【摘要】液体活检作为精准医疗新技术，液体活检可以实时、有效地用于肺癌早期诊断、疗效监测、预后评估和精准治疗等方面。对EGFR突变水平进行定性及定量测定，可较为方便监测疾病的进展，并可较早地发现 EGFR-TKI 获得性耐药。液体活检在肺癌EGFR突变精准医疗的应用前景，以促进液体活检的应用提高肺癌的临床疗效。
【关键词】液体检验；非小细胞肺癌；EGFR突变检测
目前，病理活检是肺癌患者临床诊断的金标准，也是基因分型诊断的金标。但由于活检的有创性，临床上往往难以进行多次活检获得足够的组织标本,而“液体活检”循环肿瘤细胞CTC、循环肿瘤ctDNA和外泌体,因操作方便、无创、全面地反应整体情况，近年来成为研究热点。“液体活检”可辅助甚至替代组织标本作为临床的诊断、监测指标[1]。因此，建立高敏感度、高特异性、高一致率的检测方法对“液体活检”的推广应用具有重大意义。
1.CTCs、ctDNA和外泌体
1869年，澳大利亚籍医生Ashworth首次提出循环肿瘤细CTCs的概念。目前，CTCs是指存在于外周血中的各肿瘤细胞的统称，并以以同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTCs，也有聚集成团的细胞团CTM。CTCs通过从肿瘤组织中脱落游走至血管，穿过血管进入血液循环，到最后定植形成新的转移灶等多个生理步骤，使得CTCs可顺利侵袭转移从而促进相关疾病的进展[3]。循环游离DNA（cfDNA）是释放入血液中的被降解的DNA片段[4]。ctDNA是属于 cfDNA 的一种类型，是一种特征性的肿瘤生物标志物，可以被定性、定量和追踪。外泌体外泌体是细胞分泌的包裹着 DNA、RNA和蛋白质的囊泡，是细胞之间沟通的载体，直径在34-200nm。肿瘤细胞分泌的外泌体具有刺激肿瘤细胞生长、抑制免疫系统功能、促进肿瘤组织血管生成等功能，甚至参与了肿瘤的转移。如今，外泌体能够从各种体液中分离得到，其中包括羊水、腹水、唾液、血清、乳汁、尿液以及细胞培养液等。
2.液体活检的检测
CTCs在血液中含量少，实现CTC检测首先需要将其与血液中的各种细胞进行区分，目前，CTC的分离方式主要有根据细胞的物理性质，如细胞大小、密度等（密度梯度离心法、微孔过滤法）进行分离；根据细胞的生物学特性，使用免疫磁珠进行分离（针对CTC细胞表面抗原的正向分选以及针对白细胞表面抗原的负向分选）；通过微流控芯片进行CTC分离等[7]。目前，CTC的检测方式主要有：针对细胞数量的细胞计数，基于基因检测的免疫荧光、FISH、测序、逆转录RT-PCR和表达分析以及细胞培养等。在进行研究时必须先进行富集，其检测方法包括计数、免疫荧光、原位杂交、细胞培养、测序等方法[8]。
一般情况下，血液里的ctDNA很少，ctDNA只占 cfDNA的0.01-1%。在肿瘤学中，ctDNA一般认为存在有体细胞基因突变，以此可以辅助区分ctDNA和正常cfDNA，这些体细胞基因突变，仅在癌前细胞或癌细胞的基因组中出现。随着二代DNA测序技术的快速发展，包括数字PRC技术、BEAMing法、PAP法等用于检测ctDNA，已实现对痕量DNA分子进行定量分析。
在不同的细胞类型和生理状态下，外泌体内的RNA 组成是有区别的，而且与正常组织细胞相比，肿瘤细胞能够分泌更大量的外泌体。外泌体内的RNA可以作为新的诊断生物标志物。常用检测技术有免疫磁珠法、色谱法、动态光散射技术、纳米微粒追踪分析术等。
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3.液体活检在EGRF基因突变检测的临床应用
研究表明，对于NSCLC患者，CTCs的数量也与肿瘤的预后直接相关。对于早期肺癌患者，术前检测到的CTC数量越多，则肿瘤的无进展生存期及总生存期越短[14]。目前，使用CTC已经能够检测多种突变，在NSCLC患者的CTCs中一旦检测出表皮生长因子受体（EGFR）T790M突变，用药治疗就产生耐药，并且T790M突变的出现明显缩短了患者的无进展生存期。在癌症的早期阶段，患者的血液中就已经存在 ctDNA，其中Ⅱ-Ⅳ期 NSCLC患者ctDNA检出率为100%，但是在Ⅰ期，仅有50%的患者被检’，对在抗 EGFR 治疗期间肿瘤复发的患者进行 ctDNA 分析，证明 ctDNA 中产生了耐药突变。已有临床研究表明肿瘤患者外周血中ctDNA 水平与预后相关1994年 Vasioukhin V等人首先在 ctDNA 中检测到了常用的肺癌基因突变靶点有 KRAS、EGFR 和 ALK。外周血取样ctDNA检测方便，如能检测 EGFR 突变，能大大降低组织取材的难度。Rabinowits等研究发现NSCLC患者的外泌体中有12条特异性的mRNAs表达升高，有研究也发现，NSCLC患者接受不同剂量的放疗后，其体内的外泌体中miR-29a和miR-150表达丰度会产生相应的变化。外泌体内miRNAs和蛋白的表达与肺癌患者的生存和预后相关。
4.问题与展望
新型生物标志物的开发以及以血液和体液检测为基础的早期诊断系统的建立对于提高肺癌的临床疗效和总生存率具有重要意义。CTCs的分离要特殊设备，CTCs具有肿瘤异质性，样本代表性不强这些问题仍然影响其在临床运用。ctDNA检测结果无法定位，无法检测蛋白质，无法从细胞层面进行功能研究。目前，利用外泌体来研究NSCLC相对较少，其分离需要特殊设备，无法进行细胞层面的研究，有一定的临床局限性。液体活检尚存在极大的发展潜力，通过血液检测CTCs、ctDNA 和外泌体可以有效的提供组织活检无法实时提供的信息，将这些信息与组织活检结合用来指导肺癌的临床治疗，将开启肺癌精准治疗的新篇章，并为实现肺癌患者的个体化诊疗提供有利的循证医学依据。
参考文献
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论文作者:刘霞1, 顾玉海2
论文发表刊物:《医师在线》2017年10月下第20期
论文发表时间:2018/1/9
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