湖南省耒阳市人民医院 湖南衡阳 421800
摘要：目的 研究神经内科癫痫病的临床发病机制。方法 选择10只SD新生鼠海马组织为研究对象，构建新生鼠癫痫模型，测量不同浓度Munc-18抗体作用20小时或40小时对神经细胞的损害情况。结果 与正常对照组比较，×200、×400 Munc-18抗体（20及40小时）LDH释放量、凋亡指数明显更高，差异有统计学意义，P＜0.05。另外×1000Munc-18抗体凋亡指数明显高于对照组，P＜0.05。结论 Munc-18蛋白可能是通过激活天冬氨酸、GluR3等导致机体钙离子、钠离子内流，钾离子外流，进而产生毒性达到损害神经元的目的，最终引发癫痫疾病。另外Munc-18蛋白抗体自身的细胞毒性作用可能导致神经元凋亡。。
关键词：Munc-18蛋白；癫痫性脑病；发病机制；作用
近年来相关研究表明Munc-18蛋白（神经突触前膜胞内蛋白）在神经递质中起一定的作用，且利用血浆置换方式降低患者体内Munc-18抗体浓度后，患者癫痫发作次数较之前明显减少[1-2]。本研究就此通过构建新生鼠海马癫痫性脑病模型探讨Munc-18蛋白在婴儿癫痫性脑病发病机制中的作用，报告如下。
1 资料与方法
1.1 材料与试剂 选择10只SD新生鼠为研究对象，出生时间在1天至3天之间，平均（1.5±0.5）天，体重在4克至8克，平均（5.4±0.3）克。仪器设备：包括恒温培养箱、自动干热消毒柜、显微镜、细胞培养瓶、外科手术器材等。主要试剂：Munc-18抗体、乳酸脱氢酶试剂、二甲亚砜等。严格按照仪器设备及试剂使用说明书操作。
1.2 方法（1）海马神经细胞培养。将10只SD新生鼠用酒精（浓度75%）浸泡2至3分钟消毒后取脑，无菌操作。利用外科手术器材把海马皮层有效分离后将其放置到解剖液中，显微镜下把大血管、脑膜去掉，将剩余的剪成0.5立方毫米的小块，随后利用胰酶（浓度0.125%，温度27摄氏度）消化25分钟左右，接着用DMEM种植液（含有20%小牛血清）终止消化。经相应处理后利用不锈钢滤网将其制作成细胞悬液，然后再次利用DMEM种植液将其浓度调整为1×106·ml-1，并将其接种到之间准备的96孔培养板（上面涂有0.1mg·ml-1的多聚左旋赖氨酸）上，1个孔100微升，接着将培养板放在培养箱中培养（温度37摄氏度、二氧化碳浓度5%），24小时后利用Neurobasal/B27培养液代替DMEM种植液，共培养1个星期[3-4]。（2）把培养后的海马细胞抽签分为两组，均滴入不同浓度（稀释×200，×400，×1000）的Munc-18抗体与同容积的培养液，A组Munc-18抗体作用20小时，B组Munc-18蛋白作用40小时。两组均行细胞存活率、LDH释放量、TUNEL染色等测定。（3）相关指标测定。①细胞存活率。Munc-18抗体作用后，停止培养前4小时在96孔培养板中加入MTT磷酸缓冲液（10微升，浓度为每毫升0.5毫克），让其在培养箱中继续培养。4小时后把上清液去掉，放入二甲亚砜（200微升）停止反应。利用酶标仪测定出光密度，波长570纳米。细胞存活率为孔中光密度与对照组光密度比值[5-6]。②TUNEL染色。把培养后的细胞悬液连接到12孔培养板中，每个孔中加入500微升的培养液，方法同海马神经细胞培养过程。Munc-18蛋白作用后进行染色，根据试剂盒使用说明书执行。随后用显微镜观察细胞是否凋亡：神经元核呈现棕褐色，核周染色质为月牙状或块状，提示细胞凋亡。
1.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计学软件对上述数据进行分析，计量资料均数±标准差表示，t检验，P＜0.05时差异有统计学意义。
2 结果
不同浓度Munc-18抗体作用20小时/40小时对神经细胞的损害情况具体情况见表1、表2。与正常对照组比较，×200、×400 Munc-18抗体（20及40小时）LDH释放量、凋亡指数明显更高，差异有统计学意义，P＜0.05。另外×1000Munc-18抗体凋亡指数明显高于对照组，P＜0.05。
3 讨论
婴儿癫痫病脑病具有发病年龄小、预后差等特点，主要表现为阵挛、精神运动障碍（语言障碍、肢体偏瘫等），严重影响婴儿的正常发育[7]。目前临床上婴儿癫痫病脑病发病机制尚不明确，但很多学者认为与癫痫家族史、孕妇妊娠严重中毒、神经递质、免疫系统异常等有关[8-9]。相关研究表明长时间癫痫发作可能破坏婴儿血脑屏障，导致婴儿中枢神经系统中的部分组织成为异种抗原体，通过免疫反应产生自身抗体[10]。由于神经细胞损伤主要由坏死或凋亡引起，Smeyne等人研究表现癫痫大鼠海马中CA3等部位存在神经元凋亡现象，表明癫痫发作和神经细胞凋亡相关[11]。Munc-18蛋白作为仅存在中枢神经系统的Secl蛋白家族的一员，包括594个氨基酸，在神经突触囊泡分泌释放神经递质中起十分重要的作用，Munc-18蛋白的表达在很大程度上影响神经递质的释放，若Munc-18蛋白发生异常，则会导致神经递质分泌失常，致使小鼠胚胎神经细胞凋亡[12]。
本研究×200、×400Munc-18抗体作用20小时、40小时后LDH释放量、凋亡指数均明显高于正常对照组，另外×1000 Munc-18抗体作用20、40小时后凋亡指数明显高于正常对照组，P＜0.05。可见Munc-18蛋白对神经细胞具有一定的损害作用，它可能是通过激活天冬氨酸、GluR3等导致机体钙离子、钠离子内流，钾离子外流，进而产生毒性达到损害神经元的目的，最终引发癫痫疾病。另外Munc-18蛋白抗体自身的细胞毒性作用可能导致神经元凋亡。
综上所述，Munc-18蛋白参与婴儿癫痫性脑病发病，其主要机制可能是通过损害神经元达到引发癫痫的目的。
参考文献：
[1]陈功，江澄川，杨茹.Munc18抗体致痫机制的体外实验研究：诱导海马神经细胞的损伤[J].中华神经外科疾病研究杂志，2007（06）：491-495.
[2]王翠翠，陈英辉，肖霞，等.Pannexin 1在癫癎发病机制中的作用研究进展[J].中国临床神经科学，2011（06）：652-656.
[3]万萍.神经元内Munc-18蛋白的漏出及其在神经元表面的分布[D].复旦大学，2008.
[4]张彦平.癫痫对海马内Munc-18蛋白分布和表达的影响[D].复旦大学，2009.
[5]李炳.Munc18蛋白的自身免疫与癫痫发作的相关研究[D].广西医科大学，2006.
论文作者:罗威
论文发表刊物:《健康世界》2014年21期供稿
论文发表时间:2016/3/28
标签：抗体论文; 癫痫论文; 蛋白论文; 神经元论文; 作用论文; 凋亡论文; 神经细胞论文; 《健康世界》2014年21期供稿论文;