韩小华[1]2014年在《可用以评价子宫内膜容受性的KDR单抗脂质声学造影剂的制备及靶向结合实验研究》文中研究指明研究背景与目的子宫内膜容受性是指子宫内膜处于一种允许胚泡黏附直至完成胚胎着床的状态。在月经周期中子宫内膜仅有一段时间允许胚胎着床,一般为黄体中晚期,其受严格的时间和空间限制,一般仅为排卵后的6-8天,持续不到48小时,临床上也称为子宫内膜“种植窗”期。体外受精-胚胎移植(in vitrofertilization-embryo transfer, IVF-ET)技术为不孕症患者提供了福音,但在临床实际工作中,即使应用相当高的技术筛选了相对优质的受精卵,即体外受精及胚泡移植入子宫的成功率在90%以上,但胚胎种植的成功率一般仅为30%-40%。有研究表明60%以上胚胎种植失败的因素归因于不合适的子宫内膜容受性。如何客观评价“种植窗”期子宫内膜容受性,避免盲目移植,以提高胚胎着床率是生殖医学界关注的热点问题之一。现阶段评价子宫内膜容受性的方法有多种,子宫内膜活检随后进行组织及相关生物学指标的测定是临床较公认的评估方法,但其为有创性检查,在IVF-ET周期中不具可操作性。宫腔灌洗液、宫颈粘液生物标记物的测定,血液特殊激素表达测定及基因标记现阶段也有应用,但缺乏相应准确而又敏感的指标或价格昂贵、技术要求较高。彩色多普勒超声技术可作为一种无创手段测定子宫血流灌注情况来评价子宫内膜容受性,但其敏感性、特异性学术界尚存在争议。寻找一种既无创、又能客观评价子宫内膜容受性的方法以提高胚胎种植率是一个亟待解决的问题。Kodaman等多位学者证实,多种细胞因子和生长因子在黄体中晚期短暂、瞬间性高表达,具有显着的时空表达特征,且定位较专一,参与胚胎着床过程,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、白血病抑制因子、整合素、白细胞介素、表皮生长因子等。在受精卵着床、胚胎植入过程中,血管的成熟无疑是最重要的,VEGF是子宫血管发育重要的调节因子之一。Kaczmarek等研究发现,动物“种植窗”期子宫内膜VEGF及其受体flk-1/KDR均显着上调,且VEGF及其受体的表达部位存在从子宫内膜普遍表达到着床位点局部高表达的转变,提示VEGF可作为植入胚胎与接受状态子宫内膜的血管结构之间的局部信号分子。Hwu YM等证实VEGF与受体flk-1/KDR结合后发挥多种生物学功能,以利于胚胎着床,如血管内皮细胞增殖、血管生成、增加血管通透性、介导信号转导、改变内皮细胞基因的表达、调节子宫内膜生长等。“种植窗”期子宫内膜VEGF及其受体flk-1/KDR表达均显着增加,表达定位于上皮细胞、基质细胞、子宫肌层和血管内皮细胞,以促进血管生成、重构、扩张以及增加血管通透性,这一过程是胚胎成功种植的必要条件。Sengupta等证明于排卵后5-10天给予恒河猴VEGF拮抗剂后,其临床妊娠率较对照组显着下降。以上实验表明VEGF及受体KDR的表达水平对评价子宫内膜容受性具有重要意义。靶向超声造影剂是近年来萌芽的一项新兴研究领域,并逐渐成为国际上探讨的热点课题。靶向超声微泡表面携带的特异性抗体或配体能与靶细胞表面的抗原或受体结合,超声检测靶向造影剂在组织和器官中的分布,可获得组织和器官的分子学特征,称之为“超声分子学成像”,是一种无创检测分子水平的成像技术,其在炎症、血栓、心肌缺血、肿瘤等诸多方面均展示了一些十分诱人的前景。以子宫内膜血管组织的KDR为靶点进行靶向特异性显影而评价子宫内膜容受性的研究,国内外尚未见报道。本研究拟利用超声分子影像学优势,以KDR为靶目标,借助生物素-亲和素桥,制备携KDR单抗的靶向超声造影剂(Microbubblles-Biotin-Avidin-Biotin-KDR, MB-BAB-KDR),并通过体内外的靶向结合实验来探讨其在评价子宫内膜容受性中的价值。材料与方法1MB-BAB-KDR的制备及生物活性测定1.1普通生物素化脂质微泡(MB-B)的制备将生物素化二硬脂酞磷脂酞乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2000-Biotin)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DistearoylsnGlyeeroPhosPhoethanola, DPPC)、聚乙二醇-4000(PEG-4000)、泊洛沙姆等材料,参照文献,按一定比例溶于蒸馏水中,在75℃恒温水浴箱上摇匀使其充分溶解；通入全氟丙烷(C3F8)气体,机械振荡法振荡至成为乳白色液体；4℃度静置分层,弃下清液,纯化微泡叁次收集上层白色微泡,制得MB-B。1.2生物素-亲和素桥连的靶向脂质微泡(MB-BAB-KDR)及单纯单抗脂质微泡(MB-B-KDR)制备按一定比例向MB-B中加入亲和素,冰上孵育30min,洗涤纯化3次后,再加入一定比例的生物素化KDR单抗,静置后洗涤纯化3次,制得生物素-亲和素桥连的靶向脂质微泡MB-BAB-KDR。向MB-B中直接加入相同比例的生物素化KDR单抗,静置后洗涤纯化3次,制得单纯单抗脂质微泡MB-B-KDR。所有微泡盛于安剖瓶内,于4℃冰箱内保存、备用。1.3光学显微镜及库尔特粒径分析仪测定微泡物理性质将载玻片及盖玻片擦拭干净,轻轻用注射器将微泡悬液吸出少许,滴在载玻片中央,并将盖玻片盖在载玻片上；使悬液充满盖玻片和载玻片之间,倒置并静置3min,使其靠浮力作用附于载玻片上；普通光学显微镜下观察微泡的镜下形态。另外用注射器吸取MB-B、MB-B-KDR、MB-BAB-KDR叁种微泡悬浮溶液各1ml,以1：10000比例稀释,取2ml微泡上机,库尔特颗粒粒度分析仪测定微泡粒径、浓度及粒径分布情况。1.4MB-BAB-KDR生物活性的测定分别取MB-BAB-KDR、MB-B-KDR、MB-B各lml与等量FITC标记的羊抗大鼠IgG(H+L)(简称二抗)孵育,洗涤纯化3次后,荧光显微镜下观察叁种微泡与二抗的结合情况。依据以下目测标准对荧光强度进行分级：0级：未见明显荧光；Ⅰ级：可见到荧光,但荧光微弱或暗淡；Ⅱ级：可见明亮荧光。2MB-BAB-KDR的体外特异性结合及黏附稳定性实验2.1脐静脉内皮细胞(IUVECs)KDR的表达检测2.1.1流式细胞实验法检测HUVECs的KDR表达将由南方医科大学病理实验室提供的HUVECs复苏、培养,取生长对数期的HUVECs,用0.25%胰酶消化成单细胞悬液加入离心管中,离心弃上清液并洗涤1次；加入稀释的KDR单克隆抗体200μl吹打混匀,置4℃孵育30min,离心洗涤弃上清液3次；再加入FITC标记的二抗200μl,吹打混匀,4℃避光孵育30min,离心洗涤弃上清液3次；将细胞重新悬浮于500ul蒸馏水中,置流式管中应用流式细胞仪检测HUVECs的KDR表达情况,以同等量的HUVECs悬浮为对照组。2.1.2免疫组化法检测HUVECs的KDR表达取生长对数期HUVECs,用0.25%胰酶消化后,接种于6孔板中玻片上,加含10%胎牛血清DMEM全培液,5%C02培养箱孵育,直至细胞80%饱和,PBS洗涤3次,4%多聚甲醛固定,行常规KDR免疫荧光检测。2.2MB-BAB-KDR与HUVECs的体外特异性结合实验用荧光染料DiI给生长良好的传代]SUVECs着色,着色细胞继续传代培养至下一代细胞,在六孔板中培养制作细胞爬片,分别用MB-BAB-KDR、 MB-B-KDR、MB-B与爬片上的HUVECs孵育30min,漂洗六次,光镜及荧光显微镜观察微泡与细胞结合情况。取10个随机视野的细胞进行观察,每个细胞结合5个或以上的微泡视为花环形成阳性,荧光显微镜下观察花环形成情况,计算花环形成率,计数资料以百分率表示。同时用MB-BAB-KDR、MB-B-KDR、MB-B分别与无DiI染色的HUVECs孵育作对照,光镜下计数成环率。2.3平行板流动腔法检测MB-BAB-KDR的体外黏附稳定性35mm培养皿甲醇漂洗后风干、备用。用PBS溶液分别配备1000ng/ml、600ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、10ng/ml的小鼠KDR Fc溶液,用微量加样枪按200μl滴加在培养皿中央,置4℃冰箱过夜备用；次晨使用前用0.05%的吐温20冲洗6遍,3%的TBS-小牛血清白蛋白液封闭1h。将包被好的培养皿与平行板流动腔装置连接,在1.2dyn/cm2剪切应力下,浓度为5×106个/ml的MB-BAB-KDR经微量注射泵通过平行板流动腔,自显微镜下观察有微泡出现后开始连续录像6min。以10OOng/ml KDR Fc包被+大量抗小鼠KDR单抗封闭(封闭组)和Ong/ml KDR Fc包被(空白组)为对照。所有分组均检测3个样本。25帧/s的视频采集后,利用IPP (Image-Pro-Plus)图像分析软件的图像均化及自动跟踪功能,在细胞计数板的协助下测量不同浓度视野内于整分钟点结合的MB-BAB-KDR个数。3MB-BAB-KDR与小鼠子宫血管内皮细胞的KDR体内靶向结合初步实验3.1小鼠模型的制备KM雌性小鼠(由南方医科大学实验动物中心提供)2只(8-10周龄,重约30g),1只异氟烷麻醉后解剖,将小鼠子宫暴露,对小鼠子宫位置及形态了解,另1只利用VEVO2100高频超声生物仪,40MHz高频探头对小鼠子宫行常规二维超声成像,为后期小鼠子宫分子成像提供解剖基础。另取KM小鼠18只(雌性15只,雄性3只,8-10周龄,重约30g),将健康成年雌雄小鼠按2：1于前一晚20：00合笼,自由饮食和饮水,室温25℃左右,次日晨检查阴栓形成情况。根据雌性小鼠被检查到阴栓的时间进行分组,检查到有阴栓为受孕第一天定义为day-1(D1),其余妊娠天数类推,分别制备day-2(D2)组、day-4(D4)组小鼠,将没有合笼的雌性小鼠定义为day-0(DO)组。叁个组的小鼠子宫为研究对象,每组各5只。3.2MB-BAB-KDR与小鼠子宫血管内皮细胞的靶向结合实验用异氟烷将不同子宫容受性的小鼠麻醉,经尾静脉随机注射MB-BAB-KDR或对照微泡(MB-B)后,用VEVO2100小、动物超声成像仪,40MHz高频探头,进行小鼠子宫成像。每只小鼠经尾静脉注射靶向微泡(MB-BAB-KDR)和普通微泡(MB-B)各5×107个,两种微泡注射顺序随机,两次造影之间间隔30min。于每次注射微泡4min后,先采集200帧图像,然后触发burst序列(transmit power,100%; mechanical index,0.63) ls,再采集200帧。用触发burst前后的图像进行减影,得到的信号即为粘附的靶向微泡的信号,将其用绿色伪彩标示。整个实验过程中保持动物及探头的位置固定不变。依据伪彩颜色的明显程度对靶向吸附微泡数进行半定量分析。以下目测标准对造影伪彩绿色强弱进行分级：0级：未见明显绿色,即减影前后,图像无明显差别,靶向微泡没有或较少吸附,无法显示；Ⅰ级：可见到绿色,但绿色较少,为星点状分布；Ⅱ级：绿色较为明显,且绿色范围较多,呈小片状分布,即减影前后差别较大,靶向吸附微泡数目较多。3.3免疫荧光法检测小鼠子宫血管内皮细胞KDR的表达分别取D0,D2,D4时期的小鼠子宫制作冰冻切片,用免疫荧光法分别对其KDR的表达情况进行检测。同时为了形象观察小鼠子宫血管内皮细胞上的KDR的表达,应用带有绿色荧光的CD31对小鼠子宫血管内皮细胞进行标示。荧光显微镜下观察小鼠子宫血管内皮细胞及其上的KDR的着色情况,依据以下目测标准对红色荧光标记的KDR进行分级：阴性：未见明显红色荧光,弱阳性：可见到红色荧光,但荧光微弱或暗淡,阳性：可见较明亮红色的荧光。带绿色荧光CD31标记的血管内皮细胞的分级为：阴性：未见明显绿色荧光；弱阳性：可见到绿色荧光,但荧光微弱或暗淡,规律性一般,未见明显管条状分布；阳性：可见较明亮绿色的荧光,且排列规律,呈管条状分布,即血管形成,血管内皮细胞排列规律。4统计学方法采用SPSS13.0软件包进行统计学分析,计量资料数据以均数±标准差(Mean±SD)表示。MB-B、MB-BAB-KDR及NMB-B-KDR叁种微泡粒径之间的比较采用单向方差分析,计数资料成环率采用百分率表示,数据比较采用多个独立样本比较的非参数秩和检验；平行板流动腔实验稳定结合的靶泡数目之间采用一个重复测量两因素方差分析。免疫荧光法测得的MB-BAB-KDR上单抗的生物活性、MB-BAB-KDR在小鼠子宫的靶向超声分子显影采用半定量分析方法。检验水准以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1MB-BAB-KDR的制备及性能测定1.1叁种微泡基本物理性能MB-B、MB-BAB-KDR及NMB-B-KDR的悬浮液外观呈乳白色,在200倍光学显微镜下观察,微泡粒径分布均匀无聚集现象,单个微泡外观圆整,为透亮气泡。库尔特粒径分析仪测得MB-B的平均直径约(2.19±1.35)μm,浓度约9.8×108个/ml；MB-BAB-KDR平均直径为(2.42±1.71)μm,浓度约为9.6×108个/ml；MB-B-KDR平均直径为(2.38±1.60)u m,浓度约为9.6×108个/ml。叁种微泡的外观、形态均未见明显差别,粒径大小差异无统计学意义。1.2MB-BAB-KDR生物活性的测定与荧光二抗孵育后,MB-BAB-KDR的荧光强度为Ⅱ级,MB-B-KDR荧光强度为Ⅰ级,MB-B荧光强度为0级。2MB-BAB-KDR的体外特异性结合及黏附稳定性实验2.1HUVECs KDR表达的测定流式细胞仪测得HUVECs的FITC携带率达99%,即所使用的HUVECs的KDR为高表达状态。免疫荧光实验显示HUVECs的KDR呈强阳性表达,阳性物质定位于细胞膜及胞浆内。2.2MB-BAB-KDR与HUVECs体外靶向特异结合情况光镜下可见MB-BAB-KDR围绕在有或无DiI染色的HUVECs周围或黏附于其之上,形成花环样结构,有DiI染色的HUVECs花环形成率平均为89.97%,无DiI染色的HUVECs花环形成率平均为88.22%。荧光镜下被DiI染色的细胞发出明亮的红色荧光,黏附于细胞周围的被FITC标记的MB-BAB-KDR外壳发出明亮的绿色荧光,用Nikon成像系统里面的重迭软件重合图片,可清晰看到细胞周围靶向微泡吸附。MB-B-KDR组成环率为7.25%,MB-B组的成环率为3.33%,均显着低于MB-BAB-KDR组,P<0.005。2.3平行板流动腔实验检测MB-BAB-KDR的黏附稳定性实验平行板流动腔实验显示在血流剪切应力为1.2dyn/cm2下,MB-BAB-KDR可与浓度为1000ng/ml、600ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、10ng/ml的KDR Fc包被结合,所录视频经IPP软件处理,稳定黏附的MB-BAB-KDR与移动的MB-BAB-KDR将被区别。MB-BAB-KDR经过不同浓度KDR Fc包被的平行板流动腔,重复测量方差分析显示,观察6min内,MB-BAB-KDR结合数目随着平行板流动腔上KDR Fc包被浓度的提高而增加(F=571.926,P<0.01)；在同一浓度下,随着时间的推移,MB-BAB-KDR结合数目也在增加。MB-BAB-KDR几乎不能与空白培养皿及被抗小鼠KDR单抗封闭掉位点的KDR Fc结合,在整个6min时间段内,结合总数仅为3-5个,且不同时间点结合在视野不同地方,即为随机结合且不能抵抗剪切力。3MB-BAB-KDR与小鼠子宫血管内皮细胞的KDR体内靶向结合实验雌雄小鼠合笼后,分别就不同时间(DO,D2,D4)进行AMB-BAB-KDR靶向超声造影。观察小鼠子宫超声靶向显影绿色伪彩区,DO期为0级,D2、D4期分别为Ⅰ级、Ⅱ级；病理实验证实,小鼠子宫血管内皮细胞的KDR的表达在D0、D2、D4期是阴性、弱阳性、阳性,而应用MB-B进行造影,小鼠子宫超声靶向显影绿色伪彩区在叁组中均为0级。结论1本研究采用生物素-亲和素桥法成功构建了携KDR单抗的靶向脂质超声微泡MB-BAB-KDR。2体外结合实验证实,制备的MB-BAB-KDR可与KDR高表达的HUVECs特异性结合形成花环样结构,并可与流动腔上的KDR Fc包被稳定结合,结合数目随着KDR Fc包被浓度及时间增加呈现增多趋势,表明
白亮[2]2013年在《中华按蚊kdr基因突变检测方法的建立及应用》文中进行了进一步梳理中华按蚊（Anopheles sinensis）在我国分布广泛，是间日疟和马来丝虫病传播的重要媒介。以往的研究发现中华按蚊具有家、野两栖且偏嗜吸动物血的习性，其疟疾传播能量较弱。然而最近相关的文献报道显示我国中部地区的中华按蚊疟疾传播能量较上世纪有明显提升。作为我国中部地区目前最主要的疟疾传播媒介，中华按蚊在当地疟疾控制中的重要性日益受到重视。媒介防制是疟疾控制阶段和消除阶段的关键措施之一。在我国疟疾控制阶段，主要的媒介防制措施是在疟疾流行区大范围采用杀虫剂室内滞留喷洒或药物浸泡蚊帐为主的成蚊防制方法。随着杀虫剂的广泛应用，昆虫对杀虫剂的抗性迅速在全球范围内扩散。昆虫对杀虫剂抗性的机制一直是人们关注的重要问题，越来越多的研究集中于对杀虫剂抗性机理的研究，昆虫对杀虫剂的抗性机制主要有四种：靶标抗性、代谢抗性、行为抗性和表皮化抗性，其中靶标抗性和代谢抗性在昆虫抗药性的形成中起着重要作用，即：昆虫神经系统对杀虫剂靶位点敏感性的改变和解毒酶表达水平或活性的改变。击倒抗性（knockdown resistance, kdr）是靶标抗性中的重要代表。一系列的相关研究发现拟除虫菊酯类杀虫剂的主要作用机理是通过钠离子通道（voltage gated sodium channel, VGSC）的持续活化使昆虫经由兴奋、痉挛到麻痹而导致昆虫死亡。钠离子通道蛋白第二结构域S6区段编码的氨基酸序列的改变，即kdr基因L1014位点突变，是引起昆虫对杀虫剂抗药性的关键。自Kdr基因L1014位点的突变在家蝇、蟑螂等昆虫中发现后，又相继在冈比亚按蚊、库蚊中发现其kdr基因L1014位点存在类似的突变。2007年，Kim H等报道鉴定了中华按蚊kdr基因存在L1014F和L1014C突变类型，kdr基因突变后的中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性下降，2011年武松等报道了我国中华按蚊kdr基因也存在L1014F和L1014C突变。在我国进入疟疾消除阶段后，主要的媒介防制措施是对出现疟疾病例疫点采用杀虫剂室内滞留喷洒方法来阻断可能的疟疾传播。目前在疫点媒介防制中应用最为广泛的杀虫剂仍是拟除虫菊酯类杀虫剂。而在媒介防制措施中选择有效的杀虫剂依赖于对媒介生物抗药性水平的了解，因此不同地区的蚊虫击倒抗性相关基因频率可以为媒介防止措施提供重要的科学依据。关于检测kdr突变的方法较多，等位基因特异性PCR（AS-PCR）是最早建立的kdr突变检测方法，该方法具有简单易于操作的优点，但敏感性和特异性较低；SSOP-ELISA、HOLA和PCR-Dot等方法与AS-PCR相比在敏感性和特异性上有一定的提高，但操作步骤繁琐，耗时长达5～18小时，因此难以在现场媒介监测中推广应用。近年来发展起来的HRM、FRET/MCA、PCR elongation荧光法等也因仪器设备昂贵或操作繁琐等原因受到限制。2012年Athanase等报道了AS-LAMP用于检测冈比亚按蚊kdr的突变，虽然简单方便省时，但引物设计困难，而且敏感性和特异性也不尽如人意。上述这些方法主要用于其他蚊种的kdr突变检测，目前报道的中华按蚊kdr突变检测方法仅有AS-PCR和rtPASA法，而这两种方法敏感性和特异性均存在不足，容易漏检错检。为解决上述问题，本研究拟根据中华按蚊kdr基因L1014F和L1014C两种常见突变型，建立了2种新的可用于中华按蚊kdr基因L1014位点突变检测的实时荧光定量PCR方法，并与经典的kdr基因突变检测方法AS-PCR进行比较，还通过对现场中华按蚊样本的检测评估其现场应用价值。研究包括四部分：第一部分TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测中华按蚊kdr基因突变的研究方法：根据文献报道的中华按蚊钠离子通道蛋白（VGSC）基因序列（Genbank登录号：GI84646709）及其L1014位点的常见突变类型，设计一对实时荧光定量PCR扩增引物和叁条TaqMan-MGB探针。用Fast Tissue-to-PCR Kit试剂盒提取的中华按蚊江苏实验株样本gDNA为模板，对反应体系中的引物浓度、探针浓度、DNA模板量和反应条件进行优化。结果：采用根据中华按蚊钠离子通道（VGSC）基因序列及其L1014位点突变类型设计的一对引物和叁条TaqMan-MGB探针进行实时荧光定量PCR扩增，经优化后的反应体系为：总反应体系10μL，其中Thermo Scientific Maxima ProbeqPCR Master Mix（2×）5μL，引物浓度500nmol/L，TaqMan-MGB探针浓度500nmol/L，模板2μL。反应条件采用两步法，即：50℃2min，95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环；40℃冷却10s；用优化后的反应体系和反应条件对突变型和野生型进行单管叁重探针检测，检测结果与测序完全一致，但仅能区分是否发生突变，不能鉴别具体的突变类型；对六种不同的kdr基因型进行双管两重探针检测，可对具体的突变类型进行鉴别，检测结果与测序结果也完全符合。第二部分Allglo探针实时荧光定量PCR检测中华按蚊kdr基因的研究方法：根据文献报道的中华按蚊钠离子通道蛋白（VGSC）基因序列（Genbank登录号：GI84646709）及其L1014位点的常见突变类型，设计一对实时荧光定量PCR扩增引物和叁条Allglo探针。用Fast Tissue-to-PCR Kit试剂盒提取的中华按蚊江苏实验株样本gDNA为模板，对引物浓度、探针浓度、DNA模板量和退火温度等进行优化。结果：采用根据中华按蚊钠离子通道（VGSC）基因序列及其L1014位点突变类型设计的一对引物和叁条Allglo探针进行实时荧光定量PCR扩增，经优化后的反应体系为：总反应体系10μL，其中HR qPCR Probes Master（2×）5μL，引物浓度600nmol/L，Allglo探针浓度600nmol/L，模板2μL。反应条件采用两步法，即：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环；40℃冷却10s。用优化后的反应体系和反应条件采用单管叁重探针法可以对六种不同的kdr基因型进行鉴别，不需要进一步进行双管两重探针检测，检测结果与测序结果完全符合。第叁部分叁种中华按蚊kdr基因突变检测技术的比较方法：用前述建立的TaqMan-MGB探针法和Allglo探针法，与D. Zhong等报道的AS-PCR检测方法，对163个经测序证实的中华按蚊样本和重组质粒标准kdr基因DNA模板进行kdr基因L1014位点突变检测，评估叁种方法的准确性、敏感性，并就成本、耗时等方面进行综合比较。结果：同“金标准”DNA测序相比较，Allglo探针的准确率最高，错判和误判最少，TaqMan-MGB的准确率次之，略低于Allglo探针；AS-PCR的准确率为叁者中最差。敏感性的比较结果显示TaqMan-MGB探针和Allglo探针均具有比较高的敏感性且两种方法的敏感性比较接近，AS-PCR的敏感性相对较低。结合成本和耗时因素分析，“金标准”DNA测序的成本最高，TaqMan-MGB探针检测法次之，Allglo探针检测的成本较测序和TaqMan-MGB法有降低，AS-PCR的成本最低，但其准确率也最差。综合比较分析发现，Allglo探针法不仅检测准确率较高，而且成本低、耗时短，因此更适用于现场中华按蚊kdr基因L1014位点突变的检测。第四部分Allglo探针法用于现场中华按蚊kdr基因L1014位点突变的检测方法：利用前述已经建立的Allglo探针实时荧光定量PCR对从我国中部不同省份不同地点采集的中华按蚊样本进行kdr基因检测。并对中华按蚊kdr基因的突变频率与文献报道的采集地中华按蚊抗性水平进行初步的比较分析。结果：根据不同省份的中华按蚊kdr基因L1014位点突变的检测结果，发现河南、山东、浙江和江苏等省的中华按蚊kdr基因L1014位点均存在很高的突变频率。其中河南省的中华按蚊样本kdr基因突变频率为90.48%，浙江省的中华按蚊样本kdr基因突变频率为97.71%，山东省的中华按蚊样本kdr基因突变频率为90.63%，江苏省的中华按蚊样本kdr基因突变频率为87.61%。只有湖北省的中华按蚊样本kdr基因突变频率较低为45.38%。这些省份的中华按蚊kdr基因较高的突变率可能与该地区中华按蚊较高的抗药性有关。
沙丹, 何友兼[3]2006年在《VEGF及其受体Flt-1、KDR在鼻咽癌组织中的表达及意义》文中指出背景与目的:VEGF及其受体Flt-1、KDR在肿瘤血管生成及肿瘤进展中发挥关键作用。本研究探讨鼻咽癌组织中VEGF、Flt-1和KDR表达与鼻咽癌患者临床特征及预后的关系。方法:用免疫组织化学的方法检测127例鼻咽癌标本中VEGF、Flt-1和KDR的表达情况,用SPSS10.0软件分析这叁种蛋白表达的相关性、与临床特征的关系以及对患者总生存的影响。结果:VEGF、Flt-1和KDR分别表达于66.9%(85/127)、90.6%(115/127)和88.2%(112/127)的鼻咽癌组织。鼻咽癌组织中VEGF表达与Flt-1和KDR表达呈正相关(r=0.292,P<0.01;r=0.287,P<0.01),Flt-1表达与KDR表达呈正相关(r=0.723,P<0.01)。VEGF蛋白的表达与原发肿瘤的侵犯范围、淋巴结转移、临床分期有关(P=0.04,P<0.01,P=0.02),KDR蛋白表达也与原发肿瘤的侵犯范围有关(P=0.03);叁种蛋白表达均与肿瘤局部复发和/或远处转移(P<0.01,P<0.01,P<0.01)、总生存不佳有关(P<0.01,P<0.01,P<0.03)。Cox多因素相关分析显示,年龄>50岁和VEGF阳性为不良预后因素(P<0.01,P<0.01)。结论:VEGF及其受体Flt-1、KDR在鼻咽癌中广泛表达,与鼻咽癌患者的临床特征和预后关系密切。
董为[4]2008年在《KDR抗体导向的长循环阿霉素微乳抗癌作用研究》文中提出抑制肿瘤血管新生是目前肿瘤生物治疗的主要研究方向之一。血管内皮生长因子(VEGF)是肿瘤血管新生的主要促进因子,因此,VEGF抗体及其受体的抗体成为颇有希望的肿瘤血管新生抑制剂。在肿瘤组织中,VEGF及其受体的表达水平均比较高,前者主要表达于肿瘤细胞,后者主要表达于肿瘤血管的内皮细胞。VEGF的受体主要有叁种,其中KDR与血管生成的关系最密切。因此,与KDR能够特异性结合的KDR抗体具有良好的肿瘤靶向性,也可能因其阻碍VEGF与其受体KDR的结合而成为比较理想的肿瘤血管新生抑制剂。阿霉素(Doxorubicin)是目前临床上最常用的抗肿瘤药物之一。由于它能够造成心脏的不可逆损伤,因而该药在临床应用上受到很大限制。微乳(Microemulsions)是一种热力学稳定的药物传输系统,粒径在10-100nm之间。它的主要优点是能够减少药物向正常组织分布,如心脏;同时能够促进药物向某些血管通透性比较高的病灶分布,如肿瘤。为了提高阿霉素的抗肿瘤作用,减轻其不良反应,本研究利用聚乙二醇型表面活性剂制备了能够在血液系统中长期循环的阿霉素微乳,然后采用戊二醛法把具有肿瘤血管靶向功能的KDR抗体连接到阿霉素微乳的表面进而制备了KDR抗体导向的长循环阿霉素微乳。动物实验表明,KDR抗体导向的长循环微乳能够显着提高阿霉素的抗肿瘤作用,同时显着减轻其急性毒性。KDR抗体导向的长循环阿霉素微乳制备工艺简单,安全性高,抗癌作用提高,具很好的应用前景。
张瓅方, 刘暖, 杨雷, 王倩, 毛秉豫[5]2018年在《黄芪丹参提取物配伍对大鼠骨髓源性EPCs中VEGF,KDR,AngⅠ及eNOS表达的影响》文中研究说明目的:探讨黄芪丹参提取物配伍对骨髓源性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体KDR(kinase insert domain receptor,KDR),血管生成素Ⅰ(angiopoietinⅠ,AngⅠ)及内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide sythase,e NOS)表达的影响及其可能的作用机制。方法:将离体培养、鉴定后的骨髓源性EPCs,使用黄芪提取物、丹参提取物、黄芪丹参提取物配伍(10,10 mg·L-1,各5 mg·L-1)分别处理,并设置空白组,使用逆转录PCR(RT-PCR)及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测各处理组EPCs中VEGF,KDR,AngⅠ和e NOS mRNA的表达水平;用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测EPCs中VEGF,KDR,AngⅠ和e NOS蛋白的表达情况。并使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液上清中VEGF的含量。结果:PCR结果显示,与空白组比较,丹参提取物、黄芪提取物组及黄芪丹参提取物配伍组的VEGF,KDR,AngⅠ和e NOS mRNA的表达水平均有显着上调(P<0.05,P<0.01)。Western blot结果显示,与空白组比较,丹参提取物、黄芪提取物组VEGF,KDR,AngⅠ和e NOS蛋白表达均有显着上调(P<0.05,P<0.01),而黄芪丹参提取物配伍组中的表达量显着高于其他3组(P<0.01),尤其是EPCs细胞培养液上清中的VEGF。ELISA结果显示,黄芪丹参配伍组EPCs中VEGF蛋白含量显着高于其他3组(P<0.01)。结论:以"益气化瘀通络生脉"为治则的黄芪丹参提取物配伍可显着调控EPCs促血管新生作用,其作用可能与上调VEGF密切相关。
范永剑[6]2007年在《1，3，4-恶二唑类KDR激酶抑制剂的设计、合成与活性研究》文中提出抗血管新生疗法是通过抑制血管新生来控制肿瘤生长的新型抗肿瘤疗法。KDR(The Kinase insert Domain containing Receptor)是与血管新生密切相关的激酶,当它与相应的配体(Vascular Endothelial Growth Factors,VEGF)结合就产生了血管新生的作用。KDR激酶抑制剂通过与ATP的竞争作用拮抗VEGF与KDR激酶的结合,从而发挥其抗血管新生的作用。因此,开发KDR激酶小分子抑制剂已成为抗血管新生疗法的重要途径之一,研制新型有效的KDR激酶小分子抑制剂是当前抗血管新生药物研发的热点。通过文献调研,我们选择具优良KDR激酶抑制活性的2-芳氨基-5-芳基恶唑为先导化合物,利用生物电子等排原理,以1,3,4-恶二唑环替代先导物中的恶唑环,结合计算机辅助药物设计保留能与KDR激酶结合的恶唑环2位的5-砜基-2-甲氧基苯胺的结构,对5位的芳环进行系统的结构修饰,用不同的取代苯环或芳杂环来替换苯环,考察不同结构修饰对化合物抑酶活性的影响,从而设计合成了一系列新型的1,3,4-恶二唑类KDR激酶抑制剂。通过对目标分子的逆合成分析,设计出了一条原料易得、操作简便、收率较高的合成路线,共合成19个目标化合物,所有目标化合物均未见文献报道,化合物结构经~1HNMR、IR及MS确证。对合成的19个目标化合物进行了体外脐母静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制活性测试,并对活性结果进行了讨论,为进一步的结构改造和优化奠定了基础。
朱萍, 朱海杭, 宋雯, 赵梁, 张妮娜[7]2014年在《胃、肠息肉中VEGF、KDR及MVD的表达及相关性》文中认为目的探讨胃、肠息肉中血管内皮生成因子(VEGF)、激酶插入嵌合受体/胎肝激酶-1(KDR)、微血管密度(MVD)的表达及相关性。方法采用免疫组织化学方法检测VEGF及KDR在胃、肠息肉组织中的表达水平,计数微血管密度(MVD)。结果胃、肠息肉组织中VEGF、KDR及MVD的表达显着低于胃、肠癌(P<0.05),显着高于正常胃、肠黏膜(P<0.05),且胃、肠息肉中VEGF、KDR的表达呈正相关(P<0.01);直径>2.0 cm息肉中VEGF、KDR的表达显着高于直径<1.0 cm者,且在年龄>50岁患者中表达增高;肠息肉中VEGF、KDR在绒毛状腺瘤、表面呈分叶状者中表达量高,差异有统计学意义(P<0.05);肠息肉中VEGF、KDR的表达显着高于胃息肉(P<0.01)。结论直径>2.0 cm、年龄>50岁的患者癌变概率高,肠息肉中腺瘤性息肉、分叶状息肉癌变率高;肠息肉癌变率高于胃息肉,VEGF、KDR、MVD及其相互作用对促进息肉血管生成及癌变的过程可能起到重要作用。
赵钰[8]2008年在《KDR RNAi抑制小鼠肝癌移植瘤生长作用》文中进行了进一步梳理应用RNA干扰技术设计构建针对血管内皮细胞生长因子受体KDR的siRNA,将靶向KDR的siRNA注射至小鼠人肝癌细胞HHCC皮下移植瘤瘤体内,观察其对移植瘤生长情况的影响。建立人肝癌细胞HHCC皮下移植瘤小鼠模型,设计针对KDR编码区的有短发夹结构的叁条DNA序列,克隆到pGCsi.H1/neo/GFP载体中构建叁个重组质粒,分别命名为KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3;对重组质粒进行酶切鉴定、DNA测序分析;将重组质粒注射入小鼠移植瘤瘤体内,动态观察肿瘤体积并于2周后处死小鼠称取瘤重。结果表明:KDR在人肝癌细胞HHCC中表达。KDR-siRNA表达载体用限制性内切酶NdeI和SmaI进行单酶切后分别产生约632bp、5480 bp和2403 bp、3709 bp两个片段,与预计结果相同;测序结果与设计的编码相应短发夹状KDR-siRNA的寡核苷酸序列一致;叁个KDR-siRNA表达载体注射后的小鼠移植瘤与各对照组相比,移植瘤生长缓慢,瘤体积明显缩小,瘤重明显减轻。其中以KDR-siRNA3的作用最为明显。结论:KDR靶向RNA干扰重组体质粒构建成功,该载体能有效抑制肝癌HHCC细胞小鼠移植瘤的生长,为探索KDR介导的肿瘤基因治疗的新途径奠定了实验基础。
宋述梅, 曾莉, 吴健, 孟麟, 寿成超[9]1999年在《VEGF受体KDR胞外Ⅴ～Ⅶ区的克隆、单抗制备及KDR在不同来源肿瘤组织中的表达》文中研究指明目的利用制备的血管内皮细胞增殖因子（ＶＥＧＦ）受体ＫＤＲ抗体，通过免疫组化，检测ＫＤＲ在不同来源肿瘤组织中的表达，为探讨ＶＥＧＦ及其受体对肿瘤生长及转移的作用提供可能。方法采用ＲＴＰＣＲ方法，从人胎儿脐静脉内皮细胞克隆ＫＤＲ胞外Ⅴ～Ⅶ区基因片段，在大肠杆菌中表达，并用传统的杂交瘤融合技术制备小鼠ＫＤＲ单克隆抗体。通过组化及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定ＫＤＲ单抗的特异性，最后采用ＳＰ免疫组化法，分别对不同来源的１１５例肿瘤组织及相应正常组织进行了ＫＤＲ表达分析。结果不同来源的肿瘤组织中，ＫＤＲ受体的表达率及强度存在差异，移行上皮来源的膀胱癌１００％表达ＫＤＲ，表达强度最高；乳腺癌及肠道腺癌细胞表达ＫＤＲ次之；肺鳞癌表达最弱。此外，肿瘤组织中不仅血管内皮细胞表达ＫＤＲ受体，且肿瘤细胞、血管平滑肌细胞及某些间质细胞也有ＫＤＲ表达，而相应正常组织中ＫＤＲ表达相对较弱。结论ＶＥＧＦ受体ＫＤＲ不仅表达于肿瘤血管内皮细胞，而且表达于肿瘤细胞，肿瘤细胞表达ＫＤＲ的强度与组织来源有关
银杉, 林丽, 卢白玉[10]2018年在《sEPCR、VEGF、MVD、KDR在早发型子痫前期胎盘中的表达》文中研究指明目的研究s EPCR、VEGF、MVD、KDR在早发型子痫前期胎盘中的表达情况。方法选取2016年3月至2017年4月我院收治的早发型子痫前期患者50例为研究对象,以同期入院体检的50例健康产妇为对照组,测定入组对象胎盘组织中可溶性血管内皮细胞蛋白C受体(s EPCR)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘微血管密度(MVD)、含有激酶插入区的受体(KDR)及可溶性血管内皮生长因子受体(s Flt-1)水平,同时比较子痫前期病情轻度、中重度患者上述指标,分析PE患者s EPCR、VEGF、MVD、KDR及s Flt-1的相关性,评价上述指标联合诊断PE的效能。结果早发型组胎盘组织VEGF(30.25±1.87)%、MVD(37.11±1.54)条低于对照组(P<0.05),而其s EPCR(156.34±1.25)ng/m L、KDR(70.34±1.38)%、s Flt-1(80.32±1.67)%较对照组升高(P<0.05);重度子痫前期患者VEGF(30.18±1.30)%、MVD(36.20±1.31)条与轻度组比较明显降低,而s EPCR(154.22±1.05)%、KDR(71.20±1.66)%、s Flt-1(81.11±1.56)升高(P<0.05);s EPCR、VEGF、MVD、KDR联合诊断早发型PE患者灵敏度为98.05%,特异性为93.11%,准确度为96.20%,均高于上述指标单项诊断;相关分析显示子痫前期患者胎盘组织中VEGF、MVD与s Flt-1呈负相关(P<0.05)。结论s EPCR、VEGF、MVD、KDR在早发型子痫前期胎盘中呈异常表达,随病情加重VEGF、MVD表达降低,s EPCR、KDR表达增多,其中VEGF、MVD表达水平与s Flt-1高表达有关。
参考文献：
[1]. 可用以评价子宫内膜容受性的KDR单抗脂质声学造影剂的制备及靶向结合实验研究[D]. 韩小华. 南方医科大学. 2014
[2]. 中华按蚊kdr基因突变检测方法的建立及应用[D]. 白亮. 江苏省血吸虫病防治研究所. 2013
[3]. VEGF及其受体Flt-1、KDR在鼻咽癌组织中的表达及意义[J]. 沙丹, 何友兼. 癌症. 2006
[4]. KDR抗体导向的长循环阿霉素微乳抗癌作用研究[D]. 董为. 吉林大学. 2008
[5]. 黄芪丹参提取物配伍对大鼠骨髓源性EPCs中VEGF,KDR,AngⅠ及eNOS表达的影响[J]. 张瓅方, 刘暖, 杨雷, 王倩, 毛秉豫. 中国实验方剂学杂志. 2018
[6]. 1，3，4-恶二唑类KDR激酶抑制剂的设计、合成与活性研究[D]. 范永剑. 浙江大学. 2007
[7]. 胃、肠息肉中VEGF、KDR及MVD的表达及相关性[J]. 朱萍, 朱海杭, 宋雯, 赵梁, 张妮娜. 胃肠病学和肝病学杂志. 2014
[8]. KDR RNAi抑制小鼠肝癌移植瘤生长作用[D]. 赵钰. 吉林大学. 2008
[9]. VEGF受体KDR胞外Ⅴ～Ⅶ区的克隆、单抗制备及KDR在不同来源肿瘤组织中的表达[J]. 宋述梅, 曾莉, 吴健, 孟麟, 寿成超. 中华肿瘤杂志. 1999
[10]. sEPCR、VEGF、MVD、KDR在早发型子痫前期胎盘中的表达[J]. 银杉, 林丽, 卢白玉. 标记免疫分析与临床. 2018
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