赵爽1 马晓蕾2 张新慧2 常琳2 席志慧2(通讯作者)
（1沈阳市第四人民医院儿科 辽宁沈阳 110031）
（2沈阳万类生物科技有限公司 辽宁沈阳 110000）
【摘要】目的：构建结核分枝杆菌（MTB）16kD-38kD-19kD融合基因重组质粒，并对融合蛋白进行表达及纯化。方法：利用PCR方法分别扩增16kD、38kD及19kD基因，经过双酶切依次与pET28a载体连接，构建pET28a-16kD-38kD-19kD融合基因重组质粒，转化至大肠杆菌表达株BL21中，经IPTG诱导获得目标蛋白，并进行镍柱纯化。结果：经过酶切及测序鉴定证实pET28a-16kD-38kD-19kD重组质粒构建正确，并经原核表达及纯化获得融合蛋白。结论：成功构建并表达纯化16kD-38kD-19kD融合蛋白，为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。
【关键词】结核分枝杆菌；16kD蛋白；38kD蛋白；19kD蛋白；融合蛋白
【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）10-0221-03
Construction, Expression and Purification of Recombinant Fusion Proteins 16kD-38kD-19kD of Mycobacterium tuberculosis
【Abstract】Objective To construct the recombinant plasmid of Mycobacterium tuberculosis (MTB) 16kD-38kD-19kD fusion gene, and to express and purify the fusion protein.Methods: 16 kD, 38 kD and 19 kD protein genes were amplified from the genome of Mycobacterium tuberculosis by PCR, and inserted into the pET28a vector after restriction enzyme digestion. PET28a-16kD-38kD-19kD recombinant plasmid was constructed and transformed into E.coli BL21, and the target protein was induced by IPTG, then the purified protein was obtained by Ni-NTA affinity chromatography. Results PET28a-16kD-38kD-19kD recombinant plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing, and the fusion protein was obtained by prokaryotic expression and purification.Conclusion Construction, expression and purification of 16kD-38kD-19kD fusion protein, which lays the foundation for the development of the tuberculosis specific antigen.
【Key words】Mycobacterium tuberculosis; 16 kD protein, 38 kD protein; 19 kD protein; Fusion protein
结核病（TB）是危害人类健康的一种重要传染病，发病率及病死率居高不下。在我国结核病人数量位居世界第二，仅次于印度，对公共卫生体系造成沉重负担。准确、快速的对结核分枝杆菌感染进行诊断是肺结核防治的重要一环，目前结核病诊断仍主要依赖于临床观察、痰涂片检测以及细菌培养，但是涂片阳性率低而且培养耗时过长影响检测的效率，因此，近年来血清免疫学诊断以简单、快速、经济等优点受到重点关注。近年来人们对MTB培养液进行较多研究，并分离出多种蛋白，如Ag85、16kD、38kD、19kD、CFP10等，但是单一抗原的血清学诊断敏感度有限，难以区分患结核病以及结核菌感染人群[1-3]。本研究分别扩增了16kD、38kD、19kD基因片段并依次构建于原核表达载体形成融合基因，并在大肠杆菌中成功表达及鉴定，为结核病的临床诊断提供一个候选抗原。
1.材料及方法
1.1 主要材料及试剂
结核分枝杆菌标准株H37Rv菌体来源于沈阳市胸科医院，原核表达质粒pET28a购自Novagen，Taq DNA聚合酶、pGM-T连接试剂盒、DNA快速纯化试剂盒、基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA Marker、蛋白Marker购自天根生化（北京），核酸内切酶NdeI、BamHI、EcoRI、HindIII均购自Promega（美国）。引物委托上海生工合成。
1.2 引物设计与合成
根据GenBank中发表的16kD、38kD以及19kD基因序列设计特异性引物如下：16kD上游：5’-GGAAGGCATATGAACAATCTCGCATTGTGGTCGC-3’（含有Nde I位点及起始密码子）；16kD下游：5’-TTATTAGGATCCTCCGCCACCCTTCGTGATGGCGATG-3’（含有BamH I位点及Linker）；38kD 上游5’-GCTGACGGATCCGTGAAAATTCGTTTGCATAC-3’（含有BamHI位点）；38kD下游：5’-GTATTAGAATTCGCTGGAAATCGTC GCGATC-3’（含有EcoRI位点）；19kD上游：5’- AATAGAATTCGGAGGTGGCGGTAGTGTGAAGCGTGGACT GA-3’（含有EcoRI位点及Linker）；19kD下游5’- GTCCGGAAGCTTTTAGGAACAGGT CACCTCGATTTCG -3’（含有HindⅢ位点）。
1.3 目的基因扩增
参照试剂盒说明书对结核分枝杆菌进行基因组提取，并以之为模板，分别利用相应引物扩增目的基因16kD、38kD以及19kD，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环数29，72℃ 10min，产物经1.5 琼脂糖凝胶电泳鉴定。与pGM-T载体进行T-A克隆，转化大肠杆菌克隆菌株XL进行扩培，提取质粒进行测序鉴定。
1.4 重组质粒构建
首先对pGM-T-16kD及pET 28a质粒分别进行双酶切（Nde I/BamH I）、纯化回收16kD片段及 pET 28a线性片段，经连接酶体系进行重组，获得pET 28a-16kD重组载体，继续与pGM-T-38kD质粒进行酶切（BamH I/EcoR I）、连接构建pET 28a-16kD-38kD重组质粒，进一步与pGM-T-19kD质粒进行分别酶切（EcoR I/Hind Ⅲ）、连接，最终获得pET 28a-16kD-38kD-19kD基因融合质粒，对重组质粒分别进行双酶切鉴定。
1.5 融合基因的诱导表达及纯化
将重组质粒转化至表达菌株BL21中，平板划线挑取菌落接种于液体培养基中，继续扩大培养，2%接种于200ml含有卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养，当OD600达到0.8左右时，加入0.5mM IPTG进行诱导蛋白表达，30℃诱导时间为10h，诱导结束后菌液10000 g离心收集菌体，超声破碎收集上清蛋白，Ni柱纯化，SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果。
2.结果
2.1 目的基因的PCR扩增
应用所合成的各种引物，以MTB H37Rv基因组DNA作为模板，经PCR扩增，分别获得16 kD、38 kD以及19 kD 3种目的基因片段，并含有各自酶切位点以及Linker，与预期片段大小相一致，图1。分别插入T载体，选择鉴定为阳性的重组质粒送由上海生工测序，分别与基因库中报道目标基因序列一致。
M：蛋白分子量Marker；lane 1：超声后总蛋白上清；lane 2：纯化后16 kD-38 kD-19 kD蛋白
3.讨论
结核病至今仍是全球范围内最具威胁的传染病之一，在中国，对于结核病的防治仍然很重要，快速、灵敏而有效的诊断在其中意义重大[4]。由于多数活动性肺结核患者体内存在多种抗MTB抗原的抗体，因此应用多种抗原联合检测是诊断结核病的更有效的方法，目前市面上的结核病诊断试剂多为单一抗原，应用于结核病临床诊断的备选抗原很多，包括ESAT6，CFP10、Ag85、38kD等等，但是不可能同时检测所有抗原和抗体[5-6]。因此，多个特异性抗原的组合或进行若干关键表位的融合蛋白的构建是高特异性及灵敏性MTB血清学诊断的发展趋势[1,7,8]。
16kD蛋白是结核分枝杆菌的主要膜蛋白成分，属于小分子热休克蛋白家族成员，具有MTB特异抗原决定簇，能够诱导T细胞介导的免疫应答、刺激机体产生抗体，同时具有分子伴侣活性，对MTB的存活及稳定发挥重要功能[9]。此蛋白特异性较高，与其他分枝杆菌基本不存在共同抗原，对提高诊断试剂的特异性及敏感性很重要。38kD蛋白是一种磷酸盐转运蛋白，又称为蛋白抗原b（pab），相对分子量为38.2kD，Bothamley等研究指出菌阴性肺结核中，38kD蛋白是最有用的抗原之一，能对结核病患者与BCG接种阳性者进行区别，适合与其他抗原联用进行结核病诊断试剂的开发[10-11]。19kD蛋白又名Rv3763，是结核分枝杆菌细胞壁上的一种脂蛋白，分子量为19000Da，研究报道已经证明其为一种具有免疫原性的抗原，可以被结核病人血清中抗体所识别，在血清学诊断中具有重要研究价值[12-13]。
同一载体上面同时表达多个外源基因是生物学领域非常成熟的技术，我们 选择较为高效的原核表达质粒pET28a作为载体，含有强启动子T7、Lac操纵基因以及His纯化标签等，有助于我们获得较高浓度的可溶性融合蛋白；并在目标基因构建过程中通过引物设计引入有良好柔顺性和折叠性的甘氨酸/丝氨酸接头，以减少形成高级结构时多个蛋白的相互影响，保证融合蛋白与天然蛋白各自空间构象的一致性，以及免疫学特性。我们利用基因工程技术逐步构建并表达了重组的16kD-38kD-19kD融合蛋白，并对其进行纯化，为下一步评估其血清学诊断价值，开发结核病血清学的诊断试剂奠定良好基础。
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[基金项目] 沈阳市科学技术局资助项目（F12-047-2-00）
论文作者:赵爽1,马晓蕾2,张新慧2,常琳2,席志慧2(通讯作
论文发表刊物:《心理医生》2015年10期供稿
论文发表时间:2016/4/28
标签：蛋白论文; 质粒论文; 抗原论文; 基因论文; 结核病论文; 分枝论文; 结核论文; 《心理医生》2015年10期供稿论文;