长沙市第八医院 长沙市中医医院 410100
摘要：目的：研究骨肉瘤组织中mir-93的表达变化及化疗对其表达的影响。方法：收集10例正常骨组织及13例人骨肉瘤组织标本，用原位杂交和Real-time PCR方法检测标本中miR-93的表达情况。结果：原位杂交结果显示：A组（新辅助化疗前骨肉瘤活检组织）mir-93的表达高于B组（新辅助化疗后骨肉瘤手术切除组织），P＜0.05；A组mir-93的表达高于C组（正常骨组织），P＜0.05。Real-time PCR显示：A组mir-93表达高于B组，P<0.01；A组mir-93表达高于C组，P<0.01；B组mir-93表达高于C组，P<0.01。结论：发现骨肉瘤组织中mir-93呈高表达，化疗后其表达降低，初步说明mir-93可以作为一个辅助诊断骨肉瘤和监测骨肉瘤化疗效果的新指标。
关键词：miRNA；miR-93；骨肉瘤
miR-93、miR-25和miR-106b 同属于miR-106b-25家族，有研究报道miR-93与很多肿瘤的发生，发展具有很强的关联性，如前列腺癌，肺癌，喉鳞癌，乳腺癌，胃癌，肝癌，直肠癌，T细胞癌等常见的癌症【1.2】。
本研究我们从临床手术收集13例典型骨肉瘤患者的活检组织样本，手术切除组织样本以及10例正常骨组织样本，记录患者年龄、性别、肿瘤位置等临床资料，着重探讨miR-93在骨肉瘤组织中的表达情况。
1实验材料
1.1 组织样本
本实验共纳入骨肉瘤患者13例，正常骨组织（来自外伤患者）10例为研究对象。骨肉瘤患者男性 9例，女性4 例，患者年龄8至54岁，平均年龄为18.74岁。所有样本获取均符合伦理委员会的相关规定。
1.2 主要仪器、器材，试剂
超净工作台，分光光度计，超低温冰箱，原位杂交试剂盒，探针等等
2实验方法
2.1 原位杂交
步骤：
（1）取材（2）梯度脱水（3）浸蜡（4）切片（5）梯度酒精复水（6）孵育（7）胃蛋白酶消化（8）后固定（9）预杂交液（10）杂交（11）杂交后洗涤（12）滴加生物素化鼠抗地高辛（13）滴加鼠二抗（14）DAB显色（15）苏木精复染（16）梯度酒精脱水（16）中性树脂封片。
2.2 Real-time PCR
步骤：
（1）组织总RNA的提取
（2）琼脂糖凝胶检测RNA的完整性：
（3）cDNA的合成（逆转录反应）
（4）实时定量PCR（Real-time qPCR）
2.3 统计学分析
实验所得数据均采用SPSS19.0软件进行统计学分析。根据具体情况分别采用两配对样本t检验，两独立样本t检验以及χ2检验或四格表确切概率法。各检验结果均为P<0.05表示具有统计学意义，P<0.01表示具有显著统计学意义。
3结果
3.1 原位杂交结果
原位杂交结果表明：光镜下观察发现miR-93阳性信号主要定位于骨肉瘤细胞胞浆中。A组（新辅助化疗前骨肉瘤诊断性活检标本）中高表达10例，高表达率为76.92﹪；B组（新辅助化疗后骨肉瘤手术切除标本）中高表达4例，高表达率为30.77﹪；C组（正常骨组织标本）中miR-93高表达2例，其高表达率为20.0﹪。两两比较：A组mir-93表达高于B组，P=0.047＜0.05。差异具有统计学意义；A组mir-93表达高于C组，P=0.012＜0.05。差异具有统计学意义；B组和C组比较，P＞0.05。.差异无统计学意义。（图1-1，图1-2，图1-3）
A组，新辅助化疗前诊断性活检标本；B组，新辅助化疗后手术切除标本；C组，正常骨组织标本（来自外伤患者）。
**表示差异具有显著的统计学意义，p<0.01
Real-time PCR结果表明：A组（新辅助化疗前骨肉瘤诊断性活检标本）中miR-93表达CT值=8.19±2.0266，N=13；B组（新辅助化疗后骨肉瘤手术切除标本）中miR-93表达CT值=3.53±1.6740，N=13；C组（正常骨组织标本）中miR-93表达CT值=1.90±1.0329，N=10。两两比较：A组mir-93表达高于B组，差异具有显著统计学意义（配对样本t检验，P<0.01）；A组mir-93表达高于C组，差异具有显著统计学意义（两独立样本t检验，P<0.01）；B组mir-93表达高于C组，差异具有显著统计学意义（两独立样本t检验，P<0.01））。（图1-4）
4 讨论
目前，有很多研究人员提出肿瘤本质上是一种在基因层面发生病变的疾患[3]。其发生机制相当复杂，包含很多种基因改变形式。如癌基因的异常扩增，表达增强，抑癌基因的丢失，沉默，表达减弱。正常基因在某种损伤因素的作用下发生变异甚或缺失等等，这些改变的合力将最终决定肿瘤的发生与否[4]。
在骨肉瘤基因研究的领域，miRNA的研究方兴未艾。有很多研究报道，在骨肿瘤细胞的增殖，分化，代谢，凋亡等各方面，miRNA都发挥着很多关键性的作用[5]。通过检测发现，肿瘤组织中miRNA的表达往往处于失控状态。有些miRNA分子表达增强，有些则表达减弱。前者发挥着癌基因的作用，后者则发挥着抑癌基因的作用[6]。
本实验从临床上收集骨肉瘤组织样本及正常骨组织样本，通过原位杂交及Real-time PCR等方法，可以看出，相对于正常组织，mir-93在骨肉瘤组织中的表达明显增强，说明mir-93与骨肉瘤的发生发展一定存在着某种密切的联系。因此，临床上我们可以将mir-93作为诊断骨肉瘤的一个有效的新指标。在患者局部症状体征不明显的早期阶段，mir-93可以为骨肉瘤的早期诊断发挥积极的作用。另外，经过有效化疗，骨肉瘤组织中mir-93的表达受到抑制。化疗后Mir-93表达低于化疗前。这意味着mir-93的表达变化能够间接的显示化疗药物对骨肉瘤组织的作用情况。从而为我们判断化疗药物是否有效，是否需要更换药物提供证据。
参考文献：
[1].Hermansen S K，Kristensen B W.MicroRNA biomarkers in gliobla-stoma[J].J Neurooncol，2013，114（1）：13-23.
[2].Ogelstein B，Kinzler KW.Cancer genes and the pathways they control.Nat Med，2004，10（8）：789-799.
[3].Bucher P.Regulatory elements and expression profiles.Curt Opin Struct Biol，1999，9：400-407.
[4].Calin GA，Croce CM.MicroRNA signatures in human cancer.Nat Rev Cancer，2006，6（11）：857-866.
[5].Willam C.S.Cho.MicroRNAs in cancer translational research.1 st ed.Netherlands：Springer，2011：1-71.
[6] Li T，Li D，Sha J，et al.MicroRNA-21 directly targets MARCKS and promotes apoptosis resistance and invasion in prostate cancer cells.Biochem Biophys Res Commun，2009，383（3）：280-285.
论文作者:阳国琼
论文发表刊物:《健康世界》2016年第5期
论文发表时间:2016/6/16
标签：组织论文; 骨肉瘤论文; 统计学论文; 高于论文; 样本论文; 标本论文; 原位论文; 《健康世界》2016年第5期论文;