摘要：目的：通过对现有的免疫组织化学双重标记方法(双标)的改进，探索一种稳定且易于辨认的显色方法，便于在普通光学显微镜下观察肺腺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞的分布情况。方法：改进的免疫组织化学双标染色分别使用二抗链接的碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶作为底物显色酶，底物分别选用固红(AP-Red)和二氨基联苯胺(DAB)，在显微镜下次序控制双标显色，观察肺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞的分布情况。结果：免疫组织化学双重标记中第一标记AP-Red的红色与第二标记DAB的棕黄色反差大，背景低，易于分辨。两种颜色标记的同一部位呈现砖红色，易于表示双标部位。统计显示在肺腺癌组织标本中，以M2型肿瘤相关巨噬细胞为主，约占80%。结论：改进后的显色系统建立了简便、可靠的免疫组织化学双重标记新方法。标记结果可以清晰稳定显示肿瘤相关巨噬细胞在肺腺癌组织中分布情况，便于进一步研究其在肺癌发生、发展中的作用。
关键词：肺腺癌肿瘤；巨噬细胞；化学双标染色
To analyze the optimization of immunohistochemical double staining method of lung adenocarcinoma tumor related macrophages
Abstract: objective: to explore a stable and easily recognizable color development method by improving the existing immunohistochemical double labeling method (double labeling), so as to facilitate the observation of the distribution of tumor-related macrophages in lung adenocarcinoma tissues under the ordinary optical microscope.Methods: the modified immunohistochemical double standard staining used alkaline phosphatase and horseradish peroxidase as the substrates for chromogenic enzymes, and solid Red (ap-red) and diaminodiphenidine (DAB) as the substrates, respectively. The double standard chromogenic staining was controlled in sequence under the microscope to observe the distribution of tumor-related macrophages in lung cancer tissues.Results: among the immunohistochemical double markers, the Red of the first marker ap-red was in great contrast with the brown and yellow of the second marker DAB.The same part marked by two colors is brick red, which is easy to represent the double mark part.Statistics showed that in lung adenocarcinoma tissue samples, m2-type tumor-related macrophages dominated, accounting for about 80%.Conclusion: the improved color rendering system has established a simple and reliable method for double immunohistochemical labeling.The results of labeling can clearly and stably show the distribution of tumor-related macrophages in lung adenocarcinoma tissue, which is conducive to further study of its role in the occurrence and development of lung cancer.
Keywords: lung adenocarcinoma tumor;Macrophages;Chemical double staining
肺癌目前为全球发病率最高且死亡人数最多的恶性肿瘤，目前其发病率和死亡率均占我国恶性肿瘤的第一位——肺腺癌患者5年生存率只有15.9%[1]。在基础实验和临床病理形态学研究中，免疫组织化学双重或多重标记染色能同时在一张组织切片或一个细胞内证实多种抗原存在。目前免疫双重标记(双标)实验中较多采用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶双酶显色系统。碱性磷酸酶的底物常选用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐/硝基四唑氮蓝(BCIP/NBT)，辣根过氧化酶的底物则多选用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)。底物BCIP/NBT与AEC的呈色反应存在一定程度的相互干扰；并且BCIP/NBT呈色反应与细胞核苏木精复染亦存在干扰。因此，建立一种获取高质量结果的免疫组化双重标记方法具有重要的应用价值。
1.资料与方法
1.1一般资料
筛选我院于2017年7月-2018年7月期间收治的20例肺腺癌患者，其中男性12例，女性8例，年龄(58．1±2．5)岁，TNMⅠ～Ⅲ期分别为7例、6例和7例，吸烟者12例，没有病例术前进行放化疗等特殊处理。
1.2方法
免疫组化双标染色步骤：石蜡切片脱蜡水化，组织内源性过氧化物酶灭活，抗原高温高压酸修复(pH=6.0)，正常山羊血清封闭液阻断非特异性结合。第一标抗体孵育：滴加终浓度为2.5μg/mLCD68抗体工作液，4℃孵育16h；阴性对照PBS代替抗体，其余相同。生物素标记羊抗鼠/兔IgG(简称二抗，下同)孵育，链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶链接二抗，AP-Red呈色反应。碱性磷酸酶液洗脱液洗脱抗体和碱性磷酸酶，第二次非特异性阻断。第二标抗体孵育：滴加第二标抗体(终浓度为2.5μg/mLCD163抗体或HLA-DR抗体)4℃孵育16h。生物素标记的二抗孵育，辣根过氧化物酶链接二抗，DAB呈色反应。苏木精复染细胞核，甘油封片剂封片，显微镜下及时观察采图。
2.结果
免疫组织化学双重标记中第一标记AP-Red的红色与第二标记DAB的棕黄色反差大，背景低，易于分辨。两种颜色标记的同一部位呈现砖红色，易于表示双标部位。统计显示在肺腺癌组织标本中，以M2型肿瘤相关巨噬细胞为主，约占80%。
3.讨论
既往的免疫组化双标染色底物BCIP/NBT与AEC的呈色反应存在一定程度的相互干扰，使染色结果反差变小，并且底物BCIP/NBT的显色与苏木精复染的细胞核有相互干扰[2]。
经过探索，通过替换呈色反应的作用底物，能产生清晰高反差的双标结果，建立起一种清晰、高对比度的免疫组织化学双标方法。免疫组化双标分别使用二抗链接的碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，底物选用FastRed和DAB分别显示红色与棕黄色[3]。第一标FastRed的红色与第二标DAB的棕黄色反差大，背景低，易于分辨。此外，两种颜色标记的同一部位呈现砖红色，易于各单色分辨。另外，染色背景较浅，无弥散的非特异性信号，背景呈灰白色。
综上所述，本研究改进的免疫组化双标方法虽然存在一定的不足，但因其适用面广，冰冻和石蜡切片均可采用，适当加以改变还可以进一步提高灵敏度或发展成三标甚至多标方法，可广泛地应用于临床病理诊断和基础实验研究。
参考文献：
[1]汪向海,潘贤慧,邢敏.外周血血小板/淋巴细胞比值在肺腺癌诊断中的价值[J].皖南医学院学报.2018(06).
[2]荆心研,卢兆莲,张婷,胡成进.基于MALDI-TOF-MS技术建立肺腺癌诊断预测模型及其初步验证[J].国际检验医学杂志.2018(09).
[3]崔白苹，高璀乡，熊存全，等.一种简便、可靠的免疫组化双重标记新方法[J].中国药理学通报，2015，31(3):436.
论文作者:马洪霞
论文发表刊物:《中国结合医学》2019年第02期
论文发表时间:2019/4/8
标签：标记论文; 免疫论文; 腺癌论文; 磷酸酶论文; 组织论文; 抗体论文; 显色论文; 《中国结合医学》2019年第02期论文;