攀枝花市中西医结合医院 四川省攀枝花市 617000
摘要：目的 探析丹参中隐丹参酮的分离纯化、结构鉴定与体外抑菌活性的研究结果。方法 将丹参中的脂溶性成分进行测定和制备，利用重结晶和柱色谱分离并制备单体化合物。借助理化性质和图谱测定，对化合物结构进行鉴定和分。以奶牛子宫内膜炎的病原菌中的金黄色葡萄球菌作为抑菌实验菌株，开展体外抑菌活性试验。结果 从丹参中可提取出的单体化合物为橙红色针状结晶，易溶与甲醇、乙酸乙酯等，并结合图谱进行测定和分析，鉴定为隐丹参酮。经体外抑菌活性试验，隐丹参酮对金黄色葡萄球菌具有极度敏感性，抑菌作用显著。结论 隐丹参酮可有效抑制奶牛子宫内膜炎病原菌中的金黄色葡萄球菌，对于其他病原菌具有相近的作用，因此丹参可作为治疗奶牛子宫内膜炎的有效药物成分，分离鉴定与体外抑菌活性试验具有较高的参考价值。
关键词：丹参；隐丹参酮；体外抑菌活性
丹参是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，在全国大部分地区均有分布。丹参具有活血、通心包络的作用，可祛除心腹邪气，寒热积聚，有烦满、益气的功效[1]。现代药理学表明，丹参具备水溶性与脂溶性成分，两种成分铜绿杆菌与金黄色葡萄球菌等具有一定的抑菌活性，其中脂溶性成分中的隐丹参酮对金黄色葡萄球菌菌株存在高度敏感。本次研究对丹参中隐丹参酮进行分离鉴定与体外抑菌活性研究，具体报道如下。
1材料与方法
1.1材料
研究选用丹参药材购自西安某药材市场；对照品隐丹参酮购自西安鸿生生物科技有限公司，批号为20130303。选取奶牛职工内膜炎临床分离的金黄色葡萄球菌菌株作为抑菌活性实验菌株，分离株来自中国农业科学院兰州畜牧与收益要研究所。
主要试剂：甲醇（批号20131227），乙烯乙酯（批号20130228），均购自天津博迪化工股份有限公司；无水乙醇（批号2013091031），购自成都科龙化工试剂厂；琼脂（批号707C037），购自背景索莱宝科技有限公司；肉汤（批号110312），购自背景路桥技术有限责任公司。
主要设备：RE-52A旋转蒸发器，购自上海亚荣生化仪器厂；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.2方法
1.2.1丹参中隐丹参酮的分离与鉴定
首先，取丹参药材进行粉碎、乙醇浸泡，于60℃下水浴加热回流，过滤收集滤液，并再次重复药渣的水浴加热回流，过滤收集滤液，与前次合并，通过旋转蒸发仪减压浓缩。其次，水沉处理浓缩提取物，加入8倍体积蒸馏水，摇匀后冰箱4℃静置1d，采取5min的4000r/min离心处理，弃上清液，水浴加热沉淀物，去除溶剂，即得到丹参脂溶性制备物。再次，通过一次柱色谱分离与二次柱色谱分离方式分离出含隐丹参酮的柱色谱制备物，并通过重结晶纯化处理，以水浴加热至加入甲醇的柱色谱制备物完全溶解，制备热饱和液，静置至甲醇自然挥发，析出针状晶体后进行重结晶，则可获得隐丹参酮单体化合物。最后，观察化合物熔点、颜色、不同溶剂中的溶解度，并与文献报道的图谱数据作对比分析，鉴定结构[2]。
1.2.2体外抑菌活性试验
以金黄色葡萄球菌分离株作为抑菌活性试验菌株，在琼脂培养基上使用接种环接种，于恒温37℃下进行1d的培养。培养物挑取后接种在无菌肉汤培养基当中，再次进行1d的37℃恒温培养，稀释菌液，用于抑菌作用的测定。采取琼脂平板打孔法，将0.1ml的菌液滴于琼脂平板上，并涂布均匀，后于平板上打孔，孔间距保持在20mm以上，孔径为5mm。将受试隐丹参酮加入孔中，在酒精定上加热、封底，后将接种金黄色葡萄球菌的琼脂平板置于恒温37℃培养箱中培养，1d后进行观察。
敏感度判定[3]：低度敏感，抑菌直径在10mm之下；中敏感度，抑菌直径在10-14mm之间；高度敏感，抑菌直径在15-19mm之间；极度敏感，抑菌直径超过20mm。
取一定量隐丹参酮，用DMSO溶解，再在含肉汤培养基的无菌试管中按倍比稀释法稀释，在不同浓度药物的试管中再加入0．1mL制备好的菌液，阳性对照管为第11管，不加药液，第12管为不加药不加菌的空白对照管。摇匀后置37。C恒温培养箱中培养36h，肉眼观察，试管中无菌生长且药物浓度最低，该浓度即为该药对该菌的最小抑菌浓度(MIC)。将最低抑菌浓度及以上的几个浓度的细菌接种至Ⅱ固体琼脂培养基上，培养过夜，观察有无菌落形成，无菌落形成的药物最低浓度即为供试药液对该菌的最小杀菌浓度(MBC)。
2结果
2.1分离纯化物结构鉴定结果
纯化物为橙红色的针状晶体，熔点在180-182℃之间，易溶于甲醇和乙酸乙酯等，经与文献报道的图谱数据比较，分离鉴定结果如表1所示，鉴定结果同文献相一致，化合物为隐丹参酮。
2.2体外抑菌试验结果
隐丹参酮对金黄色葡萄球菌的敏感度极高，抑菌圈直径为（21.98±1.52）mm，而其对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为8mg/L，最小杀菌浓度为16mg/L，说明隐丹参酮对金黄色葡萄球菌的抑菌活性高，抑菌作用显著。
3讨论
依照中药有效成分分离提取中“结构相似相溶”原理[4]，选择有效的溶剂分离并提纯丹参药材中的隐丹参酮，并采取色谱法中的柱色谱法分离纯化，本次试验结果中可以看出，分离纯化的橙红色针状晶体在结构、熔点、溶解度等方面与文献报道一致，鉴定为隐丹参酮。
通过隐丹参酮的抑菌活性试验，隐丹参酮对金黄色葡萄球菌的敏感度极高，抑菌圈直径为（21.98±1.52）mm，而其对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为8mg/L，最小杀菌浓度为16mg/L，说明隐丹参酮对金黄色葡萄球菌菌株具有极度敏感性，抑菌作用显著。
丹参为传统的活血化瘀类中药，且性味苦、微寒，具有活血化瘀、清心除烦、通经止痛之功效。随着临床研究的不断深入，关于丹参活性作用也有了新的研究进展。本次研究表明，隐丹参酮可有效抑制金黄色葡萄球菌，验证了相关研究中的结论，且经再次研究，发现隐丹参酮对于其他菌株也具有一定的抑制作用，由此可见，丹参可作为治疗奶牛子宫内膜炎的新型药物中的有效成分，为相关研究提供参考价值。
参考文献：
[1]汤瑶,李佐刚,王秀文,等.超高效液相色谱法同时测定丹参酮提取物中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ_A[J].药物分析杂志,2014(5):813-818.
[2]楼招欢,杨波,沈炜,等.丹参二萜醌部位高速逆流色谱制备工艺及体外抗肿瘤活性研究[J].中草药,2015,46(5):679-682.
[3]许冠华,雷俊华,金丽莎,等.隐丹参酮联合顺铂作用于非小细胞肺癌PC9细胞的体外研究[J].浙江中西医结合杂志,2014,24(12):1043-1045.
[4]韦忠红,朱智杰,刘玉萍,等.TNF-α3'-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选[J].中国药理学通报,2015,31(1):77-81.
论文作者:李天敏
论文发表刊物:《医师在线》2016年6月第11期
论文发表时间:2016/8/5
标签：丹参论文; 葡萄球菌论文; 抑菌论文; 丹参酮论文; 金黄色论文; 活性论文; 浓度论文; 《医师在线》2016年6月第11期论文;