孟岩[1]2001年在《抗真菌病基因对葡萄植物遗传转化的研究》文中认为葡萄生产一直是我国农业生产的一个重要的组成部分。近年来我国的葡萄栽培面积迅速扩大，葡萄生产发展迅速但病虫害种类也随之增多，尤其是真菌病害发病十分严重。植物基因工程近些年来发展迅速，利用基因工程技术培育抗病虫害作物新品种已成为作物育种的一个有效手段。葡萄遗传转化中已有许多可以利用的目的基因，但对葡萄进行遗传转化较困难，主要存在以下问题： 1．葡萄再生频率低是造成葡萄遗传转化困难的关键所在，器官发生易产生嵌合体，胚状体诱导不仅过程繁琐、漫长、诱导率低，而且受基因型的限制，仅少部分葡萄品种能产生体细胞胚。 2．对葡萄进行遗传转化较困难，迄今为止在葡萄中仅获得了较少的转基因植株，且导入的基因多为报告基因。 3．共培养及共培养后受体材料容易产生坏死，因此限制了农杆菌法转化的进行。 4．在筛选过程中，用卡那霉素对葡萄组织筛选选择效果不佳。 本研究针对葡萄遗传转化中存在的上述问题进行研究，采用欧洲种葡萄Semillion作为试材，建立其高效植株再生体系，并采用农杆菌介导法及基因枪法进行抗真菌病基因的遗传转移，探讨影响基因转移效率的主要因子，优化遗传转化条件，得到PCR检测阳性植株，为从根本上解决真菌病害，得到葡萄抗真菌病的转基因植株奠定了坚实的基础。本研究主要内容如下： 1．建立了体细胞胚胎发生途径植株再生体系。利用欧洲种葡萄Semillion的胚性愈伤组织，诱导体细胞胚胎发生，综合考虑叁方面因素——体细胞胚萌发率、萌发的幼苗中完整植株的比率及畸形苗比率，将Nitsch+BA0.2mg／L+NAA0.02mg／L确立为最适合体细胞胚萌发培养基。生根培养基确立为附加0.04mg/LNAA的Nitsch培养基。 2．建立了悬浮培养体系。胚性细胞团悬浮培养最适培养基为ND培养基，在继代后4天将细胞团经孔径1mm的钢质筛网多次过滤处理，可以使体细胞胚胎发生的整齐度大大增强。经过筛处理的细胞团，在Nitsch培养基中培养5周后子叶型胚的比率可以高达92.1％，而且再生苗的畸形苗的百分率下降至38.5％。再生阶段最适培养基为附加1g／L活性炭的Nitsch培养基，活性炭的添加对减少畸形苗的发生是有利的。 3．绘制了胚性悬浮培养细胞生长曲线，曲线呈S型，悬浮培养细胞从第4天开始进入快速生长期，到第10天左右生长逐渐减慢，进入停滞期。由此可以选择细胞生长最佳时期进行遗传转化，这将有助于转化率的提高。 4．确立了适合于葡萄转化体筛选的抗生素的种类及浓度：在卡那霉素、G418、新霉素叁种氨基葡糖苷类抗生素中，新霉素筛选效果最佳。培养5周后的细胞团在80mg/L的新霉素的选择压力下增殖为0，在此基础上进一步确立最佳筛选方式：在转化后用含盂岩 摘 要．221年11月80mg／L新霉素的固体培养基筛选或在将新霉素浓度由 30mg／L－50mg／L—S0mg／L逐步提高的固体或液体培养基均可得到较好的筛选效栗。 5．探讨了影响遗传转化效率主要因素。 a．研究了不同菌株对转化的影响，通过调查抗性芽产生效率确立对葡萄材料侵染能力强的菌株类型和对之敏感的受体材料类型。结果是 EHA 05的侵染能力显着高于LBA4404。胚性愈伤较胚性培养细胞更为敏感。 b．通过对影晌转化的几个主要因子的正交试验，并对正交试验结果进行分析，确定当试验组合为试验材料为大细胞团、菌液OD。＝0．6、共培养4天、共培养培养基pHS．2时为最优试验组合。这正好和本试验中试验5的结果相吻合。通过极差分析，确立各因素的主次颇序为：共培养培养基叫值＞植物材料＞菌液浓度＞共培养时间。本试验中最主要的影响因素是共培养培养基pH值。 C研究酚类化合物对转化的影响，共采用了 5种酚类化合物，叁种浓度（stheg／l。100mg／l、150mg／l）处理葡萄胚性愈伤组织，以每 50mg愈伤组织经 GUS色后所产生的蓝点数作为遗传转化效宰的指标，试验结果表明，乙酝丁香酮的效果远远好于其他处理，差异显着性达极显着水平。 d．研究负压处理对转化的影响，研究发现，对于某一特定植物材料来讲，农杆菌侵染时采用不同的真空强度处理不同时间，对GUS瞬间表达率会产生不同的影响。其中，对于胚性愈伤来讲，采用0刀6M邯处理15分钟，＊＊s瞬间表达率显着高于对照：对于悬浮培养细胞而言，采用0．06／Mpe处理5分钟，GUS瞬间表达率显着高于对照。除此之外，其它处理下的GUS瞬间表达率均显着低于对照。 6．对防止共培养及共培养后愈伤组织褐化问题进行研究，发现不同转化过程对愈伤褐化的影响极大，在转化时将二次活化菌液离心后去上清，侵染时用YEB培养基重悬并稀释一定倍数，侵染后转人共培养培养基中共培养。愈伤共培养后在除菌用液体培养基中先振荡培养30分钟，静置后用移液器吸去上清，再用液体除菌培养基洗涤，用无菌滤纸吸于后在固体除菌培养基中继续培养，可以使愈伤褐化率降至0。另外，采用聚乙烯毗咯烷酮（PVP）等5种抗氧化剂，考查不同抗氧化剂对减轻愈伤侵染后褐化的作用。发现除PVP对减轻褐化效果不显着外，其它抗氧化剂均对褐化?
李海燕[2]2002年在《双价抗真菌病基因对大豆遗传转化的研究》文中研究指明大豆是重要的粮食和油料作物，但容易受多种真菌病的危害，导致大豆的产量和品质下降。由于传统的抗病途径存在诸多缺点，并不是理想的防治措施，而利用基因工程技术可望为大豆育种及品质改良开辟一条新途径。但大豆抗真菌病基因遗传转化中仍存在单个抗病基因的抑菌谱窄、缺乏合适的再生体系和遗传转化效率低等问题。 针对以上问题，本研究选用东北地区4个主栽大豆品种为试材，通过基因工程手段，构建带有菜豆几丁质酶基因(chi)和大麦核糖体失活蛋白基因(rip)的植物表达载体，利用农杆菌介导法和基因枪法，首次将两个抗真菌病基因同时导入大豆。并系统优化植株再生和遗传转化条件，建立了高效的植株再生和遗传转化体系，获得同时整合两个抗真菌病基因的转基因大豆：本研究为大豆以及其它豆科植物抗病分子育种奠定基础，并为有性杂交育种提供基因资源。主要研究结果如下： 1．构建了抗真菌病基因植物表达载体 a 共构建5个载体，包括1个中间克隆载体pURO1、1个中间表达载体pARIP、2个单基因植物表达载体pBIRIP和pBchE、1个双价基因植物表达载体pBRC。 b．pBRC含有chi基因和rip基因，其联合表达有望扩大植物抗菌谱。 c．pARIP带有rip基因，与含有NPTⅡ和chi基因的pBch作为基因枪转化材料。 d．pBIRIP和pBchE都含有各自的抗真菌病基因和NPTⅡ选择标记基因，pBIRIP还含有Gus基因，均可作为抗真菌病遗传转化研究的目的基因材料。 二．改造了启动子 将pARIP、pBIRIP、pBchE和pBRC中的目的基因启动子均改造成双35S启动子，可显着增强目的基因在双子叶植物中的表达效率。 3．建立了大豆子叶节器官发生再生系统 a．最佳丛生芽分化培养基为MSB+1.5mg／LBA+0.2mg／LIBA，0.8％琼脂粉，pH5.8。 b．不同基因型的丛生芽分化率和每个外植体出芽数不同。在供试的4个大豆基因型中，黑农35、合丰35、东农42和吉林30的丛生芽分化率分别为98.5％、99.3％、73.4％和40.6％，每个外植体平均出芽数为4.9、5.0、3.0和3.0。黑农35和合丰35是子叶节发生途径的高效再生基因型。 c．最佳丛生芽生根培养基为1／2MSB+1.5mg／LIBA+2％蔗糖，0.8％琼脂粉，pH5.8。 d．基因型之间有生根率和启动时间上的差异。合丰35生根率最高，为95.1％，启动时间最短，为2天；黑农35、东农42和吉林30次之，生根率分别为62.2％、 博士学位论文 摘 要 芋海燕 60．8O和79．80，启动时间分别为4、4和3天。4．建立了大豆幼胚子叶体细胞胚发生再生系统 。用正交试验探讨氮源、生长素和蔗糖对体细胞胚诱导的影响。结果表明，最佳 体细胞胚诱导培养基为MSB＋40rngh 2，4LH6％蔗糖，08％琼脂粉，pHS．8 此时，体细胞胚诱导率和诱导效率最高，分别达49％和2．94％。蔗糖浓度是影 响体细胞胚诱导的首要因素，其次是生长素浓度，而有机氮素不是大豆体细胞 胚诱导所必需的。2，4－D的诱导效果好于NAA。 b 首次证明，高pH值与接种前的低温预处理可显着提高大豆体细胞胚诱导效军。 经4℃预处理、在pH70的培养基上获得的诱导效率最高，为4460／／0，与…．8。 不进行低温处理的结果（29％）差异极显着。这一结果将对大豆幼胚子叶体绍 胞胚发生影响因素的研究有重大参考价值c C 低温预处理的最适时间因基因型不同而有所差异．合丰35、黑农35为二大． 吉林30为1天，东农42为3天，其变动幅度为l～3天。 d 最佳体细胞胚成熟培养基为MSBed％蔗糖十0．3％活性炭，0．8％琼B旨扮，pHS．8。 此时，胚成熟宰最高，达87．5％c活性炭可减少畸形胚比率，提高胚成熟氧 e 干燥处理能显着提高子叶形胚萌发率c采用滤纸干燥法，在幻％相对湿度V失 水 72h，当鲜重损失率达 50o时，体细胞胚萌发率最高，为 92．10。5．忧化了农杆菌介导的子叶节遗传转化体系 a 首次构建并利用双价抗真菌病基因植物表达载体进行大豆子叶节遗传转化c b．合丰35是农杆菌转化理想的植物材料，其抗性芽率最高，为40．3％，显着高于 其它基因型。 c 正交试验结果表明，农杆菌介导转化的较优组合为：侵染时在0．06Mpa真空强 度下负压处理5分钟。共培养3天、预培养1天、共培养培养基的叫二，此 时抗性芽率最高，为55．8％c各因素影响的主次顺序为：共培养pH值＞负压处 理时间＞共培养时间＞预培养时间c d．丛生芽分化阶段卡那霉素的筛选压力确定为 130mg／Lc丛生芽生根阶段卡那霉 素的筛选压力确定为：黑农35、东农42和吉林30为lop，合丰35为15mgh。 e．采取分步筛选法，即在丛生芽分化和生根阶段都进行筛选。而在分化阶段，采 用延迟选择法，即共培养一周后再筛选，效果好于传统的一步筛选法。6．优化了基因枪法对幼胚子叶的遗传转化体系 a－ 首次将携带不同抗真菌病基因的两个质粒馄合轰击大豆幼胚子叶诱导的初生 胚
石玉[3]2011年在《抗真菌病基因转化苹果和番茄的研究》文中提出抗真菌病害的改良是苹果和番茄育种的目标之一,利用基因工程技术将外源抗真菌病基因导入苹果和番茄中,一旦证实其对病原真菌具有抗性,可作为抗病育种的材料或者抗病品种加以应用。本研究以‘嘎拉’苹果无菌组培苗和‘中蔬四号’番茄无菌组培苗为材料,利用根癌农杆菌介导法,进行了抗病基因PGIP及几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶二价基因的遗传转化。主要研究结果如下:构建了富士苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的植物表达载体pWR306-PGIP,导入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化苹果和番茄,获得了5个PCR鉴定为阳性的苹果抗性芽;8株PCR鉴定为阳性的番茄植株;利用根癌农杆菌介导法将几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶二价基因转入苹果和番茄中,经过PCR鉴定后初步确定4个苹果抗性芽为阳性植株;9株番茄抗性植株为阳性植株。对转基因植株中的目标酶活进行测定,首先进行了酶活测定条件的优化,试验结果表明:几丁质酶反应的最适温度和最适pH值分别为40℃和5.0;最适的反应时间和显色时间分别为60 min和15 min;β-1,3-葡聚糖酶反应的最适温度为50℃;最适pH值为4.5和8.5两个;最适的反应时间和显色时间分别为30 min和20 min。然后测定了目的基因编码的酶活性,试验结果表明转基因植株几丁质酶活性和β-1,3-葡聚糖酶活性比对照植株酶活性均有提高,提高的幅度在7.27%~127.27%和37.63%~279.64%之间。对转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶二价基因阳性番茄植株进行离体抑菌试验,转基因植株几丁质酶粗酶液对苹果斑点病和葡萄炭疽病抑菌率比对照分别提高50%和49.8%,转基因植株β-1,3-葡聚糖酶粗酶液对苹果斑点病和葡萄炭疽病抑菌率比对照分别提高50%和33.3%,转基因植株几丁质酶粗酶液和β-1,3-葡聚糖酶粗酶液的混合液对苹果斑点病和葡萄炭疽病的抑菌率比对照均提高66.6%。对转PGIP基因PCR鉴定为阳性的番茄植株进行病原菌PG酶活抑制试验,转基因植株PGIP粗蛋白液对日本曲霉PG酶的抑制率比对照提高45%。
贾之春[4]2011年在《外源抗病基因和单宁代谢合成关键酶基因LAR3在毛白杨中协同抗病机理研究》文中研究说明毛白杨系我国重要的民用和工业用材。随着其大面积的栽培,各种病害日益严重。单纯依靠常规育种和喷洒化学农药的方法不能有效地解决杨树病害的问题。因此,利用植物基因工程技术培育毛白杨抗病新品种已成当务之急。在已利用的抗真菌基因中,几丁质酶和阳离子抗菌肽显示出了一定的优势。本研究将益母草脂质转移蛋白基因LJAMP2以及球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchitl分别转入毛白杨,获得转基因植株,抗病实验显示其对真菌病具有良好的抗病效果。研究内容如下1、根癌农杆菌介导的LJAMP2、Bbchitl基因对毛白杨遗传转化及分子检测以毛白杨为转基因受体材料,利用根癌农杆菌介导法转化来源于益母草的阳离子抗菌肽基因LJAMP2和球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchit1。经卡拉霉素筛选,分别获得大量抗性植株。GUS组织染色和PCR检测15株转LJAMP2植株、16株转Bbchitl抗性植株,均呈阳性,初步证明外源目的基因都已整合到毛白杨的基因组中。RT-PCR证实LJAMP2和Bbchit1基因在转基因植株中均能大量表达。2、转LJAMP2基因毛白杨抗病性检测离体抗病性试验表明,转LJAMP2基因毛白杨细胞粗提液对四种病原真菌(黑斑病菌、炭疽病菌、烂皮病菌、溃疡病菌)的抑菌能力明显强于非转基因植株。进一步将黑斑病菌、炭疽病菌接种在转基因和野生型毛白杨叶片上培养,发现野生型和转空载体pBI121植株感病快且面积大；而转LJAMP2基因植株仅部分叶片少面积感病。茎段上分别接种烂皮病菌、溃疡病菌,保湿培养30 d后,发现非转基因毛白杨发病严重,茎段出现明显的腐烂症状,多数植株最终枯死。而转LJAMP2基因株系表现出高抗,叶片枯斑很少,茎段感病症状显着缓解,植株整体生长情况良好。上述抗性试验结果表明,在毛白杨中超量表达LJAMP2基因能显着提高其对四种病原真菌的抗病性。3、转Bbchit1基因毛白杨抗病性检测对转Bbchit1基因毛白杨进行离体及活体抗病性试验,结果表明其对炭疽病、烂皮病、溃疡病的抗病效果与转LJAMP2基因毛白杨相似,但对黑斑病的抑制效果优于转LJAMP2基因毛白杨。前人研究表明,植物中类黄酮(尤其是单宁)可有效防御病害的威胁。在杨树中,本研究从分子水平分析发现,类黄酮合成途径中绝大部分功能基因在遭受病害后转录水平均明显增加,特别是单宁合成途径中关键酶基因表达丰度增加尤为明显。在前期工作中,本实验室已成功克隆杨树单宁代谢途径中关键酶基因LAR3,将该基因导入毛白杨,其表达量显着增加,单宁的合成量提高,转基因杨树对黑斑病的抗性明显增强。本研究进一步将球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchitl通过二次转化转入LAR3超量表达毛白杨中,获得LAR3和Bbchitl共表达转基因毛白杨,研究其协同抗病作用,期望为培育抗病杨树品种打下基础。研究内容如下：1、根癌农杆菌介导的Bbchitl基因对超量表达LAR3毛白杨二次转化及分子检测以超量表达LAR3毛白杨为转基因受体材料,利用根癌农杆菌介导法转化来源于球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchitl。经卡拉霉素筛选,获得大量抗性植株。GUS组织染色和PCR检测得到8株LAR3和Bbchitl共表达转基因毛白杨,初步证明外源目的基因都已整合到毛白杨的基因组中。RT-PCR证实LAR3和Bbchitl基因在转基因植株中均能大量表达。2、LAR3和Bbchitl共表达转基因毛白杨的抗病分析将黑斑病菌接种到PDA培养基上培养2 d,结果发现,在含野生型植株细胞粗提液的PDA培养基上,菌圈的直径较大,而在含转基因植株细胞粗提液的培养基上菌圈直径明显减小,其中LAR3和Bbchitl共表达转基因毛白杨抑菌效果最为明显。进一步对转基因毛白杨进行活体抗病效果分析,分别在各植株叶片上接种黑斑病菌,放于室外保湿培养,发现野生型和转空载体pBI121植株感病快且面积大；而超量表达LAR3毛白杨和转Bbchitl基因植株仅部分叶片小面积感病,LAR3和Bbchitl共表达转基因毛白杨仅接种菌块处感病。表明LAR3和Bbchitl基因可在毛白杨中协同抗真菌病。3、转基因毛白杨中总黄酮及单宁含量的测定为了进一步验证黄酮类化合物与抗病性相关,黑斑病处理12 d前后,分别测定各株系总黄酮及单宁含量,结果发现：在处理前,LAR3和Bbchitl共表达转基因毛白杨具有较高的总黄酮和单宁含量,超量表达LAR3株系次之,再次是转Bbchitl基因毛白杨,野生型和空载体pBI121植株总黄酮和单宁含量相对较低；病害处理后,总黄酮及单宁含量均不同程度增加。上述结果表明总黄酮及单宁含量与抗病性呈正相关。
白婧[5]2008年在《农杆菌介导β-1，3-葡聚糖酶（BG2）基因转化南瓜的研究》文中指出南瓜营养丰富、用途广泛,具有较高的食用价值和经济价值。黑龙江省籽用南瓜栽培面积年达到300万亩,是国内外重要的籽用南瓜产区。南瓜籽也是黑龙江省农产品出口创汇产品之一。南瓜真菌病害的危害极大降低了南瓜的产量和品质。南瓜疫病造成死秧烂瓜,个别多雨年份病害大流行可造成局部地区绝产。南瓜白粉病造成植株早衰而降低产量和影响籽粒饱满度。常规抗病育种方法在南瓜的品种改良、选育等方面发挥了重要作用,但存在选育年限长、耗资大、效率低及抗性种质资源匮乏等问题。近年来以导入目的基因创造新种质的基因工程手段的应用,为南瓜抗真菌病育种的选育开辟了一条新途径。本试验以金辉一号南瓜为试材,建立了南瓜高频再生体系,通过农杆菌介导将抗真菌病基因β-1,3-葡聚糖酶(BG2)基因导入金辉一号南瓜中,并探讨了影响其再生体系和遗传转化效率的主要因素,确定了金辉一号南瓜最佳再生和遗传转化条件,为培育南瓜抗真菌病新品种奠定了基础。研究的主要内容和结果如下:(1)建立了金辉一号南瓜再生体系:最佳无菌苗萌发培养基为0.8%琼脂,接种方式为平放;最佳外植体来源为“两片子叶呈直立状态,颜色为绿色”的无菌苗;最佳外植体为1/2子叶节;最佳不定芽分化培养基为MS+1.0mg/L 6-BA,芽伸长培养基为MS+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L GA3;最佳生根培养基为MS+0.1mg/L NAA。(2)确定了抗生素筛选浓度:载体上含有NPTⅡ选择标记基因,使转化植株带有卡那霉素抗性,本试验进行两次筛选,确定芽分化阶段卡那霉素筛选浓度为100mg/L。(3)确定了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、AS添加浓度五个因素对遗传转化的影响:最佳组合为:预培养36h+OD600(0.3~0.5)侵染10min+共培养2d(培养基中添加100 mg/LAS)(4)对得到的抗性植株进行PCR检测和Southern杂交检测,获得5株阳性植株。
方莉[6]2006年在《中国野生葡萄醛脱氢酶基因转化欧洲无核葡萄的研究》文中研究指明本研究以“红宝石无核”、“长穗无核白”和“红脸无核”为材料,从器官发生途径和胚状体发生途径建立无核葡萄遗传转化的受体系统,将连接在表达载体pWR306的中国野生葡萄醛脱氢酶相关基因(ALDH)导入农杆菌中,进行农杆菌介导的葡萄遗传转化体系及转基因葡萄检测的研究,取得的主要结果如下:1.以“红宝石无核”和“长穗无核白”葡萄的试管苗叶片、叶柄及茎段为材料,研究不同植物生长调节剂对两个葡萄品种叶片、叶柄和茎段不定芽再生的影响。结果表明,诱导“红宝石无核”叶片不定芽再生的最佳培养基为MS+TDZ 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L,再生率为33.33%;“长穗无核白”叶片、叶柄不定芽再生的最佳培养基均为MS+BAP 5.0mg/L+NAA 0.5mg/L,再生率分别为25%和30.01%;“红宝石无核”的叶柄不定芽再生率远远低于其叶片。“红宝石无核”和“长穗无核白”茎段不定芽再生率都较低,最高分别为5.22%和2.78%。不定芽伸长的最佳培养基为1/2MS+BAP 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L。再生植株的生根培养基为1/2MS+IBA 0.2mg/L。2.以“红脸无核”花药、子房为材料,研究胚状体发生途径的再生。结果表明:花药胚性愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+BAP 0.5mg/L+ 2,4-D 0.5mg/L,诱导率为60%;子房胚性愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+BAP 1.0mg/L+ 2,4-D 1.0mg/L,诱导率为25%。胚性愈伤组织接种在不含2,4-D的原培养基上诱导出胚状体,花药胚状体的诱导率为84.67%,子房胚状体的诱导率为41.67%。无激素的MS培养基是胚状体增殖和萌发的培养基;最佳的成苗培养基为WPM+IBA 0.1mg/L+蔗糖15g/L,成苗率为64.0%。3.含醛脱氢酶相关基因(ALDH)的农杆菌GV3101作为转化侵染菌液。通过器官发生途径和胚状体发生途径,获得抗性再生葡萄植株。进行ALDH基因的PCR检测,结果表明:侵染“红宝石无核”叶片获得了17个株系的抗性再生植株,获得1个株系的PCR阳性植株,PCR检测转化率为5.88%;转化“长穗无核白”的叶柄获得了18个株系的抗性再生植株,PCR检测出3个阳性植株,阳性率为16.67%。侵染“长穗无核白”的叶柄愈伤获得66个株系的抗性再生植株,PCR检测出16个株系的阳性植株,转化率为24.24%;侵染“红脸无核”胚性愈伤组织,获得9个株系的抗性再生植株;侵染“红脸无核”胚状体,获得了102个株系的抗性再生植株,随机选取了30个株系进行PCR检测,有16个株系是阳性植株,阳性率为53.33%。实验中胚状体发生途径获得的“红脸无核”葡萄的抗性再生率最高,PCR检测阳性率也较高。
东丽[7]2005年在《chi、rip、DREB1A基因多价植物表达载体构建及对黄瓜遗传转化》文中指出黄瓜在我国蔬菜周年供应上占有重要地位,但因真菌病害的危害每年都有不同程度的减产。目前采用最多的化学防治手段虽取得了一定功效,但却带来了严重的环境污染、生态失调和危害人类健康等弊端。实践证明,最经济有效的方法就是培育抗病品种,然而常规育种手段由于育种周期长、效率低、基因资源匮乏及随病源生理小种的变化抗病性消失等原因,迄今,没有获得理想的效果。随着分子生物学和基因工程技术的日趋成熟,利用基因工程手段进行抗病分子育种已成为可能。转录因子DREB1A 是在拟南芥中克隆并鉴定的,它能在干旱、低温及高盐胁迫条件下调控报道基因的表达,并在上述逆境胁迫信号传递中起重要作用。由于DREB1A 转录因子可以调控植物自身内源多个与植物干旱、低温及高盐耐性有关的功能基因的表达,因此,利用转录因子来改良植物抗逆性与单基因的遗传转化相比有明显优势。拟南芥rd29A 启动子的表达受到干旱、低温和高盐的诱导,因为在它的启动子区域中,有两个与上述环境胁迫应答有关的DRE 顺式作用元件,是植物抗逆基因工程研究中理想的逆境诱导型启动子。因此,本研究以黄瓜为试材,建立黄瓜植株再生体系和遗传转化体系;构建了分别由双35S 组成型启动子、E12 强组成型启动子和rd29A 诱导型启动子调控的核糖体失活蛋白基因、几丁质酶基因和DREB1A 基因的多价基因植物表达载体;利用农杆菌介导法将其导入黄瓜优良品种,获得了转pBDCR T0及T1代PCR 阳性植株。T1代转基因植株的抗逆性实验表明,DREB1A 基因的表达可以提高黄瓜的抗旱性。本研究为培育抗逆境及抗真菌病转基因植株探索途径,并为进一步揭示核糖体失活蛋白基因、几丁质酶基因和DREB1A 基因的分子机理提供了理论依据。主要研究结果如下:(1) 植物表达载体构建构建了分别由双35S 组成型启动子、E12 强组成型启动子和rd29A 诱导型启动子调控的核糖体失活蛋白基因、几丁质酶基因和DREB1A 基因的多价基因植物表达载体,并命名为pBDCR。(2) 黄瓜植株再生体系建立①确定了黄瓜“津研四号”不定芽诱导培养基为:MS+1mg/L BA, 30g/L Suc, 0.8%Agar, pH5.8;②不同基因型的不定芽分化率、平均每块外植体芽数及分化效率不同:“长春密刺”、“津研四号”不定芽分化率分别为85.8%、69.7%,平均每块外植体芽数分别为3.9、3.4,分化效率分别为334.6%和236.9 %。(3) 农杆菌介导的遗传转化体系建立
沈奇[8]2007年在《转拟南芥FAD8基因油菜脂肪酸代谢及抗寒性的研究》文中提出油菜是重要的油料经济作物，利用基因工程手段调控其脂肪酸代谢途径，改善油脂膳食营养，提高植株抗逆性是目前油料作物改良的重点。拟南芥脂肪酸脱饱和酶FAD8基因编码叶绿体ω—3脂肪酸脱饱和酶，该酶在低温下催化二烯酸迅速脱饱和产生叁烯酸，该酶可显着提高植物中不饱和脂肪酸含量，增强种子油脂营养价值及植株对低温的适应力。本研究建立了油菜高效转化体系，利用本实验室克隆的拟南芥FAD8基因构建正义和反义表达载体遗传转化油菜。筛选转基因植株研究了FAD8基因脂肪酸代谢和抗寒性的影响，获得较好的结果。1、以甘蓝型油菜特选4号下胚轴及子叶为转化受体材料，研究基因型、苗龄、激素组合及浓度、取材时间、培养时间、外源基因等因素对其转化效率的影响，确定最适的分化培养基为：MS+6-3mg／L BA+0.1mg几NAA。在添加0.1mg／L2，4-D的MS培养基中预培养3d，重悬5倍的菌液中浸染转化(下胚轴30s；及子叶5min)，转化后再经2d共培养、6d脱菌培养后进行筛选培养转化效率较高。2、采用农杆菌介导法将FAD8基因(载体为pSH-FAD8、Psh-anti-FAD8)遗传转化油菜下胚轴、子叶、子叶柄等外植体，并获得转基因植株。经徒手切片GUS染色检验出阳性植株，再经PCR及RT-PCR鉴定，进一步检测出7株转化正义FAD8基因植株，9株转化反义FAD8基因植株。3、提取油菜脂肪酸进行反相薄层层析及气相色谱分析，结果表明转化反义FAD8基因叶片中亚麻酸降低，油酸及亚油酸均有不同程度提高，转化正义FAD8基因叶片中仅有1株亚麻酸提高。转化正义及反义FAD8基因F1代种子均获得60％以上的高油酸含量，可做为油菜品种改良的新材料。4、叶片离体抗寒实验结果表明，转基因植株抗寒性明显高于对照。筛选出两个抗寒能力最强的转基因油菜单株，其F_1代植株进行抗寒性鉴定：叶绿素含量、超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、丙二醛含量、脯氨酸含量等均反映出转化FAD8基因植株的抗寒性显着增强。5、转基因植株在田间可正常生长并开花结实，但转FAD8植株现蕾及抽薹期比对照推迟70d，转anti-FAD8植株比对照推迟40d。转基因植株叶型、叶片组织、株高、株型均有改变，部分薹茎自然扭曲。转基因植株还出现雄性不育的性状。
柴友荣[9]2003年在《植物抗大丽轮枝菌受体类蛋白基因及甘露糖结合型凝集素基因的克隆与表达》文中指出由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)等引起的黄萎病是一种世界范围的顽固性维管束病害，严重为害棉花、番茄、茄子、马铃薯、苜蓿等重要农作物的生长。作为一种土传病害，黄萎病的寄主广，危害重，化学防治成本高、效果差，并且存在食品安全性和生态安全性问题。选育抗黄萎病作物品种是黄萎病防治的根本途径，但却面临育种周期长和抗黄萎病资源严重匮乏的限制，利用基因工程技术分离植物抗黄萎病有关的基因并通过遗传转化创造作物抗黄萎病新材料，具有基因型资源广泛、周期相对较短和不受生殖障碍限制等优点，是抗黄萎病遗传改良的一个重要方向。 根据基因对基因学说(Gene-for-gene Theory)，植物抗病基因R的产物即受体蛋白R与来自病原菌无毒基因Avr的直接或间接产物即Avr配体之间的原初识别，是介导植物抗病反应的根本分子机制。许多抗病和感病植物材料之间的本质差异并不在于个别下游防卫反应基因的有无，而在于负责原初识别的抗病基因的有无或启动抗病信号传导的机制上存在差异，所以克隆和利用受体蛋白类的抗病基因是植物抗病基因工程的核心内容。迄今已有6大类植物抗病基因克隆成功，它们绝大多数均符合基因对基因学说并编码一种介导抗病信号传导的胞内或跨膜受体蛋白，这些抗病基因在转化感病植物以后均成功地取得了抗病性的提高。 除R-Avr识别以外，由PG-PGIP识别而介导的抗病信号传导同样能激活寄主植物的系统性抗病反应。真菌等病原菌在入侵寄主植物时的一个首要致病机理就是分泌多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)等水解酶来降解植物细胞壁，而植物在长期的协同进化过程中也针对性地进化出了一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein, PGIP)，它能特异性、可逆性、可饱和性地与PG发生结合，抑制PG的活性，阻止和延缓病原菌对寄主细胞壁的瓦解，同时延长了具有激发子活性的、适当聚合度的寡聚半乳糖醛酸类寡糖素的产生与滞留时间。这种寡糖素进入植物细胞膜并与膜上的寡糖素受体产生识别作用，启动抗病信号传导，激活植保素合成有关的 柴友荣—一植物抗大丽轮枝菌受体类蛋白基因及甘露糖结合型凝集素基因的克隆与表达酶、蛋白酶抑制剂、病程相关蛋白等一系列防卫相关蛋白的基因转录表达。PGIP同抗病基因产物R蛋白一样也是主要由富亮氨酸重复（leucine－rich。epeat，LRR）构成的细胞表面受体类糖蛋白，均属于LRR超家族成员，主要功能是负贡与外源分子的识别作用，介导防卫相关的信号传导，位了LRR重复单元内p链／B转角（pstrand／pt。rn）上保守性亮氨酸两侧的氨基酸残基是决定识别特异性的核心，其上发生的点突变足以改变识别特异性。 棉花等植物抗黄萎病基因】程长期以来进展不大，但番茄抗黄萎病研究则已取得突破。采用图位克隆法（map－based cloning）己成功分离出番茄（Lycopemcon eSCUentorMill．）抗大丽轮枝菌 1号小种的地基因家族的两个抗病基因Vel和yeZ。它们并不局限于小种特异性，而是可以介导跨越轮技菌属物种间的抗黄萎病性，比如它们转化马铃薯后可以提高马铃薯抗黑白轮枝菌的能力。茄科内番茄的一些近缘物种如茄属的野生种托鲁巴姆等存在对黄萎病、枯萎病、立枯病、线虫等病害的接近免疫的a性，由于黄萎病菌的小种分化性复杂，寄主广泛，在这些近经物种中克隆Ve基因的同源基因是寻找新型抗黄萎病基因型尤其是抗大丽轮枝菌2号小种的抗病基因的一个重要途径，同时也有助于揭示ye基因的系统发生学和抗病作用机制。本研究选择与番茄属亲缘关系最近的茄属植物类番茄茄（Solanor ］NmpjcoideSDun．）为对象，克隆其与番茄 yeM对应的两个同源基因 Slyel和 AfVeZ。以此为跳板，使挪18po更容易地从茄科内其它物种或更远缘的物种中克隆具有不同识别特异性的Ve同源基因。 海岛棉（auioh—— L．）与陆地棉（c ——iM L．）同为棉属的四倍体栽培种，亲缘关系很近，但陆地棉普遍不抗黄萎病，而海岛则普遍高抗黄萎病并在与陆地棉杂交时表现为显性单基因的遗传特点，说明海岛棉中存在陆地棉所不具有的由质量性状基因控制的抗黄萎病性。它们在受大丽轮枝菌侵染时的抗病反应速度上存在巨大差别，海岛棉的防卫反应早而快，陆地棉迟而慢，表明由抗病基因产物R蛋白或KIP介导的抗病反应速度是决定它们抗病差异性的本质因素。水杨酸诱导后从陆地棉茎中分离的PGIP蛋白对大丽轮枝菌和黑曲霉的m酶活性具有抑制能力，番茄果实中纯化的PGIP蛋白也对黑白轮枝菌的PG酶活性具有抑制能力，表明oIP在植物界广泛参与了对黄萎病菌的抗性作用。植物Pgp基因家族仍处于活跃的进化过程中，通过活性位点氨基酸的正向选择性进化、基因加倍、启动于变异等，使植物界产生了识别特异性各异、活性水平不同、调控方式多样的Pgp基因家族成员。探讨海岛棉与陆地棉之间在基因的活性氨基酸位点和启动子功能上存在的差异性将十分有助于阐明基因与棉花抗黄萎病性的相关性。因此本研究克隆了海岛棉基因（的赠中 的全长。DNA序列、基因组序列、启动于序列和终止于?
赵伟[10]2006年在《中国野生葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因表达载体构建及转化初探》文中研究说明白粉病是危害葡萄生产的主要真菌病害之一。本课题组对葡萄白粉病进行了长期、系统的研究,对于该病的发病机理、鉴定方法、遗传特性以及通过分子生物学手段进行基因定位、克隆、蛋白质融合表达等方面进行了大量的研究,取得了一定的进展。中国葡萄属野生种及其杂种对于多种真菌病害具有很强的抗性,是优良的抗病育种种质资源。植物抗坏血酸过氧化物酶(APX)是发现和研究较早,且其酶学特性、分布、定位、作用机理、生理功能和分子生物学特性比较清楚的重要酶类。本实验所用基因APX是从中国葡萄属野生种华东葡萄株系高抗白粉病的白河-35-1中经mRNA差显和RACE扩增技术获得的与抗白粉病相关基因。氨基酸序列同源性分析表明,中国葡萄属野生种APX与其它植物的同源性介于79%-88%之间。本实验首先通过基因克隆构建重组质粒pGEM-T-APX,后经酶切、重组将目的基因APX与表达载体pWR306定向连接并构建植物表达载体pWR-APX,冻融法导入农杆菌株GV3101制备成工程菌,然后探索了无核葡萄皇家秋天叶片再生方法,最后采用农杆菌介导法转化葡萄叶片,对该基因转化进行初步研究。实验得出了以下结果:1.以华东葡萄白河-35-1的cDNA第一链为模板,以已克隆的中国葡萄属野生种抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因序列设计特异引物PCR扩增出目的片段,回收、酶切并与克隆载体pGEM-T easy连接,转化大肠杆菌DH5α,蓝白斑筛选获得阳性克隆。重组质粒pGEM-T-APX酶切鉴定后,送公司测序,结果表明该序列为769bp,为一完整的阅读框架,编码250个氨基酸。2.双酶切克隆载体pGEM-T-APX和表达载体pWR306,回收目的基因,连接后转化大肠杆菌感受态细胞,构建了植物表达载体pWR-APX。经酶切鉴定目的片段已定向连接到了表达载体pWR306中。3.采用冻融法将重组表达质粒pWR-APX导入农杆菌GV3101,卡那霉素和庆大霉素筛选阳性克隆, PCR检测表明重组质粒已导入GV3101中,制备了工程菌。4.在重组质粒的鉴定中用菌液、菌落和质粒叁种介质为模板分别进行PCR,其中菌液直接PCR可以得到菌落和质粒PCR相同的结果,在今后重组质粒的鉴定及其它方面可以加以利用。
参考文献：
[1]. 抗真菌病基因对葡萄植物遗传转化的研究[D]. 孟岩. 东北农业大学. 2001
[2]. 双价抗真菌病基因对大豆遗传转化的研究[D]. 李海燕. 东北农业大学. 2002
[3]. 抗真菌病基因转化苹果和番茄的研究[D]. 石玉. 西北农林科技大学. 2011
[4]. 外源抗病基因和单宁代谢合成关键酶基因LAR3在毛白杨中协同抗病机理研究[D]. 贾之春. 西南大学. 2011
[5]. 农杆菌介导β-1，3-葡聚糖酶（BG2）基因转化南瓜的研究[D]. 白婧. 东北农业大学. 2008
[6]. 中国野生葡萄醛脱氢酶基因转化欧洲无核葡萄的研究[D]. 方莉. 西北农林科技大学. 2006
[7]. chi、rip、DREB1A基因多价植物表达载体构建及对黄瓜遗传转化[D]. 东丽. 东北农业大学. 2005
[8]. 转拟南芥FAD8基因油菜脂肪酸代谢及抗寒性的研究[D]. 沈奇. 贵州大学. 2007
[9]. 植物抗大丽轮枝菌受体类蛋白基因及甘露糖结合型凝集素基因的克隆与表达[D]. 柴友荣. 西南农业大学. 2003
[10]. 中国野生葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因表达载体构建及转化初探[D]. 赵伟. 西北农林科技大学. 2006