1、昆明医科大学第一附属医院 云南 昆明 650032
2、大理大学附属医院 云南 昆明 650032
基金项目: 本课题受云南省校联合基金资助( 2011FB173)
【摘要】目的：探讨姜黄素对前列腺癌PC-3细胞裸鼠移植瘤的作用机制。方法：通过裸鼠皮下接种前列腺癌PC-3细胞建立人前列腺癌雄激素非依赖性裸鼠移植瘤模型，成瘤后随机分为2组，每组6只。姜黄素组：腹腔注射姜黄素50mg/kg，每天1次，共4 w；对照组：腹腔注射等体积的含6% (体积分数)聚乙二醇和含6% (体积分数)无水乙醇的水溶液。取肿瘤称重，并对瘤组织进行组织病理学检查，免疫组化及western blotting检测FASN、Bax蛋白的表达变化。结果：姜黄素可明显抑制前列腺癌PC-3细胞皮下移植瘤生长，姜黄素使肿瘤组织中脂肪酸合成酶FASN的表达水平降低，而使Bax的表达水平升高。结论：：姜黄素可能通过下调FASN及上调Bax的表达抑制前列腺癌PC-3移植瘤的生长。
【关键词】 姜黄素；前列腺癌；FASN；Bax；移植瘤
【中图分类号】R254【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)09-0353-02
ABSTRACT: Objective: To explore the mechanism of curcumin in the human prostate cancer cells PC3 xenografted tumor in nude mice. Methods: Human prostate cancer PC-3 cells cultured in vitro were subcutaneously inoculated into nude mice to establish transplanted tumor model. All tumor-bearing mice were randomly divided into 2 groups, there was 6 nude mice in each group: curcumin group, daily intraperitoneal injected(25mg·kg),a total of 4 weeks. Control group: intraperitoneal injection volume containing 6% (by ??volume) aqueous solution of polyethylene glycol containing 6% (volume fraction) ethanol. The tumor weights inhibition rate were calculated, H &E stain was done to examine the difference in histopathology between control team and administ curcumin group team, The expression of FASN、Bax in tumor tissue was determined with immunohistochemical and western blotting methods. Results: Curcumin can inhibit prostate cancer PC-3 cells to tumor growth, obviously． The curcumin decreased the expressionof FASN and increased the expression of Bax in tumor tissues. Conclusion:Curcumin may inhibit the growth of prostate cancer PC-3 xenograft tumor by down-regulating fatty acid synthase (FASN) and increase the expression of Bax.
Key words : Curcumin; prostate cancer; FASN; Bax; Xenograft tumor
前列腺癌( PCa)在欧美等发达国家和地区是男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率居各种癌症的第二位；在我国前列腺癌发病率低于西方国家，但近年来呈迅速上升趋势。姜黄素（Curcumin）是姜黄的主要活性成分，有较广泛的生物活性，可在体内、外抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡[1]。姜黄素具有诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡的作用[2]。本实验主要是研究姜黄素对PC-3前列腺癌裸鼠移植瘤的生长以及对FASN、Bax蛋白的影响，探索姜黄素治疗前列腺癌可能的机制。
材料与方法
1.1 材料来源
PC-3前列腺癌细胞株购于中国科学院昆明动物研究所细胞库。1640培养基、胎牛血清购于美国HyClone公司。PVDF膜购于Millipore公司；一抗购于Protein Tech；羊抗兔二抗IgG-HRP购于Invitrogen公司；SPF级雄性（BALB/c）裸鼠（4 周龄，体重16～18g）购于北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于昆明医科大学动物实验中心。姜黄素购于美国Sigma公司，用6% (体积分数)聚乙二醇和含6% (体积分数)无水乙醇的水溶液溶解。
1.2 前列腺癌PC-3细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立
人前列腺癌PC-3前列腺癌细胞株使用含10%胎牛血清1640培养液，置于5%CO2、37℃培养箱中培养至对数生长期后，将细胞数调整为1×107个/ml，用1ml注射器于裸鼠右前肢腋窝外侧皮下接种0.1ml/只（约1×106 个细胞）。7d后裸鼠皮下均出现移植瘤。
1.3 实验方法
将成瘤的12只裸鼠用随机数字法分为实验组和对照组，每组6只。实验组：将姜黄素溶解于6% (体积分数)聚乙二醇和含6% (体积分数)无水乙醇的水溶液, 腹腔注射100mg/kg。对照组：腹腔注射等体积的含6% (体积分数)聚乙二醇和含6% (体积分数)无水乙醇的水溶液；上述药物一次注射均为0.2ml，注射每天一次，共注射四周时间。停药后采用颈椎脱臼法处死裸鼠，剥出肿瘤保存进行后续实验。
1.4 观察指标：
（1）计算抑瘤率：处死裸鼠后剥出瘤块，用电子天平秤瘤重，抑瘤率=（对照组平均瘤重-用药组平均瘤重）/对照组平均瘤×100%。
（2）对肿瘤组织按常规进行苏木精－伊红( HE) 染色观察，切取移植瘤组织标本，浸泡于10%福尔马林,常规HE:染色，显微镜下观察瘤组织病理形态。
（3）免疫组化法检测FASN、Bax蛋白的表达。肿瘤标本石蜡包埋切片，脱蜡后应用3%H2O2封闭10 min，血清封闭。分别加一抗FASN、Bax。4℃孵育过夜，再加二抗室温孵育30min。DAB显色；苏木精复染，显微镜下观察两组移植瘤细胞FASN、Bax的表达情况。
（4）western blotting检测FASN、Bax蛋白的表达。取50mg肿瘤组织提取组织总蛋白，蛋白定量后检测FASN、Bax的表达。经12% SDS2PAGE胶分离后，电转至PVDF膜上。经封闭后室温孵育一抗2 h, TBST洗后加入相应二抗孵育1h，膜经TBST洗后与ECL发光检测剂结合，经X片压片曝光后显示结果。
1.5 统计学方法：用SPSS11.0软件处理系统进行统计学分析。实验数据以( x ± s) 表示，采用t检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义标准。
1.6 Western blotting结果分析：结果使用Quantity One 4.6 software (Bio-Rad)对Western-Blot条带进行半定量，分析其读数，最后以待测一抗/β-actin作为该蛋白的相对表达量，根据读取条带数据，生成蛋白表达量柱状图。
2 结果
2.1 抑瘤率的比较：
3 讨论
目前对于晚期非激素依赖性前列腺癌患者的治疗仍然缺乏有效治疗药物 [3]。姜黄素是从中药姜黄的根茎中提取出来的一种脂溶性酚类色素，1815年姜黄素由Vogel和Pelletier首次分离得到[1]。目前对于姜黄索抗肿瘤的作用的研究受到了越来越多的关注。姜黄素可以抑制体内外多种肿瘤细胞的生长，美国国立肿瘤研究所已将其列为第三代癌化学预防药[4]。本实验选择PC-3前列腺癌细胞株成功建立了裸鼠移植瘤模型后，给予腹腔注射姜黄素后取肿瘤组织检测肿瘤病理变化，免疫组化及western blotting检测FASN、Bax蛋白的表达变化，探讨姜黄素诱导前列腺癌细胞凋亡的可能机制。
脂肪酸合成酶（FASN）是生物体内源性脂肪酸合成的关键酶，位于细胞胞质内，为大分子蛋白复合物。细胞内脂肪酸的合成可通过饮食摄入外源性的脂肪酸，通过合成内源性的脂肪酸。脂肪酸合成通路与肿瘤细胞的增殖有关，FASN在许多肿瘤中的过表达表明FASN抑制剂在抗肿瘤方面的潜在作用，FASN已经作为一个有吸引力的癌症治疗靶点[5、6]。FASN抑制剂浅蓝菌素通过抑制FASN对前列腺癌细胞的生长产生抑制作用[7]。本实验结果表明姜黄素可以通过抑制前列腺癌中FASN的表达，抑制诱导前列腺癌细胞的凋亡。
Bax是重要的细胞凋亡调控基因，是Bcl-2基因家族中的一个重要的成员，具有促进细胞凋亡的作用。Bax是从人和鼠B细胞中发现的与Bcl-2共同沉淀的一种蛋白质(即将Bcl-2相关X蛋白质．Bcl-2 associated X protein，简称Bax)分子量为21KD，由192个氨基酸残基组成，存在于胞质中。当细胞受到刺激时Bax可以转移到线粒体外膜上，并与Bcl-2，Bcl—xl等结合形成异源二聚体，此时Bax功能受到抑制。当Bax与Bax形成同源二聚体时，能够导致细胞色素C从线粒体溢出或导致线粒体功能异常，并启动线粒体介导的细胞凋亡。研究表明Bax的表达与瘤细胞凋亡指数呈正相关[8，9]，本实验说明姜黄素对Bax表达有上调作用。
实验结果表明姜黄素抑制PC-3前列腺癌裸鼠移植瘤的生长。姜黄素主要是可能通过下调PC-3前列腺癌细胞中FASN的表达并上调Bax的表达诱导前列腺癌细胞的凋亡，达到抑制肿瘤生长的作用。因为PC-3前列腺癌细胞株为激素抵抗性前列腺癌细胞株，实验为姜黄素治疗雄激素非依赖性前列腺癌提供了动物实验的基础。
总之，本研究从动物实验进一步验证了姜黄素的诱导肿瘤细胞凋亡的机制，姜黄素较其他脂肪酸合成酶抑制剂在临床试验中有明显的优势，随着对姜黄素在肿瘤治疗方面不断深入、广泛地研究，其有可能成为一种高效、新型、低毒的抗癌药物，气在临床上酱油广泛的应用前景普遍。
参考文献
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Bax resist curcumin induced apoptosis and Bax reguirement is dispensable
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论文作者:李颢, 张爱建2, 张建华1,,申吉泓1,,刘孝
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年9月
论文发表时间:2016/11/2
标签：姜黄论文; 前列腺癌论文; 细胞论文; 肿瘤论文; 细胞株论文; 抑制论文; 脂肪酸论文; 《中国医院药学杂志》2016年9月论文;