卢晟盛[1]2003年在《影响猪体外受精因素的研究》文中研究指明本研究探讨了成熟液中激素处理时间(48小时和24小时)、成熟液种类[改良TCM-199液(mTCM)和改良NCSU-23液(mNCSU)]及其蛋白质添加物[10％的新生牛血清(NBCS)、猪卵泡液(pFF)和胎牛血清(FCS)]对猪卵母细胞体外成熟及体外受精后早期胚胎发育的影响，以期在国内条件下提高其成熟和受精后的胚胎发育潜能。结果显示：(1)在成熟液中添加蛋白质可以加强卵丘细胞的扩散，但猪卵母细胞的核成熟与其周围的卵丘细胞扩展没有必然的联系，卵丘细胞扩散或成放射状不宜作为猪卵母细胞核成熟的标准，只有排出第一极体才能作为猪卵母细胞核成熟的标志；(2)在猪COCs的46-48小时成熟培养的后23-24小时阶段去除成熟液中的激素不但可以保证卵母细胞的核成熟率，而且可加强卵丘细胞的扩散；(3)在现有实验条件下，在mTCM和mNCSU中添加10％pFF与在mNCSU中添加10％FCS相比可获得较高的猪卵母细胞核成熟率；(4)在不同的成熟液中添加不同的蛋白质对猪卵母细胞核成熟率的影响效果不一样，但对体外受精后的早期胚胎发育影响不明显；(5)成熟液种类对猪卵母细胞的卵丘细胞扩散和体外受精后的早期胚胎发育无显着影响。
曹筠青, 汪正铸, 王华, 张胜, 唐博[2]2017年在《猪卵母细胞体外受精条件的优化》文中认为猪卵母细胞体外受精(in vitro fertilization,IVF)技术为受精和胚胎早期发育机理等基础理论的研究及生产实践提供了重要的研究手段。虽然猪IVF的研究已经取得了一些进展,但其囊胚发育率仍然较低,亟需建立更为稳定、高效的体外受精方法。本试验通过比较精子浓度,精子获能处理,不同精卵共孵育培养体系以及在卵母细胞成熟过程中添加不同激素等影响猪卵母细胞体外受精胚胎发育能力的因素,以求找到最佳的猪卵母细胞体外受精体系。结果显示:在精子浓度为1×10~5~1×10~7/mL,5×10~6/mL的精子浓度显着提高体外受精效率(P<0.05);以茶碱、咖啡及咖啡因联合使用肝素作为获能物质处理精子,发现2.5 mmol/L茶碱处理组体外受精效率显着提高(P<0.05);通过比较不同的受精体系,发现使用40个卵/500μL体系显着提高体外受精效率(P<0.05);在卵母细胞成熟液中添加不同激素组合,发现添加10IU/mL PMSG,10IU/mL HCG和2.5IU/mL FSH激素组合,体外受精效率显着提高(P<0.05)。本试验结果表明,在M199中添加10IU/mL PMSG,10IU/mL HCG和2.5IU/mL FSH体外成熟培养卵母细胞,以5×10~6/mL精子浓度,2.5mmol/L茶碱作为获能物质处理精子,40个卵/500μL共孵育的IVF体系效果最佳,其卵裂率为(61.33±0.77)%,囊胚率为(28.33±1.08)%。本试验将为深入研究猪IVF提供理论参考。
兰宗宝[3]2007年在《猪卵母细胞体外受精相关问题的初步研究》文中研究说明本研究以体外成熟的猪卵母细胞为材料，通过体外受精和化学孤雌激活方法，对猪卵母细胞体外受精等相关问题进行了的初步研究：(1)精子的浓度、授精前孵育时间、精卵共孵育时间对猪卵母细胞体外受精以及进一步早期发育的影响；(2)胚胎培养液中不同渗透压及山梨醇浓度对猪体外成熟-体外受精卵早期发育的影响；(3)成熟培养液中不同来源促性腺激素对猪卵母细胞早期孤雌发育的影响。旨在研究影响猪卵母细胞体外受精的相关问题，并探讨提高猪卵母细胞经体外受精或化学孤雌激活后早期胚胎分裂率、囊胚率的方法，为猪胚胎体外生产技术提供可靠的参数。试验结论如下：在本研究条件下，(1)进行猪体外受精时，精子的适宜浓度为1×10~6个／ml；(2)精子授精前孵育时间对猪体外受精及进一步早期发育影响不明显，精子洗涤后不需要孵育就可直接用于授精；(3)精卵共孵育时间对猪体外受精及进一步早期发育影响亦不明显，其中以精卵共孵育3h效果较好；(4)胚胎培养液NCSU-23的渗透压为320～335mosm时(用NaCl和亚沸水调节)有利于猪体外成熟-体外受精卵早期发育；(5)在胚胎培养液NCSU-23中添加山梨醇对猪体外胚胎早期发育效果不明显；(6)本研究选择的两种来源促性腺激素对猪卵母细胞孤雌激活后早期发育的影响无明显差别，说明中国科学院动物所生产的促性腺激素FSH和LH对于猪卵母细胞体外成熟和进一步孤雌激活效果不低于同类进口产品。
葛立军[4]2007年在《猪体外生产胚胎玻璃化冷冻保存的研究》文中指出哺乳动物胚胎的冷冻保存在动物种质资源保存方面日益显示出强大的应用潜力。猪的胚胎冷冻保存对于良种资源的保存和世界范围内猪的品种改良非常重要,备受关注。自从1998年Vajta用OPS管成功冷冻猪桑椹胚和囊胚以来,玻璃化冷冻显示出了极大优势。本实验在研究了猪体外受精、胚胎培养条件后运用OPS管冷冻了猪的体外受精胚胎,比较了不同时期、不同冷冻保护剂和不同预处理方法冷冻早期体外受精胚胎的效果,旨在建立一套有效的猪体外受精胚的玻璃化冷冻保存技术。本实验的结果如下:1.以猪新鲜精液、冷冻猪新鲜精液进行猪的体外受精,以活力较低(＜0.5)且畸形率较高(＞30%)的新鲜精液进行体外受精后受精胚的卵裂率较活力(＞0.8)和形态(畸形率＜10%)都正常的鲜精组差异不显着(51%vs53.6%),但是受精后桑椹胚的发育率明显低于正常鲜精组(28.9%vs47.4%);以活力较高(＞0.5)的冻精进行体外受精后受精胚的卵裂率和桑椹胚的发育率与正常的鲜精组无明显差异(54.3%vs51.1%,48.2%vs45.4%);以活力(≤0.4)较低的冻精进行体外受精其受精胚的卵裂率较活力(＞0.5)高的冻精组无明显差异(56.4%vs54.3%),但是受精后桑椹胚的发育率明显低于活力高的冻精组(37.0%vs48.2%)。另外,用不同精-卵比例(分别为Group A:12000:1、GroupB:6000:1、Group C:3000:1)冻精进行体外受精,发现A组受精胚的卵裂率(37.5%)和桑椹胚的发育率(34.4%)都明显低于B、C组,后两组受精胚的卵裂率和桑椹胚的发育率无明显差异(54.3%vs 54.2%,48.5%vs 45.7%)。结果表明精液质量会影响体外受精胚的后续发育;无论是鲜精或是冻精,精子活力并不是影响体外受精卵裂率的决定因素;体外受精时合适的精卵比例提高了受精胚后续的发育能力。2.采用NCSU-23和PZM-3中培养后的卵裂率分别是54.7%、55.0%,差异不显着:前者获得了46.2%的桑椹胚发育率,比后者40.3%的桑椹胚发育率高,但两者差异不显着。单独采用NCSU-23培养猪体外受精胚卵裂率和桑椹胚的发育率分别是61.1%和47.2%,与输卵管上皮细胞单层共培养后卵裂卒和桑椹胚的发育率分别是63.4%和49.3%。共培养后的卵裂率和桑椹胚的发育率都稍高于单独用NCSU-23培养,但两者差异不显着3.采用EDS(15%乙二醇、15%二甲基亚砜、0.5M蔗糖)直接冷冻合子期受精胚获得了62.3%的存活率,显着高于2-8细胞、8-16细胞、桑椹胚组,后叁组冷冻解冻后的胚胎存活率都很低,分别是8.7%、4.4%和5.6%。4.采用ES(40%乙二醇、0.5M蔗糖)直接冷冻冷冻合子期受精卵解冻后形态正常率和存活率分别只有53.3%和31%,明显低于EDS组(90%和72.7%),说明EDS冷冻保护效果好于ES。用细胞松弛素B处理合子期体外受精卵冷冻解冻后的形态正常率是60.6%,明显低于直接冷冻组(81.7%):CB处理合子期体外受精卵冷冻解冻后受精卵的存活率为61.2%,低于直接冷冻(70.2%),但是两者之间差异不显着。所有合子期受精卵冷冻组解冻后培养24h均未卵裂。
吴彩凤[5]2008年在《猪胚胎体外生产技术的初步研究》文中指出猪是进行人类异种器官移植研究的理想动物,而研究异种器官移植需对早期胚胎进行遗传操作。和体内生产的胚胎相比,目前猪胚胎体外生产效率不高,因此急需优化胚胎体外生产的条件。成熟卵母细胞移核后激活是核移植的关键步骤之一,卵母细胞激活率的高低直接影响核移植的效率。当前核移植效率低下,其原因之一就是受体卵母细胞未被充分激活。本试验对影响猪卵母细胞体外成熟培养、孤雌激活、体外受精及克隆胚移植的因素进行了研究,以便确立胚胎体外生产的最佳条件。本文研究了季节变化对卵母细胞体外成熟、孤雌激活胚体外发育能力及体细胞克隆胚移植后体内发育能力的影响。比较不同季节平均每个卵巢获得的A级卵的数量及卵母细胞核成熟的比例,统计分析不同季节核移植胚胎发育能力的差异,我们发现在春季移植克隆胚胎无论妊娠还是出生率都高于夏季和冬季。这可能是因为夏季和冬季的温度过高或过低对运输和胚胎移植操作过程中的克隆胚胎影响较大,特别是我们移植的1-2细胞期克隆胚胎。研究了放线菌酮预处理对猪卵母细胞减数分裂进程和孤雌激活后原核形成的影响。结果表明:放线菌酮(CHX)预处理卵母细胞可有效抑制其生发泡破裂(CVBD)的发生,在解除抑制后减数分裂可完全恢复。培养44h诟,TCM199+CHX组卵母细胞的激活率较低,但是差异不显着(P＞0.05)。多次孤雌激活试验表明,去卵丘卵母细胞最佳电激活参数为120v/mm,40μs,1Dc。乙醇单独激活显着低于7.5μg/mL细胞松弛素B(CB)+10μg/mL cHX、7.5μg/mLCB+2Mm6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)或7.5μg/mECB+10μg/mL CHX+2mM6-DMAP联合激活组(P＜0.05)。其中7.5μg/mlCB+10μg/mL CHX+2mM 6-DMAP组卵母细胞激活后囊胚发育率最高。电激活前用乙醇预处理卵母细胞,电激活后与不同的化学激活剂联合处理,结果表明乙醇(Ethanol)+电脉冲(DC pulse)组卵母细胞的囊胚率显着低于Ethanol+DC pulse+CHX,Ethanol+DC pulse+6-DMAP,Ethanol+DC pulse+CHX+6-DMAP组(P＜0.05),Ethanol+DC pulse+CHX+6-DMAP组显着高于其它各组(P＜0.05)。电激活单独处理组卵母细胞囊胚率显着低于电激活与化学激活联合处理组(P＜0.05)。其中DC pulse+CHX+6-DMAP组显着高于Dc pulse+CHX,DCpulse+6-DMAP组。卵母细胞在含CHX(10mg/mL)的NCSU-23中预处理10min获得的囊胚率最高(25%),显着高于预处理0min、30min、40min组(12.3%、17.1%、4.9%,P＜0.05)。试验结果表明电激活前,用CHX预处理较短时间可提高体外成熟卵母细胞孤雌激活胚的发育能力。以解冻后活力为0.3左右的冷冻精液进行体外受精时,精子浓度以10~7为宜;0.25mL细管冷冻精液IVF的卵裂率显着低于鲜精,但是囊胚率差异不显着;多精入卵率随着共孵时间或精子浓度的增长而增加,精卵共孵6h的受精效果较理想;猪体外生产胚胎的发育速度与囊胚异常率存在关系,体外受精后发育两天的4-cell和8-cell胚胎囊胚率显着高于2-cell和＞8-cell的胚胎,与4-cell和8-cell胚胎发育形成的囊胚相比,来自于2-cell和＞8-cell胚胎的囊胚发育异常率较高。
徐飞良[6]2006年在《精子载体法制作转基因试管猪胚胎的研究》文中认为本研究共分为4部分对猪体外受精技术和精子转染技术展开了研究，以期建立一个高效的以猪精子为载体的基因转移技术平台，为转基因猪乳腺生物反应器的研制奠定基础。 第一部分针对影响猪体外受精的几个常见因素设立五个实验：即对在成熟培养液中添加不同量(0％，10％，20％，30％)的猪卵泡液(PFF)；不同的成熟培养液成分和卵母细胞的体外成熟培养温度；不同的卵母细胞体外成熟培养方法(微滴法与平皿法)以及卵母细胞的不同采集方法(剖解法，抽吸法，机械破碎法)对猪体外受精效果的影响进行了一定的研究。 第二部分重点探讨了性成熟对猪卵母细胞体外成熟及体外受精效果的影响。结果表明：(1)性成熟前卵母细胞在成熟率方面与成熟后差异不大，但是在分裂率上要低于性成熟后。(2)适当延长性成熟前卵母细胞的体外成熟培养时间，在一定程度上能提高其分裂率，但对其成熟率无显着影响。(3)性成熟后卵母细胞延长体外成熟时间后其分裂率较44h略有下降。(4)性成熟前卵母细胞作成熟培养时，适当提高FSH和LH浓度有助于提高成熟率。 第叁部分探讨了外源DNA转染猪精子的影响因素，精子结合及内化转运外源DNA的作用机制。结果表明：猪精子具有自发性结合外源DNA能力。精子与外源DNA孵育的时间和PH值在一定程度上影响孵育后精子的活率。 第四部分通过荧光显微镜与PCR从不同时期胚胎中检测出携带外源DNA的阳性胚，说明精子与外源DNA共孵育能使精子携带外源DNA，并通过体外受精技术使外源DNA进入早期胚胎。精子的转染效率受外源DNA的浓度和精浆的影响。精浆的抑制作用可通过反复离心洗涤得以解除；如果精子不进行去精浆处理，其结合外源DNA的能力将下降。
王昭凯[7]2006年在《猪卵母细胞与胚胎冷冻保存研究》文中认为许多研究论证了猪卵母细胞与胚胎对低温的敏感性与其高脂肪含量相关。猪卵母细胞与胚胎的低效率保存技术不仅会降低猪的遗传多样性，而且在一定程度上阻碍了繁殖技术的应用。 本试验卵母细胞采集于屠宰场废弃卵巢，胚胎采用手术法获得。冷冻后的卵母细胞通过乙酰荧光素染色和体外受精的方法来判断。 1) 研究渗透性与非渗透性的保护剂对卵母细胞的毒性作用，发现渗透性保护剂的毒性大小依次为EG＜GL＜DMSO。非渗透性保护的毒性大小差异不显着。 2) 采用一步法冷冻卵母细胞，比较保护剂为EFS30，EFS40，GFS40，EDFS40得冷冻效果，试验结果表明EFS40的效果显着好于其它组(p＜0.05)。 3) 实验以EFS40为冷冻保护剂，比较不同的玻璃化平衡时间对卵母细胞的影响，结果表明以30s的平衡时间为佳，与1min的平衡时间相比差异不显着(p＞0.05)。 4) 比较不同的冷冻承载工具对卵母细胞的冷冻效果的影响。实验结果表明以GLT法(55.8％)为最好，与OPS(29.5％)，GMP(13.4％)法比较差异极显着(p＜0.01)。 5) 将不同发育阶段的卵母细胞冷冻保存，结果表明MII期的卵母细胞的冷冻效果最好(53.6％)，与培养22h(39.6％)、GV期(22.0％)比较差异显着(p＜0.05)。 6) 比较离心+5ug／mL CB，只添加5ug／mL CB，去脂后的卵母细胞的冷冻效果影响。前两组结果为54.5％、55.6％差异不显着(p＞0.05)，但与后一组(33.3％)比较差异显着(p＜0.05)。 7) 比较冷冻解冻后的卵母细胞的发育能力，直接体外受精没有观察到卵裂，但采用ICSI方法发现有卵裂，并发育到4细胞阶段。与对照组相比差异显着。 8) 通过手术法获得胚胎，冷冻解冻后将45枚胚胎分别移植到两受体母猪，有一头母猪受孕，产下仔猪10头，存活8头。
杨喜[8]2006年在《猪卵母细胞OPS冷冻保存与体外受精的研究》文中研究说明本实验系统研究了猪卵母细胞的体外成熟、冷冻保存、体外受精及早期胚胎发育,着重研究了季节因素、FCS、pFF、胰岛素和17β-E2等对猪卵母细胞体外成熟的影响;研究了不同冷冻保护剂、不同处理方法、不同发育阶段卵母细胞的OPS冷冻效果;并探讨了不同的受精液、不同的Caffeine浓度对体外受精的影响,还对不同的蛋白质添加物、胰岛素、谷氨酰胺对早期胚胎发育的影响进行了研究。结果,(1)春秋季节的猪卵母细胞成熟率高于夏冬季节(P<0.05),卵泡期卵巢采集的猪卵母细胞成熟率和卵裂率均显着高于黄体期,添加10%FCS、10%pFF、20%FCS和10%FCS+10%pFF的卵裂率差异不显着(P>0.05),培养液中添加一定量的胰岛素和17β-E2有助于提高成熟率和卵裂率;(2)用5%PVP+梯度EG作为冷冻保护剂效果最好,GV期(12h)的卵母细胞的冷冻效果好于其它时期,CB处理可提高卵母细胞解冻后的卵裂率,离心不利于解冻的进一步发育;(3)添加5mM Caffeine的mBO的受精效果最好,培养24h后添加FCS可进一步提高胚胎发育能力,添加胰岛素和谷氨酰胺可提高胚胎发育能力。结论,(1)用含有10%FCS的NCSU-23成熟液体外培养猪卵母细胞,培养的前24h在培养液中加入激素,后24h不加激素的成熟效果最好;(2)体外成熟12h的猪卵母细胞(GV期)用5%PVP+EG做为玻璃化冷冻保护剂,5步OPS冷冻法的冷冻效果最好;(3)含5mM Caffeine的mBO受精液的受精效果最好。
陈涛[9]2009年在《猪胚胎体外生产和孤雌囊胚发育能力的检测》文中研究表明掌握和建立较为成熟的猪胚胎体外生产技术,完善其操作程序、提高猪胚胎生产效率,可以为利用猪体外胚胎进行胚胎干细胞分离培养奠定基础。目前,猪卵母细胞体外成熟、体外受精和孤雌激活等均取得很大进展,但有些方面尚待优化;体外生产获得的胚胎的发育能力,特别是能否利用体外生产的胚胎来分离猪胚胎干细胞还未能取得突破性进展。本研究以屠宰场取得的猪卵巢和养殖场取得的猪新鲜精液为原材料,对猪体外受精、孤雌激活以及孤雌囊胚在饲养层上的发育能力进行部分研究,旨在完善猪胚胎实验室生产体系和探讨孤雌囊胚的后期发育能力,为猪胚胎体外生产和胚胎干细胞分离等相关研究提供参考和依据。实验验结果如下:(1)统计总结了本地区不同月份从屠宰场取得的卵巢,每个卵巢可以获得的有效卵母细胞数;探讨了卵母细胞成熟培养基中促性腺激素PMSG和hCG的不同添加时间对卵母细胞成熟的影响。结果表明,8、9、10和4月份为卵巢采集用于实验的最佳时间;在培养方面,添加促性腺激素组和后22小时不添加促性腺激素组卵母细胞成熟率为80.35±0.76%和82.75±0.85%,差异不显着(P>0.05)。(2)探讨了猪新鲜精液17℃恒温保存时间和精子活力的关系,并用于体外受精后对受精效果的影响。结果发现,精液保存24h以内活力保持在0.9,保存3d的精液活力可以保持在0.7以上,3d后精液活力下降至0.5以下;保存1d以内的猪精液相比于保存4-5d的精液用于体外受精后,受精卵在卵裂率、桑葚胚率以及囊胚率方面差异显着(P<0.05),保存3d以内的猪精液用于体外受精,结果显示受精卵在卵裂率、桑葚胚率以及囊胚率方面差异不显着(P>0.05),保存4-5d的精液用于体外受精后,受精卵在卵裂率、桑葚胚率以及囊胚率方面差异不显着(P>0.05)。(3)探讨了精卵共孵育时间和视磺酸RA对受精卵发育效果的影响。结果表明,精卵共同孵育6h和7h后,受精卵卵裂率为55.90±9.77%和54.51±13.25%,共孵育5 h和8 h卵裂率为52.31±4.84%和53.85±7.16%,差异不显着(P>0.05);但在囊胚率方面,6h组囊胚率为11.89±3.64%,显着差异于5 h和8 h组5.55±0.63%和3.85±2.12%(P<0.05);在成熟液中添加0nM、5nM、25nM和50nM RA后成熟的卵母细胞用于体外受精,结果表明,受精卵在卵裂率、桑葚胚率和囊胚率方面无统计学差异,0nM和5nM组囊胚率要高于25nM组和50nM组。(4)探讨了不同电击参数对体外成熟的卵母细胞孤雌激活后发育的影响。结果表明,激活参数为1.5Kv/㎝,1个DC,100μs时,能有效地激活体外成熟卵母细胞发育至囊胚,显着差异于1.5Kv/㎝/1DC/60μs和1.5Kv/㎝/1DC/80μs组;激活参数为2.0Kv/㎝,1个DC,60μs时,囊胚率为18.70±0.93%,显着差异于2.0Kv/㎝,1个DC,100μs组(P<0.05);而脉冲次数为1个或2个时,对孤雌效果无显着影响。(5)探讨了孤雌囊胚的体外发育能力。结果表明,在含饲养层细胞的培养基中添加小分子物质CHIR99021和PD0325901培养孤雌囊胚,与对照组相比囊胚贴壁率差异不显着(P>0.05);用牛胎儿成纤维细胞CEF作为饲养层细胞培养孤雌囊胚,囊胚贴壁率为33.67±9.84%,显着差异于MEF组19.08±0.52%和PEF组23.47±5.69%(P<0.05),MEF和PEF在支持囊胚细胞贴壁方面差异不显着(P>0.05);用NCSU-23作为培养基培养孤雌囊胚,囊胚贴壁率为22.53±2.46%,显着高于DMEM组的10.41±1.75%和DMEM/NCSU-23组的12.05±2.23%(P<0.05)。综上所述,本地区8、9、10和4月份为卵巢采集用于实验的最佳时间;猪新鲜精液17℃恒温保存3d内精子活力保持在0.7以上,都能很好的用于体外受精;精卵共孵育6h对受精卵发育最好;电击参数1.5Kv/㎝、100μs、1DC或2DC和2.0Kv/㎝、60μs、1DC或2DC时,均能有效地激活体外成熟卵母细胞发育至囊胚;用CEF作为饲养层细胞,NCSU-23作为胚胎培养基,能够支持孤雌囊胚细胞至贴壁。
李竞宇[10]2016年在《猪受精及早期胚胎发育相关因子的筛选与功能解析》文中研究指明随着第一例试管婴儿出生,辅助生殖技术(ART)已经引起了越来越多的关注,但是其效率依然非常低下,所以,探索受精和早期胚胎发育的过程和机制显得尤为重要。猪作为最重要的大型哺乳动物生物医学模型之一,其生殖调控研究既可作为人类生殖生理和病理过程研究的参考,又可提供供体器官用于人类器官移植,因此我们对猪的受精和早期胚胎发育过程进行研究,来增加人们对其的认识。大量实验证明一些蛋白质和基因在生殖进程中发挥着重要作用,如卵母细胞成熟,受精,合子基因激活以及胚胎发育。随着高通量组学的发展,人们已经发现了许多特异性表达的蛋白和转录本,然而如何筛选出对受精与胚胎发育有重要作用的因子是我们急需解决的问题。最近长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)的研究正引起人们的广泛关注,lncRNA可以在多个层次上调控基因表达,参与机体的各种正常生理过程,并与多种疾病有密切关连,但其在哺乳动物早期胚胎发育上的功能机制尚未阐明,对猪早期胚胎中表达的lncRNA更是缺乏完整系统的鉴定和研究。故在本研究中,我们试图在蛋白和lncRNA两个方面对生殖发育过程进行探索。研究报道从卵的生发泡破裂到合子基因组激活(猪为4细胞期,小鼠为2细胞期,人为4细胞期)之前,基因组没有或只有极少的转录活性。考虑到lncRNA转录的时空特异性,故我们拟对体外受精和胚胎基因激活后发育分别进行关键蛋白和lncRNA的筛选和功能研究。主要研究结果如下:(1)通常情况下我们用体外成熟42h的卵母细胞(420)进行体外受精,但在前期工作中,我们已经证明了体外成熟33小时的卵母细胞(330)已经达到了核成熟。我们的研究发现,330体外受精的受精率,精子解聚率,原核形成率,卵裂率以及囊胚率都要显着高于420。通过蛋白质组学比较330和420共得到了 18个差异表达蛋白,其中11个在420中富集,7个在330中富集。生物信息分析显示,差异蛋白主要富集于卵母细胞成熟,染色体重塑,表观修饰,胚胎发现等方面。这表明330拥有更好的体外受精发育潜能与其特异的蛋白成分密切相关,所以我们从330中高表达的蛋白入手进行特异性蛋白的功能研究。(2)我们通过对MⅡ卵注射PDIA3抗体或PDIA3的mRNA来实现对母源PDIA3的扰低和过表达。结果显示当母源蛋白的表达受到抑制后,受精胚胎中精子解聚率显着降低,相反,过表达PDIA3会促进精子解聚。另外,我们发现,当采用DTT预处理的精子对PDIA3干扰组进行IS CI后,其精子解聚率恢复正常水平。这些结果表明母源P DIA 3可能是通过清除鱼精蛋白二硫键在精子解聚过程中发挥功能。(3)由于猪上基因注释非常不完整,导致目前很少有研究在猪上大量预测lncRNA,其与早期胚胎发育的关系的研究更是少之又少。本研究从公共数据库中下载了 30个猪各组织的转录组测序数据,用非依赖序列注释的编码能力预测软件(CNCI、CPAT)预测其编码能力,共获得了4776个新的lncRNA。加权基因共表达网络分析(WGCNA)显示每个发育时期都拥有与其显着相关的共表达基因模块。我们利用同一模块中已知基因的功能富集性分析(GO)来预测其对应的lncRNA的功能,富集结果符合胚胎发育各时期所需要的功能。本研究第一次利用基于序列信息预测lncRNA的方法对猪lncRNA进行了综合分析,并首次对猪lncRNA与早期胚胎发育的关系进行了研究。(4)研究显示猪的合子基因组激活发生在4-至8-细胞阶段,故我们在4-细胞对应的模块中挑选了 2个排名较高的lncRNA的功能进行了初步探索。通过PCR及测序结果的比对分析确定了我们预测的lncRNA的准确性。通过链特异性逆转录PCR确定了我们预测的lncRNA转录方向。通过特异性的引物进行PCR我们发现TCONS_00166370具有2种可变剪切。Realtime PCR实验表明,TCONS_00166370和TCONS_00020255都是4-细胞至桑葚胚特异性表达,并在8-细胞转录水平达到最高。通过注射特异性的锁核酸对两个lncRNA分别进行干扰,2种lncRNA的干扰均导致了胚胎无法发育至囊胚,多阻滞于4-细胞时期,其中TCONS_00166370的一个锁核酸片段干扰导致胚胎无法卵裂。
参考文献：
[1]. 影响猪体外受精因素的研究[D]. 卢晟盛. 广西大学. 2003
[2]. 猪卵母细胞体外受精条件的优化[J]. 曹筠青, 汪正铸, 王华, 张胜, 唐博. 中国兽医学报. 2017
[3]. 猪卵母细胞体外受精相关问题的初步研究[D]. 兰宗宝. 广西大学. 2007
[4]. 猪体外生产胚胎玻璃化冷冻保存的研究[D]. 葛立军. 南京农业大学. 2007
[5]. 猪胚胎体外生产技术的初步研究[D]. 吴彩凤. 南京农业大学. 2008
[6]. 精子载体法制作转基因试管猪胚胎的研究[D]. 徐飞良. 湖南农业大学. 2006
[7]. 猪卵母细胞与胚胎冷冻保存研究[D]. 王昭凯. 南京农业大学. 2006
[8]. 猪卵母细胞OPS冷冻保存与体外受精的研究[D]. 杨喜. 内蒙古农业大学. 2006
[9]. 猪胚胎体外生产和孤雌囊胚发育能力的检测[D]. 陈涛. 安徽农业大学. 2009
[10]. 猪受精及早期胚胎发育相关因子的筛选与功能解析[D]. 李竞宇. 东北农业大学. 2016
标签：畜牧与动物医学论文; 体外受精论文; 胚胎发育论文; 卵母细胞论文; 冷冻胚胎论文; 精子获能论文; 畸形精子论文; 冷冻精子论文; 精子抗体论文; 囊胚论文; 胚胎论文;