李戎锋[1]1994年在《硫霉素环化酶基因克隆的研究》文中进行了进一步梳理硫霉素是一种具有碳青霉烯结构的超广谱新型β-内酰胺类抗生素，临床上有很高的应用价值。限制硫霉素投入临床应用的主要因素是硫霉素分子中游离氨基所造成的氨解作用使自身失去活性。本文通过与阻断变株互补的基因克隆手段，首次从硫霉素产生菌S.cattleya中克隆了硫霉素环化酶基因，为阐明硫霉素生物合成机理，改造硫霉素结构或提高其产量均有较重要的理论与实际意义。 比较了不同的种子和发酵培养基对S.cattleya的生长状况及硫霉素产生周期的影响，确定了合适的发酵条件和此条件下硫霉素的产生周期。 用终浓度为1.5mg／ml的亚硝基胍(NTG)对S.cattleya孢子悬液在pH9.0，37℃条件下处理30分钟，孢子存活率为0.225％。在此条件下，可以得到比较稳定的阻断变株。以绿脓杆菌、肺炎杆菌和金黄色葡萄球菌为生物活性检定菌，共筛选到9株无活性阻断变株，它们在SGGP固体斜面上均为光秃型，说明硫霉素的产生与孢子的形成有一定相关性。阻断变株经传代检验无回复突变。互补试验结果表明不同变株间有一定互补作用。 在含0.6％甘氨酸的SGGP培养基培养的菌丝，用终浓度为2mg／ml的溶菌酶处理90-120分钟，变株原生质体形成率可达90％以上。比较不同的再生培养基，发现只有在含10.3％蔗糖的SGGP
向隆宽, 王以光, 戴剑漉[2]1998年在《硫霉素产生菌卡特利链霉菌A520基因文库的构建》文中认为以大肠杆菌／链霉菌穿梭柯斯质粒ｐＫＣ５０５为载体，构建了卡特利链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｔｌｅｙａ）Ａ５２０在大肠杆菌ＤＨ１的基因文库，重组质粒插入外源片段的概率在９５％以上，插入外源片段的大小为２０～３０ｋｂ。以链霉菌染色体分子量为１０４ｋｂ计算，由４０００个转化子构成的基因文库可以概括卡特利链霉菌Ａ５２０约９９％的基因组。用已经克隆的硫霉素环化酶基因上游的１．５ｋｂＤＮＡ片段作为探针杂交，从基因文库得到３２个阳性克隆。用利波曼链霉菌（Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉ）中的ＩＰＮＳ基因作为探针杂交，从基因文库得到１个阳性克隆ｐＫＷ２０１／ＤＨ１，并为Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交进一步证实杂交片段在ＢａｍＨⅠ２．７ｋｂ片段上。用来自带小棒链霉菌（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）的克拉维酸生物合成途径中的环化酶基因ｃｓ２作为探针杂交进行筛选，得到１个阳性克隆ｐＫＷ３０１／ＤＨ１，说明所构建的基因文库比较完整，并为进一步研究硫霉素产生菌卡特利链霉菌Ａ５２０中抗生素生物合成基因打下了良好基础
向隆宽[3]1998年在《卡特利链霉菌A520基因文库的构建以及硫霉素生物合成基因的初步研究》文中研究表明用大肠杆菌／链霉菌穿梭载体pKC505在大肠杆菌DH1中构建了卡特利链霉菌A520的基因文库，基因文库由4000个转化子组成，插入的外~1源DNA片段的大小为20—30kb，所含重组质粒的频率很高，基因组的覆盖率在99％以上，基因文库中的重组质粒在—70℃保存两年后检测重组，酶切带型没有变化，重组质粒DNA没有发生重排，基因文库稳定。 根据基因同源性不同杂交严谨度要求不同的条件，应用三个来源的DNA探针杂交筛选基因文库，筛选进行了在不同的严谨度下首在不同的严谨度下先进行了预实验，用卡特利链霉菌A520硫霉素环化酶基因tcs上游1.5kb片段杂交筛选基因文库，得到32个阳性克隆(pKW101—pKW132)，用利波曼链霉菌的IPNS基因杂交筛选得到一个阳性克隆pKW201，用带小棒链霉菌的cs2基因为探针杂交筛选得到一个阳性克隆pKW301。 转化阳性克隆的重组质粒到变铅青链霉菌TK24中，转化子在不同的培养基发酵，以对青霉素G不敏感的沙雷氏菌AG4410为指示菌，进行了活性物质的检测，从4000个转化子中得到变铅青链霉菌转化子(pKW102)和(pKW105)产生对指示菌有抑制作用的活性物质，重组质粒pKW102和pKW105中插入的外源DNA片段为25.3kb和29kb，提示该外源DNA片段可能成在编码硫霉素生物合成基因。 通过Southern杂交分析表明质粒pKW201含有与利波曼链霉菌的IPNS基因、与卡特利链霉菌A520硫霉素tcs基因和与带小棒链霉菌中克拉维酸中cs2基因同源的DNA片段，它们分别位于pKW201／BamHI 2.7kb，4.3kb，和1.9kb的DNA片段上。因此，对pKW201进行了深入的研究。绘制了pKW201限制性酶切图谱并将其BamHI酶切后的外源DNA片段亚克隆到pUC18中，得到pKWG1，pKWG2，pKWG3，pKWG4，pKWG5，pKWG6，pKWG7，pKWG8重组质粒，pKW201含有22.9kb的DNA片段，与IPNS基因同源的DNA片段位于pKWG4上，与tcs基因同源的DNA片段位于pKWG3上，与：cs2基因同源的DNA片段位于pKWG6上。tcs基因紧位于IPNS基因上游，与带小棒链霉菌cs2同源的DNA片段位于IPNS基因下游的2.0kb处。 测序分析结果证实，与利波曼链霉菌IPNS基因同源片段为IPNS基因，其转录方向也与其它β—内酰胺产生菌中的IPNS的转录方向和终止位置一致。 用染色体步移法，以IPNS基因为中心，对位于其上游的tcs基因上游的1.5kb的DNA片段进行了测序，序列测得1097bp个核苷酸，DNA序列分析和编码的氨基酸序列同源性比较表明G+C％为75.3，符合链霉菌GC含量高的特点，由其编码的氨基酸序列和tcs编码的一起与点黄青霉菌的
李戎锋, 王以光[4]1996年在《硫霉素环化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达及基因定位》文中提出将含有硫霉素环化酶基因的重组质粒p6BC12转化变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)TK24,含有p6BC12的转化子细胞抽提液分别与硫霉素生物合成阻断变株Y_3发酵液以及纯化的Y_3中间产物经过体外共培养可产生活性物质,化学分析表明与Y_3发酵液混合后产生的是硫霉素,与纯化的Y_3中间产物混合产生的是一种不稳定的活性物质,说明硫霉素环化酶基因在S.lividans TK24中得到了表达,其产物以Y_3中间产物为底物并弥补了Y_3中的缺陷。对p6BC12中4.5kb外源片段进行了限制酶酶切分析,建立了酶切图谱。利用含硫霉素环化酶基因的S.lividans TK24转化子体外转化Y_3的应用体系,将硫霉素环化酶基因定位在0.9kb Hinc Ⅱ-PstⅠ片段上,并证明了硫霉素环化酶的活性与IPNS同源片段无关。以上实验为进一步研究硫霉素环化酶基因的结构打下了基础。
李戎锋, 王以光, 曾应[5]1993年在《硫霉素生物合成酶基因克隆的研究》文中研究说明利用NTG诱变从硫霉素产生菌中获得了生物合成阻断变株Y_3。通过对Y_3变株原生质体形成、再生条件及DNA转化的研究,初步建立了以变株为受体的克隆系统,以pIJ680为载体,从硫霉素产生菌S.cattleya中鸟枪克隆,获得了能使Y_3变株恢复产生硫霉素的酶基因。根据对Y_3积累的中间产物的分析,认为该酶基因可能与硫霉素生物合成过程中肽的环化作用有关。重组质粒分子大小为9.8kb左右,插入片段大小为4.5kb,分子杂交试验证明插入片段来源于硫霉素产生菌S.cattleya。
李戎锋, 王以光[6]1996年在《牲畜链霉菌（Streptomyces cattleya）thienamycin合成阻断变株的筛选、阻断部位的确定及变株原生质体的研究》文中提出以ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ（ＴＮＭ）产生菌Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ为出发菌株，利用终浓度为１．５ｍｇ／ｍｌ强诱变剂亚硝基胍在ｐＨ９．０、３７℃条件下对其孢子悬液处理３０ｍｉｎ，得到稳定的ＴＮＭ生物合成阻断变株Ｙ＿３。纸层析后进行茚三酮显迹和生物显迹表明Ｙ＿３变株积累一种无活性中间产物，其迁移率不同于ＴＮＭ。建立了Ｙ＿３变株中间产物的分离纯化方法。酸水解和氨基酸组分分析表明Ｙ＿３中间产物为谷氨酸和丙氨酸组成的二肽，可能是形成碳青霉烯双环母核的底物，提示丙氨酸可能也是ＴＮＭ的前体，Ｙ＿３变株阻断在形成碳青霉烯双环母核的环化步骤。Ｙ＿３变株具有较高的原生质体形成率和再生率。原生质体在４０℃进行处理可以在不影响再生率的前题下提高ＤＮＡ转化率。通过以上研究建立了以Ｙ＿３变株为宿主的ＴＮＭ环化酶基因克隆受体系统。
李戎锋, 王以光[7]1997年在《Thienamycin环化酶基因的结构及在大肠杆菌中表达的研究》文中研究表明对来自重组质粒ｐ６ＢＣ１２外源片段上的１．３ｋｂ片段进行核苷酸序列分析，结果表明整个片段的Ｇ＋Ｃ含量为６８．６％，基因结构符合链霉菌基因特点，其上存在一个完整的开放阅读框架（ＯＲＦ），由４０５个碱基组成，编码１３４个氨基酸，起始密码为ＡＴＧ，终止密码为ＴＧＡ，起始密码上游有保守的ＳＤ序列ＧＧＡＧＧ。推测的－１０区为ＣＡＧＣＣＴ，－３５区为ＴＴＧＣＡＧ。终止密码下游有一个长为１８ｂｐ的反转重复序列。根据基因定位的结果，认为是ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ环化酶基因。它与异青霉素Ｎ合成酶基因连锁。与Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ中异青霉素Ｎ合成酶及克拉维胺酸合成酶相比氨基酸序列的同源性极低，表明这可能是一个新的基因。利用ＰＣＲ技术将环化酶基因扩增并克隆至大肠杆菌高表达载体ｐＴ７－７，使其在大肠杆菌中得到表达，同位素参入实验结果表明蛋白分子量为１４．５ｋＤ，与理论值相符。表达产物在体外可分别将纯化的ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ环化酶基因阻断变株Ｙ３的中间产物和Ｙ３发酵液转化为具抗菌活性物质。
尚广东[8]1999年在《牲畜链霉菌调节基因的克隆及生技霉素稳定型基因工程菌的构建》文中进行了进一步梳理本论文工作分两部分： 一、本实验室发现硫霉素产生菌牲畜链霉菌可能分泌一种小分子、可扩散性化合物，可使三种不产硫霉素的变株恢复产素，同时恢复产生孢子。为研究牲畜链霉菌中调节硫霉素生物合成的基因，依据细菌中广泛存在的调节基因luxⅠ保守性强区域的氨基酸序列，参考链霉菌基因特点，设计了上游和下游各两组引物，以牲畜链霉菌染色体DNA为模板，经PCR扩增出约200bp片段，以此为探针，与牲畜链霉菌总DNA不同酶切产物进行杂交，在EcoRⅠ-BamHⅠ 4.8kb,PstⅠ-PstⅠ 3.5kb,BglⅡ-BglⅡ 1.8kb处出现强阳性信号。回收EcoRⅠ-BamHⅠ处理的总DNA 4.5kb-5.5kb区间片段，克隆至pBluescript SK(-)，转化大肠杆菌DH5α，菌落杂交获得两个阳性菌落，质粒提取、鉴定，获得重组质粒pSN1，其酶切后杂交结果与总DNA杂交结果相同。经亚克隆，并进一步通过Southern杂交将阳性区定位于SmaⅠ-XmnⅠ 0.8kb片段。重组质粒pSN1外源片段全长测序，共测出4.736bp，Frameplot分析发现两个完整的ORF：ORF1,ORF2。ORF1包含阳性杂交区，长度为1,800bp，以ATG起始、TGA终止，命名为SctⅠ，Genbank收录号为AF111267。SctⅠ ORF G+C％为69.4，第1，2，3位G+C％含量分别为68.0,45.5,98.2,符合链霉菌基因特点。在ORF上游SmaⅠ-BstNⅠ 249bp发现为AT丰富区，G+C％为59.1，这在总DNA含量平均达73％的链霉菌染色体中极为少见，仅见于灰色链霉菌(S.griseus)中少数调节基因strR,afsA等。SctI,strR,afsA这类基因与其它链霉菌基因显著区别还有-10,-35区,SD序列均不明显等。SctI ORF后面存在着正反向重复，茎环，旋转对称等复杂的二级结构，测序过程中，每测出一段，需要根据所测序列设计引物，逐步延伸才测出此复杂区。ORF2在ORF1互补链的反向前方，长度为561bp,起始为ATG，终止为TAG,G+C％总含量为67.02％,第3位G+C％含量为98.9。ORF2编码的氨基酸在Genbank中亦未发现有显著性同源序列。 以牲畜链霉菌对数生长期蛋白粗提液与α-~(32)p-dCTP标记的SmaI-BstNI 249bp DNA进行凝胶滞留实验，249bp DNA由于和蛋白结合而在聚丙烯胺凝胶电泳上迁移变慢。加入过量的非标记DNA可竞争此结合。证明此AT丰富区有着特异性的DNA结合蛋白。SmaI-BstNI 249bp DNA在
张欣城[9]2009年在《metK对那西肽生物合成的影响和链霉菌高效转座系统的构建》文中研究指明第一部分世界上三分之二的抗生素由链霉菌产生,因而链霉菌在大规模工业生产和化学合成酶方面有特殊作用。链霉菌基因工程的研究近年来是一个活跃的领域。本论文研究着眼于那西肽,这是一种含有多个噻唑环并富含硫元素的非核糖体肽类抗生素,由活跃链霉菌Streptomyces. actuosus产生。本研究在链霉菌育种方法的基础上,主要利用基因工程和培养基组分优化的方法来研究那西肽生物合成的代谢途径以进一步提高那西肽的产量,适于工业生产的需要。首先,构建含有来源于酿酒酵母的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒,通过原生质体转化将其克隆至S.actuosus,构建成基因工程菌Z-SAM,并用高效液相(HPLC)证明了S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在该株菌中的含量比出发菌株Z-10提高了9倍,达到9.5μg/ml。其次,为探索那西肽的生物合成代谢途径,本研究对S. actuosus发酵培养基组分进行了优化,有针对性的提高培养基中的碳源和氮源,采用2%麦芽糖,2%葡萄糖,4%淀粉,4%黄豆粉,0.25%硫酸铵,0.2%硫酸钠,0.04%K2HPO4,0.01% MnSO4,0.05% MgSO4,0.25% NaCl,0.003% FeSO4,0.005% ZnSO4作为发酵培养基,并分别在72,120和168小时时补加2%黄豆粉,0.01%丝氨酸,1.25%麦芽糖,1.25%葡萄糖,0.15%硫酸钠和0.15%硫酸铵。在发酵终止后发现基因工程菌Z-SAM的那西肽产量较出发菌株提高了80%,菌株生产稳定,发酵单位达到1746μg/ml。最后,本论文发现Z-SAM菌体中半胱氨酸的含量比出发菌株Z-10提高了一倍,根据实验结果和文献报道的SAM逆转硫途径,本研究推测在S.actuosus中存在另一条由SAM主导的逆转硫合成那西肽的途径。即由于S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMs)的高表达导致SAM大量产生,SAM激活了该合成途径,并在其中起到硫提供者的角色,在通过了一系列代谢后使得菌体内半胱氨酸含量提高。而半胱氨酸是那西肽生物合成的重要前体,所以进而使得那西肽的产量提高。第二部分随着天蓝色链霉菌A3(2)的全基因组序列的发表,链霉菌的基础研究已进入后基因组时代,大量新基因和功能未知基因的功能有待鉴定。对这类基因的研究将会为阐明初生代谢和次生代谢的基因调控等生物学问题以及次生代谢药物的合成机制提供更多的实验证据。因此大规模突变体库的构建是功能基因组研究的一个重要内容,而利用转座子进行插入突变构建突变体库则是目前广泛应用的方法之一。转座子是基因功能研究十分有用的工具。但目前在链霉菌中应用的大多数转座子却普遍存在转座效率低下或操作繁琐等缺点。本研究利用天然存在于诺卡氏菌Nocardia asteroids(mexicana)YP21中的转座子IS204,成功构建了一个链霉菌中的微型转座质粒pDZY101。该质粒带有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点oriT,可通过简单的接合转移将其从大肠杆菌导入到链霉菌中。实验证明该转座系统克服了链霉菌中现有转座子系统的一些缺陷,操作简便且具有高效、随机、遗传稳定等优点。此外本论文在pDZY101的基础构建了一系列衍生质粒对转座酶的作用机制进行了初步研究,证明了IS204的转座酶在链霉菌中只能识别带有一对紧挨着的反向重复序列的环状片断,并进而推测IS204的转座过程涉及到一个环状中间体。通过对转座突变株的大量测序和Southern杂交实验证实该转座系统随机性非常好,而且具有良好的遗传稳定性。这些特点使得该转座系统在链霉菌中具有良好的应用前景。另外在pDZY101基础上还构建了一个能和链霉菌噬菌体φC31发生同源重组的质粒pFl2,探索了噬菌体转座载体的构建。
佚名[10]1996年在《基因工程》文中研究指明962009 用质粒DNA的完全离体合成实现定位诱变[英]/Postina, R.…//Anal.Biochem. -1995,232(2).-254～258[译自DBA,1996,15(7),96-03687] 开发了离体诱变的快速、简易的新方法,该方法无需大肠杆菌mutS-宿主菌株,采用完全离体合成的环状ds DNA。通过修复作为突变选择性标记的完
参考文献：
[1]. 硫霉素环化酶基因克隆的研究[D]. 李戎锋. 中国协和医科大学. 1994
[2]. 硫霉素产生菌卡特利链霉菌A520基因文库的构建[J]. 向隆宽, 王以光, 戴剑漉. 中国抗生素杂志. 1998
[3]. 卡特利链霉菌A520基因文库的构建以及硫霉素生物合成基因的初步研究[D]. 向隆宽. 中国协和医科大学. 1998
[4]. 硫霉素环化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达及基因定位[J]. 李戎锋, 王以光. 生物工程学报. 1996
[5]. 硫霉素生物合成酶基因克隆的研究[J]. 李戎锋, 王以光, 曾应. 生物工程学报. 1993
[6]. 牲畜链霉菌（Streptomyces cattleya）thienamycin合成阻断变株的筛选、阻断部位的确定及变株原生质体的研究[J]. 李戎锋, 王以光. 中国抗生素杂志. 1996
[7]. Thienamycin环化酶基因的结构及在大肠杆菌中表达的研究[J]. 李戎锋, 王以光. 中国抗生素杂志. 1997
[8]. 牲畜链霉菌调节基因的克隆及生技霉素稳定型基因工程菌的构建[D]. 尚广东. 中国协和医科大学. 1999
[9]. metK对那西肽生物合成的影响和链霉菌高效转座系统的构建[D]. 张欣城. 复旦大学. 2009
[10]. 基因工程[J]. 佚名. 生物技术通报. 1996
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