（1湖南科技职业学院 湖南 长沙 410014）
（2湖南中医药大学 湖南 长沙 410004）
（3湖南疾病预防控制中心 湖南 长沙 410007）
【摘要】 目的：探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：采用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。8～10天可达80%～90%融合，纯化后传代周期为6～8天。流式细胞术鉴定表明CD11b和CD45阴性，CD90阳性。结论： 改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。
【关键词】骨髓间充质干细胞 细胞培养 大鼠
【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）13-0026-02
Rat bone marrow mesenchymal stem cells‘s separation methods and to cultivate Zou Jin. Hunan Vocational College of Science and Technology, Hu’nan Province, Changsha 410014, China; Li Ya. Hu’nan University of Chinese Medicine, Hunan Province, Changsha 410004, China; Yin Jin. The Centers for Disease Control and Prevention of Hu’nan, Hu’nan Province, Changsha 410007, China
【Abstract】Objective To explore the in vitro culture and purification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) method. Methods Using improved the whole bone marrow adherent method, separation and purification of rat (for 3 ～ 4 weeks )of BMSCs, microscopically continuous observation of cell morphology change. To identification cells surface antigen CD11b, CD45 and CD90 expression using flow cytometry. Results The original generation of cultured cells is circular and spindle, after 24 hours, most of the cells are attached. 8 ～ 10 days later, the fusion of up to 80% ～ 90%. After purification，extend the period is 6 ～ 8 days. Using flow cytometry assay, CD11b and CD45 were negative, CD90 is positive. Conclusions Improved the whole bone marrow adherent method, which can effectively the isolation and culture of rat bone marrow mesenchymal stem cells, is an ideal method of cultivation.
【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell culture; The rat
骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一[1]。在不同诱导条件下，可以分化为成骨细胞、肌细胞和脂肪细胞，还可以跨胚层分化为神经元、肝细胞和内皮细胞等，是目前组织工程的重点种子细胞。分离培养高纯度和高活力的BMSCs是组织工程的关键。本实验目的在于采用改良全骨髓贴壁法对大鼠BMSCs进行分离培养，为组织工程技术提供种子细胞。
1.材料与方法
1.1材料
雄性SPF级SD大鼠，5～7周，体重110±20g，购自湖南中医药大学动物实验中心。L-DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司）。PBS平衡盐溶液、胰蛋白酶（Sigma公司），EDTA二钠（上海生物工程有限公司），FITC标记CD11b、CD90、CD45抗体（Serantec公司）等。
1.2方法
1.2.1原代培养BMSCs 将经过高压灭菌的手术器械准备好，大鼠采取颈椎脱臼法处死后，放在75%的酒精中浸泡10分钟。在无菌的环境下，快速取出大鼠的股骨、胫骨，并剔除其周围的组织，然后切除大鼠的股骨、胫骨的两端。使用5mL剂量的注射器，抽取DMEM液，给大鼠的骨髓腔进行反复冲洗，然后把冲洗液收集起来，放在离心管里，1500转/分，离心5分钟后将上清液丢弃。放进有15%的胎牛血清的DMEM培养液中，反复吹打，经过细胞计数之后，按照109/mL的密度，在50cm2的培养瓶里接种，放置温度在37摄氏度、湿度饱和、体积分数是0.05的CO2的培养箱里，进行培养。使用倒置的显微镜，进行日常观察其细胞的生长状态。48个小时之后开始换液，并丢弃未贴壁的细胞，之后每隔两天进行一次换液。
1.2.2传代、纯化BMSCs 当原代培养的细胞增殖，能够在瓶底的融合情况大致到达80%左右时，用0.25%浓度和0.01%浓度的EDTA混合消化酶，进行细胞消化，使用有15%的胎牛血清的培养基进行消化反应的终止处理，然后使用吸管，进行轻轻的吹打，让细胞能够完全脱壁，再将其放入离心管里，1200转/分，离心3分钟，将上清液丢弃，放入新的培养基，吹散后按一比二的比例，进行传代培养，将P1设为其标记，之后进行日常观察细胞的生长状态，直到贴壁细胞的融合现象能够有80%左右的时候，再重复上述的操作步骤，进行反复传代。
1.2.3测定BMSCs的生长曲线 选择生长良好的P1、P3、P5的细胞，消化后以1×104/mL接种在二十四孔板中，每日均选取三孔，并计算其细胞的数量，按照一孔计算三次的方式，取其平均数，共计连续培养七天，将培养的时间设为横轴，将细胞数设为纵轴，进行生长曲线的绘制。
1.2.4鉴定BMSCs 选择P3的细胞，用混合消化液将细胞进行消化，然后配成细胞的悬液，使用1%浓度的BSA，将封闭液进行10min的封闭处理，然后洗涤PBS三次后，放入FITC荧光标记的CD11b、CD90、CD45抗体中，对照组再放入PBS，在4摄氏度的环境下，进行30min的孵育，1500转/分，离心5分钟，冲洗PBS三次，使用1%浓度的多聚甲醛进行固定，使用FACScan流式细胞仪，进行细胞表面抗原的检测。
2.结果
2.1 BMSCs细胞培养的形态
BMSCs在接种24小时后，就能够看到细胞有贴壁的现象。48个小时后，细胞的贴壁现象更加趋于明显，其中细胞的形状主要是椭圆形、圆形这两种。在第三天到第五天的时候，细胞形状变成多边形、二角形、短梭形，并变成集落的生长方式。在第六天到第十天的时候，细胞能够形成80%到90%的融合现象，而且已经将瓶底铺满，分布形状呈现旋涡状，并且能够进行传代。在刚传代的细胞形状为圆形，且传代的细胞，和原代细胞相比，其生长速度更快，在四个小时的时间内，就出现了贴壁的细胞，在二十四个小时内，所有的细胞已经全部贴壁，并且呈现伸展的生长状态，在6天到8天后，就能够进行传代，传代的细胞生长均匀分布，且大部分细胞的形状是梭形。
2.2 BMSCs的生长曲线
第1、3、5的细胞生长的曲线形状是S型，和传代后的细胞生长的特征大致相符，传代细胞的潜伏期大概是二十四小时到四十八小时之间，在贴壁2天当中，没有明显的增殖情况，一般在第三天，开始进行对数的增殖期，在第六天到第八天，能够融合80%以上，之后在进入到平台期后，细胞就不再进行增殖。
2.3 BMSCs的细胞鉴定
使用流式细胞仪进行检测，观察到第3代的BMSCs细胞的CD45阳性细胞率，没有达到5%，而CD90的阳性率已经超过95%。
3.讨论
BMSCs就是指，由多种没有经过鉴定的细胞，共同组成的细胞群体，其特征主要体现为复杂性和混合性，在骨髓里的BMSCs含量不高，每1万到10万个单核细胞里才存在1个BMSCs[2]。故此，建立成熟的BMSCs的体外分离、培养、纯化和扩增的方法，是能够将BMSCs利用起来，再进行实验研究、临床应用的基础方式。对目前而言，体外分离培养BMSCs，尚未得到公共认可的标准。当下采取的方法主要包括免疫磁珠法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法以及全骨髓贴壁法，其中，免疫磁珠法、流式细胞仪分离法这两种能够获取纯化度更高的BMSCs，但是其弊端在于，这两种方法会对细胞的活性造成一定的负面影响，甚至会导致细胞失去其活性。全骨髓贴壁法，是体外分离培养BMSCs的最早使用的一种方法，在Friedenstein等提出BMSCs的概念时，就是采用的全骨髓贴壁法，其优势[3]在于，操作简单，不会对细胞造成损伤，且细胞的活力能够得到较高的保障；但其存在的最大的弊端就是得到细胞的纯度较低。在鉴定MSCs的纯度时，常规认为其是一种复杂的细胞群体，标记多种多样，没有特定的抗原表面，就目前来说，临床认为其表达的是CD166、CD105、CD90、CD44、CD29等,而不会表达造血细胞表面抗原。
我们的研究结果表明，本次分离培养后得到的细胞当中，在有限的传代数内纯度较高，增殖的传代功能强，是进行细胞移植当中，较为满意的一种种子细胞，其应用前景非常广泛。但是，在培养细胞的过程里，需要注意的是：第一，培养基的PH值，要控制在7.2到7.3的范围内。第二，要选择适合的消化时间，在细胞突起收缩变形的时候，就需要停止。第三，在传代的时候，其细胞密度要控制适宜。
【参考文献】
[1]Xiaoping Wang,Dongmei He,Li Chen et al.Cell-Surface Ultrastructural Changes During the In Vitro Neuron-Like Differentiation of Rat Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells[J].Scanning: The journal of scanning microscopy,2011,33(2):69-77.
[2]Chi,N.-H.,Yang,M.-C.,Chung,T.-W. et al.Cardiac repair achieved by bone marrow mesenchymal stem cells/silk fibroin/hyaluronic acid patches in a rat of myocardial infarction model[J].Biomaterials,2012,33(22):5541-5551.
[3]Zhao,Y.,Xin,J.,Sun,C. et al.Safrole oxide induced neuronal differentiation of rat bone-marrow mesenchymal stem cells by elevating Hsp70[J].Gene: An International Journal Focusing on Gene Cloning and Gene Structure and Function, 2012, 509(1): 85-92.
基金项目 ：湖南省教育厅科技项目（项目编号12C1095）
论文作者:邹瑾1, 李雅2, 尹进3
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第13期供稿
论文发表时间:2015/7/24
标签：细胞论文; 骨髓论文; 大鼠论文; 干细胞论文; 湖南论文; 方法论文; 生长论文; 《医药前沿》2015年第13期供稿论文;