杨国强 苗 旺 范益民
山西医科大学第一医院神经外科 山西太原 030001
摘要：目的 研究三七总皂甙对大鼠脊髓损伤后运动功能及神经生长导向因子Netrin-1表达的影响。方法 采用改良Allen’s法构造Wistar大鼠脊髓损伤模型，分为生理盐水组（PBS组）、三七总皂甙组（PNS组），并以损伤后1、3、5、7、14d作为观察时点，在每个时点各组随机选择8只，先行斜板试验和动物行为学BBB评分运动功能评分，然后处死大鼠，取出T9节段脊髓，行HE染色观察损伤脊髓组织病理变化，用免疫组化染色检测Netrin-1蛋白表达分布情况。结果：三七总皂甙用药组大鼠斜板式验和BBB运动功能评分均明显优于对照组，两组间的差异有统计学意义（P<0.05），三七总皂甙用药组HE染色发现脊髓组织病理学改变明显轻于对照组；SCI后各组均发现Netrin-1表达，但三七总皂甙用药组Netrin-1表达强度高于对照组（P<0.05）。结论：三七总皂甙可有效缓解脊髓损伤后继发性损害，促进神经导向因子Netrin-1的表达，并延长其表达时程，提示其可能促进脊髓损伤早期修复及轴突的定向再生。
关键词：三七总皂甙；脊髓损伤；Netrin-1
Abstract：Objective To investigate after Panax Notoginseng Saponins（PNS）therapy changes of neuroethology and expression of nerve growth guidance factor Netrin-1 spinal cord injury after spinal cord injury.Methods To establish the moderate SCI model，80 female rats were randomly divided into 2 groups：physiological saline group（PBS group）and PNS group.Each group included 40 rats.After SCI model established 1，3，5，7，14d were chosen as the observation point.In each time-point，the functional tests were performed including the Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）locomotor rating scale and inclined plane tests in each 8 rats.Then rats were killed and T9 spinal cords were taken out for HE and immunohistochemistry tests.Results The results of BBB and inclined plane tests in PNS group were superior to those of physiological saline group.It was significantly different between two groups（P<0.05）.HE results showed that pathological changes in PNS group were slighter than the control group.Netrin-1 expression was found in both groups.Netrin-1 expression in the PNS group was significantly stronger than that in the control group （P<0.05）.Conclusions PNS may lighten the secondary lesion after SCI，increse the Netrin-1 expression and extend its expression schedule.It may play a key role in early nerve plerosis and Axon directional regeneration.
Key words：Panax Notoginseng Saponins；Spinal cord injury；Netrin-1
随着经济水平的提高，各种原因导致的脊髓损伤发病率逐年升高，脊髓损伤导致患者损伤节段以下运动、感觉功能障碍，进而出现劳动能力丧失、生活不能自理，也给家庭和社会带来沉重的负担[1]。目前关于脊髓损伤后治疗研究很多，有激素治疗、神经营养、组织细胞移植、基因治疗等，但效果均不理想[2]。近年来，临床应用中药治疗脊髓损伤取得了可喜成果，如三七总皂甙、川芎、三七、汉防己、人参等，但其潜在机制仍不明确[3，4]。本文拟通过建立大鼠脊髓损伤模型，早期给予三七总皂甙干预，利用斜板试验和BBB运动功能评分，观察三七总皂甙对损伤脊髓神经功能恢复情况，同时采用HE染色观察脊髓组织病理改变，同时使用免疫组化染色检测Netrin-1蛋白表达情况，进而探讨三七总皂甙治疗脊髓损伤的相关机制。
1.材料和方法
1.1 脊髓损伤模型制作及实验动物分组
本实验自2012年1月-2013年12月在山西医科大学实验动物中心进行。使用改良Allen’s撞击法制作大鼠脊髓不全损伤模型[5]。戊巴比妥钠腹腔麻醉，大鼠取俯卧位后固定，以T9棘突为中心，取背部正中切口，显露T8～10棘突及椎板。咬除T9棘突及全椎板，以脊髓为中心显露直径约3 mm圆形区，硬膜表面垫塑料垫片，用重10 g、直径2.5mm的圆柱状金属棒在玻璃管引导下从30 mm高处垂直落下，打击垫片，致T9脊髓急性中度挫伤，以鼠尾出现痉挛性摆动，双后肢猛烈收缩，而后迟缓性瘫痪为有效打击，改良Tarlov评分在1分以下。然后逐层缝合切口，损伤后 3d内每日肌注青霉素50000 u/kg，每12h按压膀胱协助排尿直至恢复自主排尿功能。
三七总皂甙组（PNS组）伤后30min，腹腔注射50 g/L三七总皂甙（100 mg/kg），2 h及4 h各用50 mg/kg，以后1次/d，剂量200mg/kg，连用12d。生理盐水对照组（PBS组）在相同时间点腹腔注射等体积生理盐水。
用改良Allen’s法制作大鼠脊髓不全损伤模型，以损伤后1，3，5，7，14d作为观察时点，在每个时点随机选择三七总皂甙治疗组大鼠8只，对照组8只，先行行为功能评分和斜板实验，然后处死大鼠后取出T9节段脊髓，固定，脱水及石蜡包埋，保存于-20℃冰箱备用。
1.2 实验试剂及仪器
清洁级健康成年雌性Wistar大鼠80只，体重200g～220g，由山西医科大学动物实验中心提供。饲养环境温度22℃～25℃，相对湿度50%，分笼喂养。三七总皂甙（昆明制药股份有限公司，批号：980705，规格：100mg/ml）。羊抗大鼠Netrin-1 多抗和过氧化物酶标记的兔抗羊二抗均购自美国Sigma公司。
1.3 斜板试验
将大鼠头朝左横放在改良Rivlin斜板上，从水平位置起逐渐增大角度，以大鼠能够在板上停留5 s而不跌落的最大角度作为所得评分，重复3次取其平均值作为最终结果。
1.4 动物行为学观察及脊髓功能评定
BBB评分法是将动物置于平坦不滑，光线充足的桌面上观察后肢各关节的活动状况，并对其进行功能评分，观察者为熟悉评分标准但非本组的实验人员。损伤后1，3，5，7，14d，在两名未知情者利用BBB 行为评分法对大鼠进行行为学检查。评分标准0-21。最小值为0分，表示神经行为功能完全丧失；最大值为21 分，表示行为功能完全正常。
1.5 HE染色
腹腔麻醉大鼠后剖胸，心脏插管，先灌注生理盐水约200 ml冲洗（至流出液澄清），再用4%多聚甲醛PBS（4℃，pH7.4）约200 ml灌流固定，完整取出损伤区脊髓（T9脊髓节段），投入相同固定液中再继续固定12h。将损伤段T9段脊髓及损伤上下段各约0.5cm常规石蜡包埋，5μm连续切片，用于HE染色和免疫组织化学检测，光镜下观察和记录损伤脊髓的组织病理学情况。
1.6 免疫组化检测
将石蜡包埋后切片的组织经过载玻片防脱片剂处理、切片脱腊和梯度酒精脱水等处理后，依次滴加羊抗大鼠Netrin-1多抗和过氧化物酶标记的兔抗羊，以及试剂SABC（链酶亲和素—生物素—过氧化物酶复合物），20-37℃20分钟。PBS（pH7.2-7.6）洗5分钟×4次；使用DAB显色试剂盒（AR1022）显色并观察，各组中每只大鼠脊髓灰质前角、后角、中央管各取相同个数高倍镜视野，并将所有图像经Metamorph Image System（V4.60）处理，通过对平均灰度值的分析，测定Netrin-1在不同区域的表达情况。
1.7 统计学分析：
采用SPSS19.0进行统计分析，各组定量资料用 表示，不同组别各定量指标的比较采用析因设计方差分析的方法。P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 斜板实验结果
如表1、2所示，PNS组与PBS组不同时间点上的两两比较结果显示，第1天两组的斜板实验评分无差别之外（P>0.05），而其后各时间点上两组的评分均分差别均有统计学意义（P均<0.05），且三七总皂甙组斜板实验评分高于生理盐水组。
表1 SCI大鼠斜板实验评分（ ）
图1 对照组与治疗组BBB评分
2.3 组织形态学观察
HE染色显示对照组术后第1d后即开始出现T9脊髓上下段组织水肿液化坏死。部分神经细胞核固缩、变性，轴索肿胀，瘢痕组织增生；损伤后7 d 脊髓坏死向上下段延伸。14d时T9脊髓上下由瘢痕组织连接。而PNS组，术后第1、7 d脊髓水肿、出血、炎性细胞浸润、胶质细胞增生减轻；神经元核固缩、变性、灰质中囊腔较对照组减少；残存神经元数量较对照组增多；且神经元形态尚完好丰满，轮廓清楚，胞体无明显皱缩，脊髓组织空腔相对较少，神经纤维增多且结构较为完整，排列较整齐；损伤后14d神经纤维结构较紧凑，细胞增殖明显。这提示三七总皂甙可能通过促进损伤脊髓神经纤维的有序再生，提高损伤脊髓组织的结构及功能修复。
2.4 Netrin-1分析结果
由表4、5可知，用药组与对照组不同时间点上的两两比较结果显示，除了第1天两组大鼠体内的Netrin-1含量无差别之外（P>0.05），其余各时间点上两组大鼠体内的Netrin-1含量差别均有统计学意义（P均<0.05）。这提示三七总皂甙可早期促进Netrin-1的表达并且持续时间延长。
表3两组Netrin-1免疫组化结果（图1 对照组与治疗组BBB评分）
*表示与同时间点对照组相比，P<0.05.
3.讨论
三七总皂甙是从我国传统珍贵药材三七中提取出来的主要成分，临床常用来治疗心脑血管、中枢神经系统等疾病[6，7]。三七总皂甙可阻断钙离子内流，抑制血小板聚集与抗脂质过氧化，进而扩张痉挛血管；增加血流量，改善微循环[8，9]。临床上很大比例脊髓损伤患者原发性损伤并未造成脊髓完全性功能丧失，但随后出现的继发性损害，包括损伤区域的缺血缺氧，炎性反应，残存神经元的凋亡，胶质瘢痕大量增生，均导致轴突定向生长、突触重建障碍。近年来，有学者发现三七总皂甙能促进脊髓损伤后的背核神经元和红核神经元的存活[10]。赵东旭等发现人参皂甙在脊髓损伤早期可抑制神经元的继发性损伤以及保护残存神经元的传导功能[11]。但是其潜在机制鲜有报道。
本实验通过改良Allen’s法构建大鼠脊髓损伤模型，并在术后给予三七总皂甙，发现SCI后7d 和14d用药组斜扳试验评分、BBB评分均高于生理盐水对照组（P＜0.05），这提示三七总皂甙能改善脊髓损伤后大鼠的后肢运动功能。HE结果显示三七皂苷治疗组脊髓损伤后水肿坏死、炎性浸润等病理变化减轻，提示它可能通过减轻脊髓损伤后炎性反应，改善局部微循环障碍及缺血缺氧。
本研究使用免疫组化检测Netrin-1的表达，结果显示对照组Netrin-1 1d时开始少量表达，3d 上升，7d 达高峰，14d 已明显减弱，提示脊髓损伤后早期Netrin-1蛋白表达呈一过性升高，而三七皂苷治疗后Netrin-1表达的增加在伤后1d即已明显，5d达高峰，这种作用一直至7 d，14d Netrin-1表达仍显著高于对照组（P＜0.05）。这表明三七总皂甙不仅可以上调Netrin-1表达，而且还可以促使Netrin-1表达提前。Netrin-1最初由Serafini提取，属于神经突起生长诱向因子家族，在脊髓神经传导通路的构建中发挥着重要的导向作用[12，13]。它能够诱导发育的轴突生长较长的距离到达靶细胞，同时也促进血管内皮细胞增殖、迁移和粘附的功能，促进血管新生[14]。刘宏志等通过观察脊髓损伤大鼠组织形态学变化与不同时点的Netrin-1表达发现在脊髓损伤后轴突导向分子Netrin-1呈一过性表达，且这种表达的变化与脊髓的修复程度均具有时序性[15]。
综上所述，本实验显示三七总皂甙可提高损伤脊髓的修复能力，改善脊髓损伤大鼠的后肢运动功能，它可能通过使Netrin-1长时程、高表达并使其表达峰值前移，进而抑制胶质细胞形成的瘢痕组织，帮助轴突穿越脊髓损伤区域沿正确路径生长并建立准确的突触联系，这将为三七总皂甙治疗脊髓损伤提供部分分子神经生物学理论依据，但其相关的调控机制仍需进一步深入研究。
参考文献：
[1]Nas K，Yazmalar L，Sah V，Aydin A，Ones K.Rehabilitation of spinal cord injuries[J].World J Orthop，2015，6（1）：8-16.
[2]Estrada V，Muller HW.Spinal cord injury - there is not just one way of treating it[J].F1000Prime Rep，2014，6（10）：84.
[3]王善金，夏英鹏，张学利.脊髓损伤的中药治疗研究进展[J].中医正骨，2008，20（2）：71-72.
[4]Fan LH1，Wang KZ，Cheng B，Wang CS，Dang XQ.Anti-apoptotic and neuroprotective effects of Tetramethylpyrazine following spinal cord ischemia in rabbits.BMC Neurosci. 2006 Jun 14；7：48.
[5]张超，冯世庆，刘燊，等.改良ALLEN法胸椎开窗制备大鼠脊髓损伤模型[J].中华实验外科杂志，2013.30（7）：1529-1531.
[6]刘景臣，尹飞，赵刚，等.人参皂甙治疗脊髓损伤的实验研究[J].中国老年学杂志，2000，20（5）：303-305.
[7]Zhou N，Tang Y，Keep RF，Ma X，Xiang J.Antioxidative effects of Panax notoginseng saponins in brain cells.Phytomedicine. 2014 Sep 15；21（10）：1189-95.
[8]段寅慧，吴敏.三七总皂苷药理研究及临床应用进展[J].中医药信息，2014，31（2）：108-110.
[9] Liu HZ，Liu ZL，Zhao SP，Sun CZ，Yang MS.Protective mechanism of Panax notoginseng saponins on rat hemorrhagic shock model in recovery stage.Cell Biochem Biophys. 2014 Dec；70（3）：1719-24.
[10]周雯，曾园山，张伟，等.三七总皂甙对大鼠脊髓损伤后背核和红核神经元存活的影响[J].解剖学研究，2007，29（2）：97-100，114.
[11]赵东旭，袁洪萍，朱庆三，等.人参皂甙对大鼠脊髓损伤的实验研究[J].中国实验诊断学，2009，13（1）：35-37.
[12]Serafini T，Kennedy TE，Galko MJ，Mirzayan C，Jessell TM，Tessier-Lavigne M.The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C[J].elegans UNC-6，Cell，1994，78（3）：409-24.
[13]Leyva-Díaz E，del Toro D，Menal MJ，Cambray S，Susín R1，Tessier-Lavigne M，Klein R，Egea J，López-Bendito.G6FLRT3 is a Robo1-interacting protein that determines Netrin-1 attraction in developing axons.Curr Biol. 2014 Mar 3；24（5）：494-508.
[14] Winkle CC，McClain LM，Valtschanoff JG，Park CS，Maglione C，Gupton SL.A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching.J Cell Biol. 2014 Apr 28；205（2）：217-32.
[15]刘宏志，李佐文，杨永利.脊髓损伤大鼠组织形态学变化与不同时点的Netrin-1表达[J].中国临床康复，2005，9（14）：98-99，插图14-5.
论文作者:杨国强,苗旺,范益民
论文发表刊物:《健康世界》2015年13期供稿
论文发表时间:2015/11/16
标签：脊髓论文; 损伤论文; 皂甙论文; 大鼠论文; 评分论文; 对照组论文; 神经元论文; 《健康世界》2015年13期供稿论文;