新疆医科大学第六附属医院 神经内科
【摘 要】目的 探究SD大鼠SAHS模型视交叉上核CLOCK基因对5-羟色胺的影响。 方法 选择健康雄性3月龄SD青年大鼠48只，随机分为常氧对照组（24只）和SAHS模型组（24只），制作SD大鼠SAHS模型，两组又根据间歇性缺氧的不同时程，分别分为 IH1周、IH2周、IH4周、IH12周等4组，每组6 只。分别取血清和丘脑视上核处脑组织，分别利用ELISA和qPCR法检测血清中的5-羟色胺和丘脑视上核处脑组织中的CLOCK基因表达水平。 结果 和对照组相比，间歇性缺氧组5-羟色胺水平显著下降（P＜0.05）；SAHS模型组IH1周、IH2周、IH4周血清中5-羟色胺水平随着时间的延伸呈下降趋势，IH12周血清中5-羟色胺水平和IH2周相当。和对照组相比，间歇性缺氧组CLOCK基因表达水平显著升高（P＜0.05）；IH1周、IH2周、IH4周、IH12周组大鼠CLOCK基因表达水平随着间歇性缺氧时间逐渐升高变化不显著。结论 SAHS模型SD大鼠CLOCK基因表达水平升高抑制5-羟色胺水平进而影响睡眠结构和睡眠质量。
【关键词】SD大鼠；SAHS模型；视交叉上核；CLOCK基因；5-羟色胺
Effects of CLOCK gene on serotonin in suprachiasmatic nucleus of SD rats
[Abstract] Objective: To investigate the effect of CLOCK gene on the serotonin in the suprachiasmatic nucleus of SDHS SAHS model. Methods: Forty-eight SD male SD rats were divided into normoxia control group (24 rats) and SAHS model group (24 rats) randomly. SDHS SAHS model was established, and the rats were divided into two groups according to the intermittent hypoxia IH1 week, IH2 week, IH4 week, and IH12 week, with 6 rats in each group. Serum and thalamic supraoptic nuclei were taken respectively. The levels of CLOCK gene in serotonin and supraoptic nucleus of thalamus were detected by ELISA and qPCR. Results: Compared with the control group, the level of serotonin in the hypoxic group was significantly decreased (P <0.05). In the SAHS model group, the serum serotonin levels decreased in IH1 week, IH2 week and IH4 week, Weekly serum serotonin levels and IH2 weeks rather. Compared with control group, the expression of CLOCK gene in intermittent hypoxia group was significantly increased (P <0.05); the expression of CLOCK gene in IH1 week, IH2 week, IH4 week, IH12 week group gradually decreased with intermittent hypoxia time The change was not significant. Conclusion: SAHS model increased the level of CLOCK gene expression in SD rats, and decreased the level of serotonin, which in turn affected sleep structure and sleep quality.
[Keywords] SD rats; SAHS model; Suprachiasmatic nucleus; CLOCK gene; Serotonin
【中图分类号】R473【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）16-004-02
睡眠暂停低通气综合征( sleep apnea hypoxia syndrome, SAHS) 是指患者睡眠时上呼吸道反复塌陷阻塞引起的呼吸暂停和低通气现象，表现为睡眠时打鼾、日间嗜睡、睡眠结构改变和睡眠时血氧饱和度下降等，从而累及全身各系统、多脏器，是一种发病率较高的慢性睡眠呼吸疾患，国外有研究显示OSAS在成年人中的发病率为2%-4%，是多种全身疾病的危险因素[1]。正是由于SAHS患者夜间反复呼吸暂停需较长时间才发生各系统并发症，因此在人体进行SAHS发病机制的前瞻性研究存在诸多困难，且临床研究存在干扰因素，导致研究在人体进行有一定的局限性[2]。但目前该病的病因、发病机制尚不十分清楚，因而通过稳定、可靠、可重复的SAHS的动物模型，是深入研究SAHS的发病机制、病理生理改变和并发症的前提与基础。
目前认为生物钟基因(Clock gene )与SAHS发病存在联系，但尚不十分清楚。很多研究证实哺乳动物下丘脑视交叉上部具有特化神经核团视交叉上核(suprachiasmatic nucles, SCN)，是生命活动的时序控制器，可以通过神经递质内分泌和体液途径影响周围器官和组织，控制和调节着睡眠和觉醒、代谢、内分泌、细胞增殖分裂和凋亡，以及免疫等各个层面，使生命活动在时序上协调有序。 CLOCK基因是动物昼夜生物节律(circadian rhythm)的必要调控者，在节律时钟的组织中起着中心作用[1, 3]。因此研究CLOCK基因表达对SAHS大鼠病理生理影响，将有助于深入认识CLOCK基因在SAHS发病机制和睡眠结构紊乱中的作用。
5-羟色胺又称血清素，可加速突触之间的信息传递速度和加强大脑储存信息，与神经精神系统疾病密切相关[4]。鉴于此，本文拟制作SD大鼠SAHS模型，探究SD大鼠SAHS模型视交叉上核CLOCK基因对5-羟色胺的影响。现将结果报告如下。
1资料与方法
1.1实验材料
1.1.1 实验动物
SPF级健康雄性3月龄SD大鼠60只由石河子大学医学院医学实验动物中心提供，体重( 250 ±30) g，许可证号SCXK新2003-0001。自由摄食、饮水、室温维持(25±1)℃，随机分为常氧对照组（24只）和SAHS模型组（24只），制作SD大鼠SAHS模型，根据间歇性缺氧的不同时程，又分为( IH1周、IH2周、IH4周、IH12周)组，每组6 只。
1.1.2 实验试剂
大鼠5-羟色胺ELISA试剂盒由武汉优尔生科技股份有限公司提供；总RNA提取试剂盒由北京TIANGEN生物科技有限公司提供；逆转录试剂盒由美国Thermo公司生产；KAPA SYBR?FAST Real-time PCR Kit由美国KAPA公司生产；无RNase PCR管、8连管由美国Axygen公司生产。全波长紫外-可见光酶标仪为美国BIOTEK synergy2；实时荧光定量PCR仪为ABI-7300。
1.2方法
1.2.1 SAHS模型制作
参照文献中[1]的方法加以改进。低氧动物舱：选用4 mm 厚有机玻璃制成28 cm×15 cm ×15 cm长方体舱，一端取直径为10 cm 的孔，加盖密封，便于缺氧试验过程中取放动物，侧壁中央取直径为5 mm 的孔两个，分别用于输入低氧气体与空气，两侧壁及两端分别取直径为0. 5 mm的小孔一个，用于气体采样及平衡舱内压力。实验过程中舱内CO2 与水蒸气分别用钠石灰与无水氯化钙吸收，缺氧过程中动物活动自由，不进饮食。气体控制通路：设计由单片机程序控制电磁阀开关的电路，分别调节低氧气体与空气的输入； 控制系统一端经高压管接压缩气体钢瓶，一端经普通软管接低氧动物舱。长期间歇性低氧实验：压缩空气与混合气体( 90%N2+ 10% O2 ) 在电磁阀控制下分别以2 Lmin的流速输入低氧舱，间隔30 s，循环1 次min，每天8h ( 8: 00~ 16: 00)，其余时间置大鼠饲养笼，室温、空气、正常饮食，按实验分组分别缺氧1 周、2 周、4 周、12 周，缺氧组实验结束当日取丘脑视上核处脑组织。常氧对照组每日同时置相同规格有机玻璃舱内，空气输入，无缺氧。间歇性缺氧实验过程中舱内混合气体浓度由测氧仪检测，并随机采样送气体成分分析。
1.2.2 ELISA法检测血清中5-羟色胺
根据大鼠5-羟色胺ELISA试剂盒说明书进行测定。
1.2.3 qPCR法检测丘脑视上核处脑组织中的CLOCK基因
引物设计：Clock基因引物正义链为：5’-TCACCACGTTCACTCAGGACA-3’，反义链为：5’-AAGGATTCCCATGGAGCAA-3’，扩增片段长度为375 bp。
总RNA提取根据总RNA提取试剂盒说明书进行操作。
将提取的总RNA根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录合成cDNA第一链。
将逆转录所得的cDNA产物根据KAPA SYBR?FAST Real-time PCR Kit说明书进行加样，在ABI-7300实时荧光定量PCR仪上检测CLOCK基因的mRNA的表达量。
1.3统计学方法
数据采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学处理，两组间计量资料采用均数±标准差（ ±s）表示，采用t检验进行分析，P＜0.05认为有统计学差异。
2结果
2.1 SD大鼠SAHS模型血清中5-羟色胺含量
利用ELISA法测定SD大鼠SAHS模型血清中5-羟色胺含量，结果显示，和常氧对照组相比，SAHS模型组IH1周、IH2周、IH4周、IH12周血清中5-羟色胺含量均显著下降（P＜0.05）；常氧对照组IH1周、IH2周、IH4周、IH12周血清中5-羟色胺含量趋于稳定，SAHS模型组IH1周、IH2周、IH4周血清中5-羟色胺水平随着时间的延伸呈下降趋势，IH12周血清中5-羟色胺水平和IH2周相当。（表1）
备注：同时间点两组间比较，*P＜0.05。和第1周相比，#P＜0.05；和第2周相比，▲P＜0.05；和第4周相比，★P＜0.05。
3讨论
SAHS从多方面影响人们的机体和功能，研究发现SAHS不仅引起睡眠结构紊乱，可以导致躯体免疫功能下降和生长激素分泌减少、炎症反应及氧化应激反应水平增高，故引起多种身心症状和疾病[4~6]。使得个体的警醒状态和神经认知功能受损，导致日间功能损害，如过度疲劳、嗜睡，记忆下降，注意力不集中，思维迟缓，反应时间延长，工作效率下降等。 有报道认为[7]慢性失眠是高血压、冠心病的诱因之一，参与心血管病的病理生理过程，进而又间接影响个体的躯体健康。由此可见失眠对个体的影响是多维的、全方位的。
5-羟色胺是单胺类血管活性物质和神经递质，可在中枢神经系统中形成5-羟色胺神经通路，参与睡眠觉醒周期作用于SAHS的发生发展[8]。本研究结果显示，SAHS模型大鼠血清5-羟色胺水平显著低于常氧对照组，提示，SAHS模型大鼠中5-羟色胺水平被抑制进而影响睡眠和呼吸。
昼夜节律生物钟参与调控机体行为与各项生理功能。昼夜节律的产生依赖于各种生物钟基因的转录-翻译反馈环路。CLOCK基因可以通过调节下游的钟控基因(CCGs)调节多项生理功能。研究表明[9]，昼夜节律生物钟不仅参与生理功能的调节，在多种病理过程中如SAHS、心血管疾病中也发挥了重要的作用。CLOCK基因是内源性分子昼夜节律钟的最重要的基因，编码的蛋白调整昼夜节律[10]。在大鼠CLOCK基因位于染色体5，人类位于染色体4q12，鼠生物钟基因的突变引起睡眠结构及睡眠量的改变。目前CLOCK基因与脑电生理特征关系研究知之甚少，由于临床干扰较多及伦理等因素，使得深入开展研究有一定的困难。本文探讨了SAHS大鼠中CLOCK基因表达，结果显示，SAHS模型大鼠丘脑视上核处脑组织中的CLOCK基因表达水平显著高于常氧组，提示，CLOCK基因可能参与睡眠和呼吸障碍的发生和发展。
综上所述，CLOCK基因可能通过影响5-羟色胺水平进而干预SAHS的发生发展。
参考文献
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论文作者:刘文萍,李静[通讯作者],杨清,彭颜晖,刘丽丹
论文发表刊物:《系统医学》2016年16期
论文发表时间:2017/1/16
标签：羟色胺论文; 基因论文; 睡眠论文; 大鼠论文; 血清论文; 模型论文; 低氧论文; 《系统医学》2016年16期论文;