李珊珊 唐艳梅 赵紫伟 许银凤（通讯作者）
（云南经济管理学院天然药物研究所 云南 昆明 650106）
【摘要】 目的:阐明姜状三七药材不同提取部位的指纹图谱特征峰所代表的化学成分及对凝血酶原时间试验（PT）中抗凝血活性药效贡献的大小，表征姜状三七的药效物质基础。方法: 采用HPLC法建立姜状三七药材不同提取部位指纹图谱，以不同提取部位对PT试验的时间指标的影响研究其抗凝血作用，采用灰色关联分析法建立谱效联系，分析明确了成分化学物质与抗凝血活性作用贡献程度的大小。结论：姜状三七不同提取部位对抗凝血作用的关键物质基础是R1、Rb1、Rd和13号色谱峰物质成分。用灰关联度分析色谱峰对药效功效的大小，最后能为科学评价姜状三七不同提取部位抗凝血作用提供理论基础。
【关键词】 姜状三七；抗凝血；谱效关系
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）32-0376-02
姜状三七为五加科人参属植物姜状三七Panax zingiberensis C.Y.Wu et K.W.Feng的根及根茎。味苦，性温，有散瘀、止血、定痛等疗效，具有治疗内伤出血、产后血晕虚伤咳嗽贫血等作用。
中药共性技术的群体成分“宏观分析”质量评价模式成为现阶段中药现代化研究的主流方式之一，使指纹图谱中化学成分体现相应的药效，并能阐明指纹图谱特征与药效的相互关系，确定药效物质基础。本研究从姜状三七不同极性溶剂提取部位的HPLC指纹图谱与抗凝血药效关系入手，对不同极性溶剂提取部位的抗凝血活性进行评价，通过灰关联度分析，初步探明与姜状三七抗凝血作用关联度的化学成分群。
1.仪器、试药及材料
1.1 仪器
Ultimate 3000超高效液相色谱仪（LPG-3400SD四元泵，WPS-3000自动进样器，VWD-3100紫外检测器，TCC-3000RS柱温箱），AB265-S十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），KS-600D超声提取器（宁波科生仪器厂），中药色谱指纹图谱计算机辅助相似性评价系统软件（中国药典委员会推荐），BUCHIR-200型旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）。
1.2 试药
三七总皂苷对照品（批号：110870-201002），购于中国药品生物制品鉴定所。
乙腈（美国Fisher公司，色谱纯），纯净水（PT-RO-SHY10L，迈瑞生化科技），甲醇（美国Fisher公司，分析纯）。
法华林钠购自美国西格玛公司；标准质控血浆lenel1购自德国Dade Behring Marburg公司；凝血酶原时间测定试剂盒购自北京世帝科学仪器公司
1.3 材料
10批药材购自道地产区不同区域的栽培品，并按现行版药典三七有关项下进行各类鉴别与检测，均符合正品三七药材质量控制规定。在前期指纹图谱研究中，阐明云南金平、景东和砚山的姜状三七质量为优。则本研究中以此三地的药材样品为代表，作为不同极性溶剂提取部位的研究对象。
1.4 预实验溶剂筛选
通过预实验多溶剂及混合比例有机溶剂HPLC图谱峰数比对，确认以水、乙醇、乙酸乙酯为提取溶剂的姜状三七极性部位作为本实验研究对象，深入分析。
2.方法与结果[1]
2.1 色谱条件
Lichrospher ODS-C18柱（4.6×250mm,5um）；流动相：A：水，B：乙腈，洗脱梯度为：0～20min 乙腈20%、20～45min 20%～46%、45～55min 46%～55%、55～60min 55%；检测波长：203nm；柱温：30℃；进样量：10µL；流速：1.5mL/min。
2.2 供试品溶液的制备
取姜状三七药材10g，加入10,8,6倍不同溶剂（水、乙醇、乙酸乙酯、石油醚）分别提取60,45,30min，提取液离心合并，减压浓缩，所得残留加70%甲醇溶解后溶至10mL容量瓶中，既得不同溶剂取液部位供试品溶液（浓度为20mg/ml）,过0.45µm微孔滤膜，备用。共制备12份样品（金平、景东和砚山个4份）。
2.3 对照品溶液的制备
取三七总皂苷对照品50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用70%甲醇溶解并稀释至刻度，即得。
2.4 精密度考察
取8号姜状三七水提取供试液，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。结果指纹图谱相似度的精密度RSD 0.23%。各主要色谱峰相对保留时间RSD在0.00%～0.30%。表明仪器精密度良好。
2.5 重复性考察
取8号姜状三七样品共6份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，进样，记录色谱图。结果指纹图谱相似度的RSD 0.52%。各主要色谱峰的相对保留时间RSD在0.00%～1.64%。表明此分析方法重复性良好。
2.6 稳定性考察
取同一供试品溶液，按2.1项下色谱条件，分别在0,4,6,8,12,24,48h进样，记录色谱图。结果指纹图谱相似度的RSD 1.77%。各主要色谱峰的相对保留时间RSD在0.00%～2.06%，表明供试品溶液在48h内较稳定。
2.7 测定法
分别精密吸取三七总皂苷对照品溶液、不同溶剂提取液适量，注入色谱仪，记录峰面积。
2.8 色谱峰的归属
分别精密吸取各供试品溶液10µL，进样分析，测定姜状三七提取物与各皂苷的HPLC图谱（图1）。色谱峰匹配及其数据匹配后，建立了供试品指纹图谱的共有模式。确认14个共有峰（图2）。
2.9 凝血酶原时间（PT）测定实验[2]
2.9.1实验样品制备
试验样品组：分别量取不同批次姜状三七样品溶液蒸干，用磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液溶解(pH 7.4; 0.01 M)，配制成浓度为20mg/mL的样品，备用；
阳性对照:华法林钠(l0mg/mL, PBS溶解)；空白对照：PBS溶液。
制备血浆样品：使用超纯水溶解冻干混合人血浆(Ci-Trol level 1)，现用现配。将200µL己溶解的冻干血浆与100µL样品混合形成血浆混合物。
2.9.2凝血酶原时间(PT)测定试验 将试剂盒中的PT试剂按照规定剂量用缓冲溶液复溶，置于LG-PABER-I型血小板-凝血因子分析仪的37℃试剂预温孔内，预温时间大于10min,使用前摇匀。在测试杯中加入测试珠，然后将待测血浆混合物加入测试杯中。同时启动仪器，进行自动测试。每个样品平行测定4次，记录结果。通过统计软件检测实验数据在统计学上的显著性差异（表1）。
表1 姜状三七不同溶剂提取物PT实验测定结果
注：与空白对照比较*P<0.05；与阳性对照比较△P<0.05
2.10 姜状三七不同极性溶剂提取物的谱效分析
2.10.1确定反映系统行为特征的参考数列和影响系统行为的比较数列；
2.10.2对参数和比较数列进行无量纲化处理，进行初值化法。
2.10.3求参考数列与比较数列的灰关联系数，通过下列公式计算元素系数。
2.10.4计算关联序
2.10.5排关联序 同一参考数列以关联大小顺序排列，可以反映各个比较数列对参考数列关系大小。本研究中，各个特征色谱峰对抗凝血贡献的大小（表2）。结果表明，关联度大于0.6的色谱峰有第2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13号峰，其化学物质群对姜状三七抗凝血功效起共同作用，而关联度大于0.9的有第2（R1）、8(Rb1)、12(Rd)、13号色谱峰，其与抗凝血效果关联度最大，同时与13号成分关系紧密。
表2 各色谱峰与抗凝血功效关联度结果
3.讨论
灰关联计算方法是灰色系统分析技术的一种，按因素发展变化程度来衡量事物间的一种关联程度的方法。在研究中，灰关联度分析法已经作为现代化中药功效物质基础研究的通用手段。本研究的结果中可知，姜状三七不同极性溶剂提取物大极性物质与总皂苷与抗凝血作用相关，即R1、Rb1、Rd和13号色谱峰物质对其功效贡献程度最大，同时在后期能有针对性的展开提取分离，中药临床基础评价等后续研究。
【参考文献】
[1] 杨英来，崔方，吴国泰等.当归药材不同提取部分的指纹图谱分析.中国实验方剂学杂志.2014（20）13:55~60.
[2] 梁健钦，王剑，熊万娜等.基于灰色关联分析的芒果叶提取物抗炎作用的谱效关系.中国实验方剂学杂志.2015（1）21:121~125.
[3] 李静，王璇，马付勇，等.影响中药三七HPLC指纹图谱的若干因素[J].中国天然药物，2004（1）：34.
[4] 谢相贵，贺福元，石继连.总量统计矩与主成分分析对红花HPLC指纹图谱的考察[J].中国实验方剂学杂志. 2012,18（18）：64.
基金项目：云南省教育厅科学研究基金项目：姜状三七不同溶剂萃取部位的“谱-效”学研究,编号:2014Y621
论文作者:李珊珊,唐艳梅,赵紫伟,许银凤
论文发表刊物:《医药前沿》2015年11月第32期
论文发表时间:2016/5/6
标签：色谱论文; 图谱论文; 溶剂论文; 指纹论文; 溶液论文; 数列论文; 部位论文; 《医药前沿》2015年11月第32期论文;