（1上海三林康德社区卫生服务中心，中医科；2上海中医药大学附属曙光医院，感染科；上海200000）
摘要：目的探讨炎调方对脓毒症大鼠的作用机制。方法将SD雄性88只大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、炎调方组、对照组(炎调方减去大黄、芒硝)，采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症大鼠模型。术后分别于12h、24h、36h致死大鼠，测定血清IL-1β水平及观察各组肺病理切片的变化。结果血清方面：假手术组与正常组相比，血清IL-1β水平无统计学意义(P>0.05)；与正常组相比，12h模型组的血清IL-1β水平与24h的血清IL-1β水平比较升高 (P<0.05)；造模后12h炎调方组血清IL-1β水平和模型组对比，有显著降低(P<0.01)，差异在24h无统计学意义(P>0.05)；对照组(炎调方去掉大黄和芒硝)与模型组对比，12h和24 h均无统计学意义(P>0．05)；炎调方组血清IL-1β水平和对照组对比在12 h水平显著降低(P<0.01)，24 h但是未见明显差异(P>0.05)；肺病理切片方面：正常对照组及假手术组肺组织未见明显病理学损伤性变化。CLP术后12h,模型组的肺组织轻微充血，CLP手术后24h，与12h对比，模型组肺组织损害更甚，充血更明显，减方对照组肺组织病变情况较模型组无明显改变。炎调方组和模型组相比，病变范围略小。结论炎调方能明显下调脓毒症大鼠血清IL-1β水平，并且能减轻脓毒症大鼠肺组织损伤。
关键词:炎调方 脓毒症 肺病理切片
脓毒症（sepsis）是指由感染导致的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS），进一步发展可以成急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和脓毒症休克（septic shock），甚至可导致多脏器功能障碍综合征（MODS）[1]。严重的脓毒症患者和脓毒性休克目前仍然是作为ICU内患者死亡的主要原因，其病死率达2８％~５０％。脓毒症一直以来都作为危重病、急救医学领域临床和基础科研的难点和热点 [2]。本研究是通过经典的盲肠结扎穿孔(CLP)术制作脓毒症大鼠模型，以通腑活血法治疗脓毒症，通过检测大鼠部分炎症介质变化和肺组织的变化及观察大鼠的死亡情况，进一步探讨并丰富炎调方对脓毒症干预的效果研究，为诊疗脓毒症疾病的发展提供研究证据。
1 实验材料
1.1动物来源与分组 88只雄性SD大鼠，购自上海中医药大学的实验动物中心，购回后所有大鼠均作适应性饲养一周后随机分为正常组、假手术组、模型组、炎调方组、对照组（炎调方减去大黄和芒硝）。
1.2 药物炎调方组：玄参l5g，当归15g，生大黄10g(后下)，芒硝10g(冲)，桃仁10g，赤芍15g。对照组：玄参l5g，当归15g，桃仁10g，赤芍15g。中药均由上海曙光西院中药房提供。按常规的煎煮方法来煎煮，最后将芒硝充分溶解于药液中，将药液浓缩为含生药1.0 g／ml，放入4℃冰箱备用。对照组（炎调方减去大黄和芒硝）煎煮方法同前，药液被浓缩为含生药1.0g／mL，保存备用于4℃冰箱。
1.3 仪器 Multiskan MK3 酶标仪（赛默尔上海世飞仪器厂）；501C超级恒温水域槽（上海精宏实验设备公司）；台式离心机(microfuge lite)(Beckman 公司)；OLYMPLUS BH2 显微镜 （PHILIP）；石蜡全自动切片机(德国CUT6062切片机)；低温冰箱（-70℃）(Forma scientific公司)。
2 方法
2.1 脓毒症模型的制备
参照相关文献[3-5]，采用盲肠结扎穿孔(cecal ligationand puncture，CLP) 法制造脓毒症大鼠模型，实验鼠术前禁食12小时，腹腔注射2﹪的戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉，安尔碘消毒皮肤，沿中下腹做大约1.5cm的切口，提出盲肠，用4号线把盲肠根部结扎，将18号针把盲肠穿通3次后将肠还纳于腹腔，并逐层缝合皮肤。术后注射生理盐水（30mg/kg）于皮下抗休克。待麻醉清醒后可自由活动、喝水、进食。假手术组仅仅切开腹腔并翻动肠道，不去结扎穿刺，剩下的操作同模型组。
2.2 分组 按随机方法将实验大鼠分成5个组，正常组8只，麻醉并腹主动脉取血和肺部组织后处死；假手术组8只，麻醉后开腹翻动肠道，关闭腹腔，12h后麻醉并腹主动脉取血和肺部组织后处死；模型组24只，CLP术后12h、24h、36h分别麻醉然后腹主动脉取血和肺部组织后处死，每个组各8只；炎调方组，将炎调方于术前灌胃（9.9g/kg），每天一次，连续3天，灌胃3次后2h予以造模，CLP术后各时间点分别麻醉并腹主动脉取血和取肺部组织后处死，每个组各8只；对照组（炎调方减去大黄和芒硝）24只，该方造模前灌胃（9.9g/kg），每天一次，连续3天，灌胃三次后2h予以CLP造模，术后各时间点分别麻醉和腹主动脉取血致死，每组各8只。
2.3 标本采集与检测
腹腔注射2％戊巴比妥钠(40mg／kg)麻醉大鼠，安尔碘消毒皮肤后逐层开腹，予以腹主动脉抽血．取血后静置30min于室温下，离心（3000转／rain15min）后血清存于4℃冰箱，备测白细胞介素1β（IL-1β），然后快速打开大鼠左右胸腔，取出左右两边肺叶。切取左肺和右肺的病理组织，左肺固定于福尔马林10％液体，酒精极度脱水，石蜡包埋并切片，常规HE染色，在光镜下对比肺组织的变化。右肺迅速置于液氮中备用，然后转入-70℃冰箱冻存。
3 统计学方法 统计软件用于SPSS 19.0，计量资料的数据以Mean±SD（x±S)来表示，采用单因素方差分析方法。（P<0.05是差异具有统计学意义）
4 实验结果
4.1 多组大鼠死亡情况观察
实验中,实验鼠共死亡19只（其中模型组8只，炎调方组4只，减方炎调方组7只），进入后续实验共69只。正常组、假手术组大鼠活动无异常。模型组的手术之后都有脓毒症严重现象，如手术结束后清醒推迟，呼吸变快明显，腹部向下膨隆，精神不振，少动等现象，剖开腹腔发现脓血和浑浊性恶臭液体，肠管可见肿胀，肺部明显淤血，CLP+减方对照组大鼠与模型组相比未见明显变化。CLP+炎调方组大鼠精神明显好于CLP组，术后表现较轻。
取材前，各组大鼠的死亡情况（只）(见表1)。正常组和假手术组全部存活，模型组12h,24h分别死亡2，5只（死亡率8.3％,35.7％），炎调方组12h,24h分别死亡1,2只（4.17％,13.3％），减方炎调方组12h, 24h分别死亡1,4只（4.17％,26.67％）。
4.2各组大鼠血清IL-1β的比较
正常组和假手术组比较时，血清IL-1β水平无明显差异，P>0.05。模型组较正常组造模后12h血清IL-1β水平即有明显升高，24h血清IL-1β水平较前回落，P <0.01，有统计学意义。炎调方组和模型组比较在12h血清IL-1β显著下降，p<0.01，差异有统计学意义，但在24h无明显差异，P>0.05，无统计意义。对照组（炎调方减去大黄和芒硝）与模型组对比在12h、24h均无统计学意义，p>0.05，炎调方组和其比较血清IL-1β显著下降，p<0.01，有统计学差异。（见表1）
4.3肺组织病理切片结果（HE染色,X100）
4.3.1 大体观察：正常对照组和假手术组外观呈粉红色，表面无充血。模型组12h和减方对照组12h肺组织较正常组和假手术组大，肺表面充血明显，色泽呈暗红色，切面较疏松。24h充血更加明显。炎调方组表面充血程度较模型组和减方对照组有所减轻。
4.4大鼠腹腔脏器比较
正常组和假手术组剖腹未见异常。模型组大鼠12h后略有腹部膨隆，剖开腹部时看见少许渗液在腹腔，肠腔肿胀，结扎的盲肠和周围粘连一起，24h模型组腹胀显著，在切开腹部时看见大量渗液于腹腔内，有严重恶臭味，肠腔水肿严重，并且和周边粘连明显，被穿刺结扎的盲肠变性坏死。减方对照组腔内血性渗液、肠管水肿和恶臭味等与模型组比较没有明显好转。炎调方组则发现腹腔渗液减少。（见表2）
5.分析与讨论
脓毒症是临床上一种常见的由感染而引起的重症，通常可以导致一系列的全身炎症的反应，病死率在后期很高。中医学中，脓毒症无相应的病名，但根据症状体征和疾病演变过程中，以发热、炎症反应为主要特点，脓毒症属于祖国医学的“温病”和“热病”的范畴 [6]。脓毒症的病因病机极其复杂，其中瘀血阻滞、毒热内蕴、腑气不通及正气不足是脓毒症主要病理基础，瘀血阻络则贯穿始终。而热、毒、痰、瘀既为脓毒症之病理产物，又为脓毒症之致病因素[7]。因此，通腑活血法切中脓毒症早期之根本病机。
中医学理论证实,肺为娇脏、肺与大肠表里联系，肺气壅塞，失于肃降气不下行，津不下达，可引起腑气不通，肠燥便秘，若大肠实热，传导不畅，腑气阻滞，也可影响到肺的宣降，出现胸满咳喘等症,这和大鼠模型中的脓毒症肺损伤的症象一样。本实验是采用经典脓毒血症模型组造模，大鼠CLP术后6h即出现精神倦怠、躁动、腹部膨隆、眼角分泌物增多、竖毛等表现，分别于造模后12h、24h、36h处死动物后剖腹可见腹腔积有血性渗液，盲肠肿胀变黑、粘连，肠管胀气等表现，与相关文献报道的脓毒症大鼠动物模型基本相同，符合脓毒症表现，说明制模成功。
许多实验发现，在脓毒症疾病初期细胞因子起了关键的作用，内毒素刺激经单核/巨噬细胞激活，炎症因子产生，瀑布样连锁机体炎症反应则形成[8]。本研究显示，血清IL-1β水平在CLP术后12h均显著高于正常组和假手术组，24h较前回落，但仍较正常组为高，有统计学意义。说明脓毒症炎症刺激下可以引起肺泡巨噬细胞释放炎性细胞因子，并参与脓毒症损害的经过，在促进机体的急性期炎症反应中起了关键作用。但是研究发现，促炎性细胞因子IL-1β在术后12h是缓慢下降的，脓毒症情况本来是应该好转，但是脓毒症大鼠造模后的情况及24h后大鼠的死亡率却大量增加，这种现象有可能是脓毒症末期有一些晚期炎症因子参加反应，也可能是因为炎症细胞因子提前释放有直接关系，这需要我们今后进一步研究。
本研究显示,与模型组相比，炎调方组大鼠死亡率最低，血清IL-1β促炎因子水平较其显著下降,统计学有意义；与模型组相比,炎调方组肺组织表面充血较清；剖腹取标本见腹腔渗液较模型组相比略少。去大黄、芒硝的减方对照组血清IL-1β水平则没有统计学意义，其肺组织病变情况也无明显变化，腹腔渗液、肠管水肿等较模型组也未见明显改善。
炎调方是当归、桃仁、赤芍、玄参、生大黄、芒硝六味草药配置成。该方泻下通腑和凉血活血滋阴合用，共奏通腑不忘活血，凉血不忘养阴之功效。临床研究发现，炎调方对脓毒症病患疗效明显。研究也证明，炎调方可以抗菌消炎和保护脏器靶器官，在炎症初期，炎调方干预有更明显的作用。对照组是炎调方减去具有泻下通腑作用大黄与芒硝，由桃仁、赤芍、玄参、当归活血凉血药组成。研究证实该方在减少脓毒症大鼠的死亡率和炎症的过度表达抑制作用没有作用，并且也没有发现可以明显保护脓毒症大鼠脏器靶器。因此，我们可以得出，大黄、芒硝在炎调方中起着至关重要的作用。
笔者提出了治疗脓毒症的基本思路为通腑泻肺法，本实验通过CLP术造模成脓毒症的大鼠模型,并用炎调方和去掉大黄和芒硝两味泻下作用的草药的对照组于大鼠灌胃,观察脓毒症大鼠的死亡情况、炎症介质的水平及肺组织病理学的研究证实具有畅通腑气和泻下积滞的大黄、芒硝在脓毒症中起了关键作用。大黄、芒硝在炎调方中是具有通里和攻下功用，可破血逐瘀，泻下攻击，推陈致新，涤荡肠胃，其通腑利肠泻肺实,使肺气宣发肃降,并且有清热解毒之功效,可以瓦解内毒素的网状结构。
在该实验中，炎调方治疗组大鼠多数出现了腹泻情况，这和我们在临床上应用时的情况是类似的。腹泻会造成水、电解质紊乱，甚至会造成血容量不足而影响体内循环功能。但是，腹泻也很有可能是作为炎调方中大黄、芒硝发挥通腑泻下作用，清除肠道内细菌和内毒素的一种非常重要的方式。所以，对于如何解决这个矛盾，使大黄。芒硝既可以发挥它们的疗效又尽量减少它们的副作用值得我们进一步研究。另外在本次实验中，由于大鼠CLP术后24h之后的死亡率较高，故该实验CLP术36h的实验数据未纳入本次统计中，今后应加大样本量避免这种情况发生。
总之，通过对脓毒症大鼠死亡情况的观察、炎症介质IL-1β水平的变化及肺组织的研究，本实验证实炎调方能够降低脓毒症大鼠的死亡率，减轻炎症反应和大鼠组织脏器损伤，这可能是大黄、芒硝的“通腑泻下”功效起至关重要的作用。本研究提示，在提高生存率和有效性方面，以肠治肺可作为中医药防治脓毒症的可行思路，与临床上经常使用的复苏与支持疗法配合运用，可能取得更好地效果。
参考文献：
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论文作者:张燕婷1,朱佳琳1,李淑芳2,熊旭东2
论文发表刊物:《医师在线》2019年5月9期
论文发表时间:2019/9/23
标签：大鼠论文; 模型论文; 芒硝论文; 血清论文; 大黄论文; 炎症论文; 腹腔论文; 《医师在线》2019年5月9期论文;