宗桂珍 李晓蕾
山东省泰安市中心医院 271000
【摘 要】目的 研究蒙古黄芪中的异黄酮类成分及其对成骨细胞增殖、分化的影响，为黄芪抗骨质疏松提供实验依据。方法 利用柱层析法结合现代光谱技术从蒙古黄芪获得单体化合物并进行结构鉴定，采用MTT法观察化合物对成骨细胞增殖的作用，通过测定碱性磷酸酶活性评价化合物对成骨细胞分化的影响。结果 从蒙古黄芪的95%乙醇提取物中获得4个异黄酮类化合物，分别鉴定为芒柄花素（1），毛蕊异黄酮（2），芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷（3），毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（4），所有化合物均能够明显促进成骨细胞增殖及增强碱性磷酸酶活性。结论 从蒙古黄芪中分离得到的异黄酮类成分能够明显促进成骨细胞增殖、分化，为黄芪抗骨质疏松活性提供了依据。
【关键词】蒙古黄芪；异黄酮；成骨细胞增殖；成骨细胞分化
骨质疏松症是一种以骨量减少、骨微细结构被破坏为特征的全身性骨骼疾病，可以造成骨脆性增加，导致骨折危险性增加。骨质疏松症在中老年人特别是绝经期女性中非常普遍，严重威胁中老年人群的健康[1]。骨质疏松症与内分泌、免疫及遗传等多方面因素有关，主要由骨代谢缺陷所致。成骨细胞在骨代谢过程中发挥着重要作用，其增殖与分化（对增加骨量及骨密度）与骨形成密切相关。在成骨细胞分化早期，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALK）表达活跃，其活性可以作为评价成骨细胞分化程度的指标。实验研究表明，中药黄芪（milkvetch root）对骨质疏松症具有明显的治疗作用，特别对成骨细胞体外增殖、分化及成骨能力有一定的调节作用[2]。作为主要化学成分，黄芪总黄酮对维持大鼠雌激素正常分泌、改善维甲酸所致骨质疏松具有一定作用[3]，但对其中的黄酮类单体化合物的活性评价未见文献报道。本研究拟对黄芪的主要来源之一蒙古黄芪（Astragalus mongholicus Bunge）中异黄酮类成分进行分离鉴定，并通过MTT法及碱性磷酸酶活性检测来评价所得化合物对成骨细胞的增殖、分化的影响，为黄芪治疗骨质疏松提供依据。
1 仪器与材料
1.1药材
蒙古黄芪（Astragalus mongholicus Bunge）。
1.2试剂材料
柱层析硅胶，Sephadex LH-20，DMEM，新生牛血清，胰蛋白酶，MTT，I型胶原酶，碱性磷酸酶（ALP）测定试剂盒，所有试剂均为分析纯。
1.3仪器设备
XYJ-1450D 医用净化工作台，CO2培养箱，倒置显微镜，酶标仪，400M核磁共振波谱仪，1260UPLC-6460MS液质联用仪。
2 方法
2.1提取分离
干燥蒙古黄芪药材5.0 Kg，经粉碎后95%乙醇10 L热回流提取三次，每次4 h，经减压浓缩的浸膏210 g，浸膏用2 L蒸馏水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯各2 L萃取3次，萃取液减压浓缩得石油醚、乙酸乙酯浸膏，乙酸乙酯浸膏50 g经反复硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，结合Sephadex LH-20凝胶层析，得到化合物1（80 mg），2（120 mg），3（45 mg），4（35 mg）。
2.2成骨细胞的培养
取48 h内新生大鼠用75%乙醇消毒后置培养皿中，无菌条件下揭去头顶皮肤，取下颅骨，置PBS缓冲液内。清除骨膜、血管等结缔组织，PBS液清洗3次后将颅骨剪成约1 mm2的小块。再次用PBS液清洗3次后将骨片移入5 mL 0.25%胰蛋白酶内，37 °C预消化30 min，弃去消化液。将骨片移入5 mL 0.1%I型胶原酶中，37 °C消化60 min。将用120目筛网过滤后的消化液移人离心管中，1000 r/min离心10 min。弃去上清液，加入适量含10%新生牛血清的DMEM培养液使细胞混悬，用计数板调整细胞浓度5 × 105个/mL，接种到培养瓶中，放入37 °C 5%CO2培养箱中培养。
2.3成骨细胞增殖的检测
精密称取化合物1~4，分别用DMSO溶解后加含10%血清的DMEM培养液稀释成1 μg/mL，10 μg/mL和100 μg/mL，空白对照组仅在培养液中加入相同体积DMSO。选择对数生长期中生长旺盛的第3代细胞，细胞调整为5×104个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h后弃去原培养液，换无血清培养液，饥饿细胞24 h，使细胞周期同步化，弃去无血清培养液，向96孔板中加入各含药培养液，以含10%新生牛血清的培养液为对照，每药重复5个孔，每孔100 μL，继续培养48 h，弃去培养液，加入5 mg/mL的MTT溶液50 μL，培养4 h后，弃去上清液，加入15 μLDMSO，振摇10 min使结晶充分溶解，用酶标仪在492 nm处，测定吸光度值。
2.4碱性磷酸酶活性测定
吸取2.3项下培养48 h后的含药培养液，按照试剂盒操作方法，显色后在波长405 nm用酶标仪测定各孔吸光度值，同时，以对硝基苯酚溶液为标准品工作液，测定405 nm下吸光度值，计算碱性磷酸酶浓度。
3 结果
3.1化合物结构鉴定
经1H 和13C NMR及MS分析，并与文献报道数据[4，5]比较，可以确定化合物1为芒柄花素，化合物2为毛蕊异黄酮，化合物3为芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷，化合物4为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。
3.2成骨细胞增殖测定结果
4种化合物对成骨细胞增殖的影响结果见图1，与对照组相比，4种化合物在1 μg/mL，10 μg/mL和100 μg/mL浓度下对成骨细胞的增殖均有明显的促进作用，在1 μg/mL浓度下异黄酮苷3和4的活性略强于苷元1和2，在10 μg/mL时4种化合物均有促进增殖作用，同10 μg/mL浓度比较，在100 μg/mL时化合物1~4的活性变化不大，3和4的活性略有增加。
4 讨论
同大鼠切除卵巢致骨质疏松模型相比，成骨细胞模型具有方便快捷、用药量少、周期短的特点，更适合进行中药活性成分的初步活性筛选，而前者更适合于药效学评价。本实验采用传统的中药化学手段分离鉴定了蒙古黄芪的主要化学成分，利用成骨细胞体外培养模型，通过MTT法及碱性磷酸酶活性检测，对其主要化学成分对成骨细胞增殖、分化的影响进行了初步的评价。实验结果表明，蒙古黄芪中的主要异黄酮类成分对成骨细胞的增殖存在促进作用，进一步验证了文献报道吡喃酮类化合物对成骨细胞增殖具有促进作用[6]。碱性磷酸酶在成骨细胞分化过程中发挥着重要作用，其活性反映了成骨细胞的分化程度，可以作为评价成骨细胞分化的指标。实验表明，蒙古黄芪中的主要异黄酮类成分能够使成骨细胞培养液中碱性磷酸酶的活性增加，并且与药物浓度存在一定的相关性，低浓度下促进成骨细胞的早期分化，同低浓度比较，高浓度药物则对碱性磷酸酶的分泌有一定抑制作用。上述结果为中药黄芪治疗骨质疏松提供了一定的实验依据。
参考文献：
[1]赵海勇，田发明，刘家寅，等.骨质疏松症的药物治疗进展[J].山东医药，53（31）：95-97.
[2]韩秀文，王进.黄芪治疗骨质疏松症的实验研究进展[J].中外医学研究，2011，9（8）：120-121.
[3]张亚洲，徐风，梁静，等.蒙古黄芪中异黄酮类化学成分研究[J].中国中药杂志，2012，37（21）：3243-3248.
[4]于海涛，李慧，章琪，等.狗脊炮制品中促进成骨细胞增殖分化成分的筛选[J].中成药，2012，34（6）：1139-1142.
论文作者:宗桂珍,李晓蕾
论文发表刊物:《航空军医》2015年第2期供稿
论文发表时间:2015/9/22
标签：细胞论文; 黄芪论文; 异黄酮论文; 蒙古论文; 化合物论文; 培养液论文; 磷酸酶论文; 《航空军医》2015年第2期供稿论文;