli细胞肝脏作为供肝进行移植做准备。方法：60只 SD雌性大鼠随机分为 6组，每组 10只。在无菌操作开腹直视下经门静脉注入Zml Sertoli细胞，A组：生理盐水：B组：培养宰丸 Sertoli细胞的上清液；C组：Sertoli细胞 ZX 10’个；D组：2X106个；E组：ZX10’个，F组：2X108个。两周后取肝组织：免疫组化法 4第四军医人学博士研究生学位论文 中文摘要Y染色体检测，判断肝内嵌合 Sertoli细胞数；QRTICR法检测肝组织 FasLInRNA表达相对含量。结果：肝内嵌合Sertoli细胞数量C、D、E、F组分别为：47石土14．2、54．5士15．8、68．吕士22．0和67．4上23．8，E组和F组与C组和 D组有显著差异（P＜0．05）；肝组织中 FasL mRNA表达相对含量 A、B、C、D、E、F组分别为：0．185士0刀41、0．202士0．044、0238士0刀43、0．245士0刀37、0．427士0刀45、0．429士0刀35，C组和D组与A组和B组及E组和F组有显著差异（P＜0．05），E组和F组与A组和B组相差非常显著（P＜0．01）。结论：Sertoli细胞经门静脉肝内注入可在肝脏内嵌合，嵌合数量及肝组织中FasL mRNA相对表达含量，与注入数量有关，当注入数量超过 2 XIO’个，嵌合数量及 FasL mRNA相对表达含量不再升高。 实验三：受体肝分步切除的“二袖套” 法大鼠原位肝移植模型的建立 （大鼠原位肝移植模型的改进） 目的：改进二袖套法大鼠原位肝移植操作方法，使该模型能够普及应用。方法：共施行78例大鼠原位肝移植，其中34例采用传统方法，44例采用改进术式，对两种术式的操作时间、无肝期以及手术成功率等进行比较。结果：采用改进术式，肝下下腔静脉和门静脉吻合时间均不到lmin，无肝期和受体手术时间分别缩短至 14 min和 37 min左右
郑阳[6]2013年在《胃转流术联合胰岛移植治疗糖尿病大鼠的实验研究》文中研究说明本课题通过链脲佐菌素诱导的不同残存胰岛功能的Wistar大鼠糖尿病,并行十二指肠空肠转流术,探讨残存胰岛功能对胃转流术治疗糖尿病的疗效的影响；通过优化大鼠胰岛分离纯化方法,能够在不同体重水平的大鼠间获得稳定高产率、高纯度、活性和功能良好的胰岛；通过建立糖尿病大鼠同种异体肾被膜下胰岛移植模型及十二指肠空肠转流术联合胰岛移植模型,评价胃转流术联合胰岛移植治疗糖尿病的疗效,并探讨其机制。第一部分残存胰岛功能对胃转流术治疗糖尿病大鼠疗效的影响目的：建立由链脲佐菌素诱导的不同残存胰岛功能的大鼠糖尿病模型,建立糖尿病大鼠十二指肠空肠转流术模型,探讨残存胰岛功能对胃转流术治疗糖尿病大鼠疗效的影响和其可能的机制。方法：取成年雄性Wistar大鼠,分为正常对照组、低剂量对照组、高剂量对照组、低剂量手术组、高剂量手术组。通过腹腔注射不同剂量的链脲佐菌素,诱导不同残存胰岛功能的大鼠糖尿病。低剂量手术组、高剂量手术组注射后行十二指肠空肠转流术。观察各组大鼠非空腹血糖的变化及口服糖耐量情况,检测血浆C肽浓度和胰岛血糖素样肽1浓度的变化,观察大鼠胰腺病理,比较注射不同链脲佐菌素注射剂量大鼠的胰岛功能残存情况,并比较胃转流术对不同残存胰岛功能糖尿病大鼠的疗效。结果：注射链脲佐菌素7天后的各组大鼠的血糖均高于正常对照组(P＜0.01),而血浆C肽浓度均低于正常对照组(P＜0.01)。高剂量对照组大鼠注射链脲佐菌素后血糖高于低剂量对照组(P＜0.01),注射链脲佐菌素后C肽水平低于低剂量对照组(P＜0.01),口服糖耐量较低剂量对照组更差,胰岛病理损伤较低剂量对照组更严重。低剂量手术组及高剂量手术组行十二指肠空肠转流术后胰岛血糖素样肽1浓度升高(P＜0.01),并高于低剂量对照组及高剂量对照组(P＜0.01)。低剂量手术组行十二指肠空肠转流术后血糖较术前明显下降(P＜0.01),低于低剂量对照组(P＜0.01),血浆C肽浓度较术前明显升高(P＜0.01),亦高于低剂量对照组(P＜0.01),口服糖耐量优于低剂量对照组,胰岛病理损伤较低剂量对照组为轻。高剂量手术组行十二指肠空肠转流术后血糖(P>0.05)、血浆C肽浓度(P>0.05)较术前及高剂量对照组未有改善,口服糖耐量较高剂量对照组无明显差异,胰腺病理损伤较高剂量对照组未见改善。结论：残存胰岛功能制约着胃转流术治疗糖尿病的疗效,当胰岛功能衰竭时,手术无法起到治疗作用。第二部分大鼠胰岛分离纯化方法的建立目的：建立一种高效、稳定的大鼠胰岛分离纯化方法。.方法：成年雄性SD大鼠,按体重分成4组,采用改进后的方法进行胰岛分离纯化,双硫腙染色计数胰岛、估计纯度,吖啶橙-碘化丙锭染色判断胰岛活性,葡萄糖刺激实验检测胰岛功能。结果：全部大鼠的胰岛产率为1056±357个／只,各组间胰岛产率差异无统计学意义(P＞0.05)。胰岛纯度和活率均超过90%,胰岛刺激指数为2.08±0.10。结论：应用改进的分离纯化方法,能在不同体重水平大鼠问获得稳定的胰岛高产率,胰岛的纯度、活性和功能可靠。第三部分胃转流术联合胰岛移植治疗糖尿病大鼠的疗效目的：建立糖尿病大鼠同种异体肾被膜下胰岛移植模型,探讨胃转流术联合胰岛移植治疗糖尿病大鼠的疗效和其可能的机制。方法：成年雄性Wistar大鼠,分为糖尿病对照组、单纯转流术组、单纯移植组、联合治疗组。通过腹腔注射的链脲佐菌素,诱导胰岛功能衰竭的大鼠糖尿病。单纯转流术组行十二指肠空肠转流术,单纯移植组以SD大鼠为供体行左肾被膜下胰岛移植,联合治疗组先行十二指肠空肠转流术,后行以SD大鼠为供体的左肾被膜下胰岛移植。观察各组大鼠非空腹血糖的变化及口服糖耐量情况,检测血浆胰岛素浓度和胰岛血糖素样肽1浓度,观察大鼠胰腺病理及胰岛移植物病理,比较单纯转流术组、单纯移植组、联合治疗组的疗效。结果：单纯转流术组行十二指肠空肠转流术后较糖尿病对照组血糖(P＞0.05)、血浆胰岛素(P＞0.05)、口服糖耐量无明显差异,胰腺病理亦未见改善。单纯移植组及联合治疗组在胰岛移植术后血糖(P＜0.01)、血浆胰岛素浓度(P＜0.01)、口服糖耐量较糖尿病对照组有所改善,胰腺病理未见改善。联合治疗组胰岛移植物存活时问较单纯移植组延长(P＜0.01),移植物病理损伤及炎症渗出较单纯移植组更轻。结论：胃转流术联合胰岛移植对于胰岛功能衰竭的糖尿病有一定的疗效。胃转流术能够延长胰岛移植物的存活时间。
张振[7]2008年在《供体凋亡细胞输注诱导大鼠胰岛移植免疫耐受的研究》文中认为研究背景胰岛移植重建胰岛素分泌系统,是一种有望彻底根治糖尿病的治疗方法。2000年,Edmonton方案的成功,标志着胰岛移植取得了突破性的进展,从而带动了胰岛移植临床试验性治疗在世界范围内广泛展开。但是免疫排斥以及免疫抑制剂所带来的副作用和潜在危险性仍是难以克服的障碍。目前普遍认为,解决异体移植排斥反应的关键在于诱导受体对供体的细胞、组织或器官产生免疫耐受。由于移植免疫耐受的机制十分复杂,尽管诱导免疫耐受的方法众多,但均未能达到完全可靠持久的特异性耐受。细胞凋亡是生物体内普遍存在的一种生理和病理现象,是正常器官和组织发育、清除有害的、过量的和无功能细胞、维持自身稳态的必要环节。现有研究表明:凋亡是机体免疫状态保持平衡和稳定的重要作用机制,凋亡细胞对免疫系统存在着主动的调节作用。凋亡细胞能分泌脂类趋化因子,改变自身胞膜结构表达“eat-me”信号,诱导吞噬细胞对其进行清除;同时凋亡细胞被抗原提呈细胞吞噬后,通过吞噬细胞分泌抑制性免疫因子如TGF-β、PGE_2、IL-10等,造成了特殊的抗原识别微环境,可以促使相关淋巴细胞针对凋亡抗原产生免疫耐受,而不会引起炎性免疫应答。据此,孙尔维等提出利用供体凋亡细胞输注来诱导供体特异性免疫耐受的理论设想。我们课题组以前的工作证实,凋亡细胞在体外对T淋巴细胞活化增殖有直接抑制作用;凋亡细胞预输注可以显著延长大鼠心脏移植模型、肝移植模型存活时间。因此,我们拟应用供体凋亡脾淋巴细胞静脉输注的方法,来诱导糖尿病大鼠同种异体胰岛移植的免疫耐受,以探求延长胰岛移植物存活的方法。目的初步探讨凋亡细胞静脉输注诱导胰岛移植免疫耐受,延长胰岛移植物存活时间的方法,为寻找诱导胰岛移植免疫耐受的方法开辟新的途径,提供新的依据。方法1、直线加速器照射对体外培养大鼠脾细胞凋亡的影响:采用研磨法获得Wistar大鼠脾淋巴细胞悬液。将脾细胞悬液加入细胞培养瓶,分四组,A组为对照组,B、C、D组应用Varian医用直线加速器照射,各组吸收剂量分别为:1.5Gy、2.0Gy、3.0Gy。各组细胞处理后置于37℃,5%CO_2恒温培养箱培养。分别在培养后4h、8h、12h应用流式细胞仪检测细胞凋亡率;2、大鼠胰岛细胞的分离纯化:采用胶原酶P胰管灌注消化,短期低温培养后Ficoll-400不连续梯度纯化Wistar大鼠胰岛;3、建立糖尿病动物模型:以STZ(链脲佐菌素)(56mg/kg·体重)经腹腔一次性注射,制备SD大鼠实验性糖尿病模型(连续2次血糖＞16.7mmol/L);4、供体凋亡细胞输注对糖尿病大鼠胰岛移植物的影响:以雄性Wistar大鼠为供体,雄性SD大鼠为受体。将糖尿病SD大鼠随机分为Hank's液注射(A组)、正常供体脾细胞预输注(B组)、供体凋亡脾细胞预输注(C组)及供体坏死脾细胞预输注(D组)四组。各组在预处理7天后行胰岛移植,将1000IEQ的胰岛细胞移植入各组糖尿病大鼠的肾包囊内,比较各组移植物生存时间上的差异。同时各实验组分别在预处理后第7天(即胰岛移植术前)、胰岛移植术后7天、14天、排斥后应用放射免疫法测定大鼠血清胰岛素水平。供体凋亡脾细胞预输注糖尿病SD大鼠则在不同的移植时期(包含血糖正常期、排斥期两个时期)手术将移植物载体肾取出;其余各实验组在糖尿病SD大鼠移植物排斥后2天,取出其移植物载体肾,做胰岛素的免疫组化检测。5、供体凋亡细胞输注对胰岛移植糖尿病大鼠淋巴细胞增殖反应的影响:将糖尿病SD大鼠按上述方法分组,各组分别于预处理后第7天(即胰岛移植术前)、胰岛移植术后7天、14天、排斥后取大鼠脾脏,分离淋巴细胞,经刀豆蛋白A(ConcanavalinA ConA)刺激培养,利用CFSE(2羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)细胞染色法观察受体淋巴细胞增殖反应程度。结果1、直线加速器高能X线照射Wistar大鼠脾细胞,吸收剂量2.0Gy组各个时间点的凋亡率有差异(F=5.930,P=0.026),且与对照组、1.5Gy组比较凋亡率有差异(P值均＜0.050),以2.0Gy组、8小时的凋亡率较高。2、每条Wistar大鼠胰腺经分离、纯化后平均可获取的胰岛细胞团数量为(1063.91±84.74)IEQ,DTZ(双硫腙)染色显示纯度为(70.51±6.20)%。高糖刺激时胰岛β细胞胰岛素的释放量为低糖刺激时的2.72倍。3、以STZ(56mg/kg·体重)一次性经腹腔注射的方法,可成功诱发SD大鼠的试验性糖尿病,糖尿病模型建模成功率为94%。4、输注凋亡细胞组与输注Hank's液组、输注正常细胞组、输注坏死细胞组之间的移植物存活时间有差异(P值均＜0.050)。平均存活天数为32天,最长达42天,以输注凋亡细胞组胰岛移植物存活时间最长。正常脾细胞输注组较输注Hank's液组及坏死细胞组也有所延长。预输注Hank's液及坏死细胞组则无此效应。5、预输注凋亡细胞组移植前胰岛素水平与移植后7天、移植后14天有差异(P值均＜0.050),以移植后7天、14天较高。移植后14天输注凋亡细胞组与输注正常细胞组的胰岛素水平有差异(T=3.439,P=0.009),以凋亡细胞组胰岛素水平最高,而预输注Hank's液及坏死细胞组各时间点的胰岛素水平无差异(P值均＞0.050)。6、供体凋亡细胞预输注组胰岛移植物在受体血糖正常时取出做组织切片,经Insulin免疫组织化学染色证实有表达胰岛素阳性的胰岛细胞团存在,呈棕褐色。而在被排斥后取出的移植物进行免疫组化检测,则未发现胰岛素阳性的胰岛细胞团存在。输注Hank's液组、输注供体正常细胞或坏死细胞组的移植物在被排斥后取出行Insulin免疫组化染色检测,亦无胰岛素阳性细胞存在。7、预输注凋亡细胞组移植前的淋巴细胞增殖指数与移植后14天、排斥后有差异(P值均＜0.050),以移植前的增殖指数最低,移植前、移植后7天各组淋巴细胞增殖指数有差异(F=29.943,P=0.000),以输注凋亡细胞组的增殖指数最低,这种抑制效应至移植后14天仍存在,排斥后则消失。结论1、直线加速器高能X线照射能在体外简便安全有效诱导大鼠脾细胞凋亡。2、采用胶原酶P胰管灌注消化,短期低温培养后Ficoll-400不连续梯度纯化能分离、纯化出较大数量且功能良好的大鼠胰岛细胞。3、预输注供体凋亡细胞能显著延长同种异体大鼠胰岛移植物的存活时间。应用供体凋亡细胞诱导胰岛移植免疫耐受是一条可行的途径。4、以体外淋巴细胞增殖实验证实,预输注供体凋亡细胞对受体鼠淋巴细胞经丝裂原ConA刺激的增殖反应具有抑制作用。
石伟[8]2008年在《天花粉蛋白和IL-12p40基因在小鼠同种胰岛移植排斥反应中的作用及机制研究》文中研究表明糖尿病是常见慢性疾病之一,会带来一系列并发症,严重威胁患者的健康和生命。胰岛素的问世虽然大大降低了糖尿病患者的死亡率,但其存在低血糖等不良反应,对于糖尿病的并发症也无法有效控制。胰岛移植是有希望替代胰岛素的一种新的治疗措施,接受胰岛移植的患者在一段时期内,在一定程度上可以摆脱对胰岛素的依赖。但是,植入的胰岛不能长期发挥作用,针对移植物的排斥反应是削弱胰岛移植长期效果的重要原因。本项研究即着眼于同种胰岛移植的免疫排斥反应问题,旨在探索排斥反应的相关机制,并用适当干预措施作用于受体获得免疫抑制,以期缓解针对胰岛移植物的排斥作用。首先,我们建立了链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠进行肾被膜下胰岛移植的动物模型。在小鼠胰岛的获取上我们吸取了前人的经验并加以改进。然后我们进行了BALB/c小鼠对C57BL/6小鼠的同种胰岛移植,腹腔注射天花粉蛋白来干预受体小鼠的免疫反应,探讨天花粉蛋白对胰岛移植排斥反应的作用和可能的机制,并了解其对胰岛功能的影响。以IL-12p40基因敲除小鼠为移植受体,与野生型的受体相比较,来了解IL-12p40基因及其涉及的免疫环节在小鼠同种胰岛移植排斥中的作用和地位。第一部分小鼠胰岛移植模型的建立目的:建立简便高效的小鼠胰岛获取方法和稳定的糖尿病小鼠胰岛移植动物模型。方法:(1)用改良的胆囊穿刺胶原酶P灌注法消化小鼠胰腺,了解操作难度和消化效果。分两组(n=6)比较Ficoll梯密度离心法和滤网过滤法纯化胰岛的效果。(2)用链脲佐菌素诱导小鼠糖尿病,行肾被膜下胰岛移植,观察糖尿病模型的稳定度及胰岛移植后小鼠血糖的纠正情况。结果:(1)改良的胆囊穿刺胶原酶P灌注方法简单、有效,胰腺消化充分,胰岛形态良好;胰岛纯化方法上,滤网过滤法获得的胰岛数量和纯度都比Ficoll梯密度离心法要高(P＜0.05),而操作时间则显著减少(P＜0.01)。胰岛素释放试验显示滤网过滤纯化的胰岛释放胰岛素的能力高于Ficoll梯密度离心法(P＜0.05)。(2)链脲佐菌素注射后48小时内小鼠血糖即升高至16.7mmol/L以上形成糖尿病,而胰岛移植(n=10)后第1天血糖即得到纠正,在发生排斥反应以前血糖都能维持正常水平。结论:胆囊穿刺胶原酶P灌注加滤过纯化的方法简便、高效,是获取小鼠胰岛的有效措施;链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠行肾被膜下胰岛移植是可靠的胰岛移植模型。第二部分天花粉蛋白在小鼠同种胰岛移植中的应用目的:探讨天花粉蛋白(TCS)对小鼠同种胰岛移植排斥反应的抑制作用;探索这种抑制作用的可能机制;初步了解天花粉蛋白对胰岛功能的影响。方法:(1)行BALB/c小鼠至C57BL/6小鼠的同种异基因胰岛移植,随机分为天花粉蛋白腹腔注射组(n=6)和对照组(n=6),移植后每天测血糖,了解胰岛移植物存活时间。(2)设TCS组、胰岛移植组、胰岛移植+TCS组和空白对照组(每组n=5),检测各组T细胞增殖水平和分泌IFN-γ水平,及外周淋巴组织内T细胞的组成比例,探索天花粉蛋白的抑制作用机理。(3)体内实验,检测天花粉蛋白使用前、后胰岛移植物分泌C肽的水平;体外实验,胰岛培养时加入天花粉蛋白,做胰岛素释放试验并与对照组比较,了解其对胰岛功能的影响。结果:(1)天花粉蛋白腹腔注射组胰岛移植物存活时间为12.2±1.7天,对照组为9.7±1.4天,移植物存活时间有所延长(P＜0.05)。(2)天花粉蛋白注射后T细胞对供体特异性抗原刺激的增殖反应明显减弱(P＜0.05);分泌IFN-γ水平下降;外周淋巴组织内调节型T细胞比例上升。(3)体内实验,天花粉蛋白使用前、后C肽水平无明显改变;体外实验,胰岛培养时加入天花粉蛋白,胰岛分泌胰岛素的水平下降(P＜0.05)。结论:天花粉蛋白可以减缓小鼠同种胰岛移植的排斥反应;其机制可能与天花粉蛋白抑制小鼠的抗原特异性T细胞增殖及上调调节型T细胞有关。天花粉蛋白直接作用于胰岛,对胰岛的功能有抑制作用。第三部分IL-12p40在胰岛移植排斥反应中作用的研究目的:了解IL-12p40基因在小鼠同种胰岛移植排斥反应中的作用,探索IL-12p40基因缺陷所导致的Th1向Th2的免疫偏离能否产生对同种胰岛移植的免疫耐受。方法:用IL-12p40基因敲除小鼠为受体行同种胰岛移植(n=7),与野生型受体(n=6)比较,观察胰岛移植物存活时间,移植区域CD4~+和CD8~+T细胞的浸润情况,以及细胞因子IL-4和IFN-γ的表达水平。结果:IL-12p40基因敲除受体胰岛移植物的存活时间为10.0±2.9天,对照组为9.7±2.1天,差异无统计学意义(P＞0.05);两组小鼠移植区域CD4~+和CD8~+T细胞的浸润情况,以及细胞因子IL-4和IFN-γ的表达水平都没有明显差异。结论:IL-12p40基因缺陷所导致的受体Th1向Th2的免疫偏离不能明显减弱小鼠同种胰岛移植的排斥反应,因此也无法诱导免疫耐受。我们的实验从药物干预和基因敲除两方面来探讨小鼠同种胰岛移植排斥反应的发生机制及防治措施。初步探索了中药成分天花粉蛋白在对抗免疫排斥中的作用和机制,也明确了IL-12p40基因缺陷无法导致对同种胰岛移植物的免疫耐受。研究结果有助于加深对胰岛移植排斥反应及免疫耐受的认识,对在移植领域进一步研究应用天花粉蛋白或其他中药成分起到了积极作用。
张梅[9]2006年在《抗原特异性CD4～+CD25～+调节性T细胞诱导胰岛移植耐受及其机制的初步研究》文中研究指明第—部分 小鼠胰岛移植模型的建立 目的 探讨提高小鼠胰岛分离数量和质量的可靠方法，构建小鼠胰岛移植的模型。 方法 采用胆管内胶原酶灌注和Histopaque 1077密度离心法分离纯化胰岛。分别观察供体的体重、胶原酶的浓度、消化的时间、温度和胰岛培养时间对胰岛分离数量及移植效果的影响。通过葡萄糖刺激胰岛素分泌试验和肾包膜下移植评价分离的胰岛功能。 结果 高体重供体组胰岛的收获量显著高于低体重供体组(166.5±23.47 vs 89.83±7.65个；P＜0.01)。胰岛活率≥95％。胶原酶浓度、消化时间对胰岛收获量起重要作用。高糖组(16.7mmol／L)胰岛素释放量为低糖组(3.3mmol／L)的2.9倍(29.49±5.61 vs 10.07±3.14ng·／10个／h)。同种异体胰岛移植的糖尿病小鼠高血糖状态得到逆转，提示胰岛的β细胞具有良好功能。培养12～24小时胰岛与培养2～4小时胰岛的葡萄糖刺激胰岛素释放量无统计学差异，但前者在移植给同种异体小鼠后血糖恢复较后者更加迅速而优良。 结论 小鼠的体重、胶原酶的浓度、消化时间和温度是影响胰岛数量和功能的重要因素。短时间培养能够提高胰岛移植的效果。
赵雪倩[10]2007年在《B7-H4基因修饰的胰岛细胞对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的影响》文中研究说明本课题利用携带免疫负调控分子B7-H4的重组质粒转染自BABL/c小鼠分离得到的胰岛细胞,并采用肾包膜下注射的方法将其移植给诱发Ⅰ型糖尿病的C57BL/6小鼠模型,观察移植物的功能状态和存活时间,探索避免同种异体胰岛移植排斥反应的有效方法。在体外将基因修饰的胰岛细胞与T淋巴细胞混合培养,观察其对T细胞增殖和细胞因子分泌的影响。结果显示:该法能明显改善受体鼠糖尿病症状,有效控制血糖水平,显著延长同种异体移植胰岛的存活期;B7-H4基因修饰的胰岛细胞在体外刺激T淋巴细胞增殖的能力显著下降,并可明显抑制IL-2、IFN-γ的分泌。为Ⅰ型糖尿病的胰岛移植治疗研究提供了新的途径,为进一步的免疫负向调控分子的理论和应用研究提供了新的依据和方法。
参考文献：
[1]. 免疫耐受模型的建立与胰岛移植的研究[D]. 保庭毅. 第四军医大学. 1999
[2]. 免疫耐受模型的建立与胰岛移植的研究[J]. 保庭毅. 心功能杂志. 1999
[3]. 间充质干细胞与未成熟树突状细胞联合胰岛细胞移植治疗小鼠糖尿病[D]. 王婷婷. 湖南大学. 2016
[4]. 调节性B细胞与抗体诱导的移植耐受的相关性研究[D]. 李姝蓉. 电子科技大学. 2017
[5]. 睾丸Sertoli细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究[D]. 李海民. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[6]. 胃转流术联合胰岛移植治疗糖尿病大鼠的实验研究[D]. 郑阳. 天津医科大学. 2013
[7]. 供体凋亡细胞输注诱导大鼠胰岛移植免疫耐受的研究[D]. 张振. 南方医科大学. 2008
[8]. 天花粉蛋白和IL-12p40基因在小鼠同种胰岛移植排斥反应中的作用及机制研究[D]. 石伟. 复旦大学. 2008
[9]. 抗原特异性CD4～+CD25～+调节性T细胞诱导胰岛移植耐受及其机制的初步研究[D]. 张梅. 南京医科大学. 2006
[10]. B7-H4基因修饰的胰岛细胞对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的影响[D]. 赵雪倩. 第二军医大学. 2007
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