叶华 郑学宝
（广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室 广东 湛江 524023）
【摘要】 目的：观察半枝莲多糖（SPS）对结肠癌小鼠肿瘤微环境T细胞亚群的影响。方法：建立C26结肠癌小鼠移植瘤模型，SPS作用10天后，测定肿瘤重量，计算抑瘤率，流式细胞术检查肿瘤浸润T淋巴细胞亚群的数量。结果：SPS 明显抑制肿瘤生长，提高CD4+、CD8+淋巴细胞的百分率。结论：SPS的抗肿瘤作用与调节T淋巴细胞亚群有关。
【关键词】 半枝莲多糖；T淋巴细胞亚群；结肠癌
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）17-0185-02
近年来我国结肠癌的发病率和死亡率逐年上升。结肠癌的发生转移与癌细胞所处的内外环境有着密切关系。研究发现，结肠癌微环境中CD4+CD8+淋巴细胞数量减少和比值改变是导致肿瘤细胞逃逸机体免疫监视，造成肿瘤持续生长、转移的原因[1]。本文通过观察半枝莲多糖对C26结肠癌小鼠肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群的影响，从免疫学角度探讨半枝莲多糖（Scutellaria barbata Polysaccharides, SPS）抗肿瘤作用的分子机制。
1.材料和方法
1.1实验材料
BALB/C小鼠，购于广东医学院实验动物中心；C26结肠癌细胞，北京协和医学院药理教研室惠赠；半枝莲多糖，本室自制；5氟尿嘧啶（5-FU），上海旭东海普药业有限公司；RPMI-1640，美国GIBCO公司；CD4、CD8单克隆抗体，美国Biolegend公司。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养
C26为BALB/C鼠源性结肠癌细胞，静置于37℃、5％CO2的培养箱内，用含10％胎牛血清的1640培养基常规培养。
1.2.2模型的制备及分组给药
将对数生长期的C26结肠癌细胞调整密度为1×107/ml，接种于小鼠右侧腋窝皮下，每只小鼠0.2 ml。10d后取瘤组织，剪切成1 mm3左右, 再次接种。如此传3代后,大批接种小鼠腋下。将接种C26细胞24 h后的50只小鼠随机分为模型组，阳性对照5-FU组和SPS低、中、高剂量组。5-FU组腹腔注射5-FU 15mg?kg-1?d-1，SPS低、中、高剂量组分别灌胃SPS 50、100、200 mg?kg-1?d-1，模型组灌胃给予等体积生理盐水，连续给药10 d。
1.2.3抑瘤率的检测
末次给药24 h后，脱颈椎处死小鼠，剥离瘤块并称取瘤重，计算抑瘤率。抑瘤率计算公式为：抑瘤率=(模型组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100%。
1.2.4肿瘤间质淋巴细胞分离
取瘤组织，剪切成1 mm3左右，放置于RPM-1640培养基中，培养基含0.05％胶原酶、0.02％DNA酶、0.01％ 透明质酸酶和10％小牛血清，4℃搅拌过夜，然后用200目钢网过滤，1500 r/min离心15min，Hanks液洗2遍，调整细胞浓度至1×106/ml，获得肿瘤浸润淋巴细胞。
1.2.5肿瘤间质淋巴细胞中CD4+、CD8+检测
试管中加入3×105个细胞，PBS调整体积至100μl，分别加入抗鼠CD4、CD8a单克隆抗体0.25μg、0.2μg，设空白对照管，避光室温孵育30min，PBS液洗涤2次后，加入荧光素标记抗体，流式细胞仪检测。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和Tukey HSD多重比较。
2.结果
2.1 SPS对C26结肠癌小鼠瘤重的影响
SPS能降低C26结肠癌小鼠瘤重，与模型组相比，100、200mg?kg-1?d-1剂量组差异有统计学意义（P<0.01），肿瘤抑制率最高达38.55%。见表1。
2.2 SPS对荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群的影响
与模型组相比，SPS干预后，CD4+T淋巴细胞含量升高，其中100、200 mg?kg-1?d-1剂量组差异均有统计学意义（P<0.01）；CD8+T淋巴细胞含量略有提高，其中200 mg?kg-1?d-1剂量组有显著性差异（P<0.05）。见表2。
3.讨论
大量的研究表明，不少植物多糖类化合物具有改善机体免疫功能、抑制肿瘤生长的作用，而且对正常细胞无毒副作用，受到广泛的关注。半枝莲多糖是从抗肿瘤中药半枝莲中提取分离的活性成分，可抑制HepA、S180、H22荷瘤小鼠肿瘤的生长[2-4]。本研究结果表明，SPS能抑制C26结肠癌小鼠肿瘤生长，50、100和200 mg?kg-1?d-1剂量抑瘤率分别为13.12%、31.57%和38.55%，中、高剂量组与模型组相比有显著性差异。
成熟的T淋巴细胞可分为CD4+和CD8+两个亚群，CD4+是辅助性T细胞分泌大量细胞因子，增强CD8+细胞对肿瘤的杀伤作用，CD8+是细胞毒性和抑制性T细胞，是重要的效应细胞。缺乏CD4+和CD8+T淋巴细胞，以及CD4+/CD8+比值降低会导致抗肿瘤免疫效应低下。给予SPS后，荷瘤小鼠肿瘤间质淋巴细胞中CD4+、CD8+含量显著升高，说明 SPS可以促进肿瘤微环境中CD4+、CD8+T淋巴细胞的增殖与活化，直接杀伤肿瘤细胞，或分泌细胞因子辅助杀伤肿瘤细胞，来发挥抗肿瘤效应，有可能发展SPS成为一种新的抗肿瘤药物。
【参考文献】
[1] Jiang T, Piao D, Zhu A, et al. Changes in T lymphocyte subsets in mice with CT26 colon tumors after treatment with donor lymphocyte infusion. Tumour Biol. 2014, 35(6): 5599-5605.
[2] 马维坤，仰榴青，吴向阳.半枝莲多糖提取工艺及其免疫活性初步研究.江苏大学学报(医学版)，2007，17(4):315-318.
[3] 叶华，崔燎.半枝莲多糖的抗肝癌作用及其机制的研究.癌症进展，2008，7(3): 331-334
[4] 张自丽，张雪薇，宋高臣.半枝莲多糖对S180肉瘤转移抑制作用的研究.牡丹江医学院学报，2013，34(2):25-27.
[5] Rathore AS, Kumar S, Konwar R, et al. CD3+, CD4+ & CD8+ tumour infiltrating lymphocytes (TILs) are predictors of favourable survival outcome in infiltrating ductal carcinoma of breast. Indian J Med Res, 2014, 140(3): 361-369.
基金项目：国家自然科学基金(81173240)；广东省科技计划项目（2009C3104003）；广东医学院项目（Z2013001和B2013019）。
论文作者:叶华,郑学宝
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第17期供稿
论文发表时间:2015/8/10
标签：淋巴细胞论文; 小鼠论文; 肿瘤论文; 多糖论文; 细胞论文; 结肠癌论文; 剂量论文; 《医药前沿》2015年第17期供稿论文;