中山大学附属第三医院检验科 广东广州 510630
[摘要]目的 通过统计分析2012-2014年铜绿假单胞菌在我院的分布情况，了解铜绿假单胞菌医院感染的特点。根据药敏试验结果分析我院的铜绿假单胞菌临床分离株的耐药性，从而指导临床用药及预防感染。方法 将送检合格的细菌分离及培养按照《全国临床检验操作规程》(第3版)进行，采用SIEMENS公司 MicroScan WalkAway96 plus鉴定药敏分析仪，药敏结果按照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)（2013版）标准进行结果判断。筛选出45株铜绿假单胞菌采用E-test法进行最低抑菌浓度（MIC）的检测和CCCP对MIC影响试验。采用SPSS 13.0完成数据的统计分析,计数资料采用X2检验。结果 铜绿假单胞菌主要来源于痰，其次为分泌物、尿液等。易感人群为中老年人及有基础疾病等抵抗力低下人群。铜绿假单胞菌的耐药机制主要是产金属β-内酰胺酶和主动外排系统亢进。结论 铜绿假单胞菌主要引起呼吸道、伤口、泌尿道感染，中老年人和长期住院等免疫力低下的人为易感人群。铜绿假单胞菌具有较强耐药性，主动外排系统表达亢进在铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药起重要作用。外排泵抑制剂在多重耐药铜绿假单胞菌的治疗中具有一定的应用前景，但目前仍主要以严格监控临床上抗生素的使用情况，减少多重耐药铜绿假单胞菌的出现。
[关键词]铜绿假单胞菌 院内分布 耐药性
铜绿假单胞菌属条件致病菌，是医院感染的主要病原菌之一。具有分布广泛、多途径传播、易感染等特点。在由各种原因所致的人体抵抗力低下时引起呼吸道感染、泌尿道感染、外伤感染等。近年来，由于广谱抗菌药的广泛使用，该菌的检出率和耐药性出现上升的趋势,但这种趋势在近年来有轻微的下降趋势[1]。除此之外，该菌的耐药性随着各地医院的用药情况不同而有所差异。铜绿假单胞菌的耐药性分析方面，国内外的研究结果大致相同[2][3]。铜绿假单胞菌的耐药机制主要有：产生金属β-内酰胺酶（MBL），主动外排系统亢进，OprD2蛋白缺失等。国内由于广谱抗菌药的广泛使用，本文统计分析2012-2014年我院检出的铜绿假单胞菌的分布情况，并从2014年检出的铜绿假单胞菌中筛选出45株进行耐药机制的检测，根据实验反映的铜绿假单胞菌的耐药情况协助规范临床抗生素的使用。
1.材料与方法
1.1 菌株来源
菌株来源于我院2012年3月-2014年10月住院患者的痰、尿、血液、脓液、分泌物等其它标本，剔除同一患者同一部位重复分离菌株后筛选出45株进行实验。所有菌株经SIEMENS公司 MicroScan WalkAway96 plus鉴定药敏分析仪鉴定确认。质控株铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部临床检验中心。
1.2 仪器与试剂
1.2.1所用仪器
MicroScan WalkAway96 plus鉴定药敏分析仪（SIEMENS公司），
1.2.2抗菌药物及试剂
(1)MBL E-test纸片（非发酵菌金属酶检测用）：生物梅里埃中国有限公司（BIOMERIEUX）生产。
(2)空白纸片和亚胺培南药敏纸片：均为为英国OXOID公司生产。
(3)CCCP和EDTA均为Sigma公司产品。
(4)M-H琼脂培养基由江门市凯林贸易有限公司生产。
2.方法
2.1 最低抑菌浓度（MIC）的检测 采用E-test法。用接种环在琼脂平板上挑取形态相近的铜绿假单胞菌菌落4-5个，接种于5ml生理盐水中，配置成0.5麦氏标准比浊浓度菌液，于15min内，用无菌咽拭子取菌液，在管壁上挤去多余液体后均匀涂布M-H琼脂平板上，用消毒好的镊子夹取E-test纸片，贴在平板中央。35℃孵箱18-24h后观察结果。参照2008年CLSI解释标准判定敏感、耐药、中介，质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。判断标准：IP/IPI≥3倍稀释度为阳性，表示待测菌株产MBL。
2.2 CCCP对MIC影响试验 与上述MIC检测试验同时进行。配制0.5麦氏单位的铜绿假单胞菌菌悬液和浓度为5mg/L的CCCP溶液。将菌悬液和CCCP溶液按1：1的比例混合均匀。采用E-test法测定CCCP存在情况下亚胺培南对铜绿假单胞菌的MIC值，同时接种只含上述浓度CCCP的M-H琼脂平板作为生长对照。加入CCCP前后同一菌株对亚胺培南MIC降低≥4倍提示主动外排机制存在。
2.3 多重耐药铜绿假单胞菌的筛选 分离出的铜绿假单胞菌至少对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、β-内酰胺类、碳青霉烯类中3类或以上抗菌药物同时耐药判定为多重耐药铜绿假单胞菌。
2.4 统计方法 数据统计分析采用SPSS13.0软件分析，统计方法为X2检验。
3.结果
3.1铜绿假单胞菌的院内分布特点
3.1.1铜绿假单胞菌的标本来源分布 结果如表1所示：
P=0.025＜0.05，表示实验结果有统计学意义,说明CCCP作为外排泵抑制剂在铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药方面有抑制作用，提示外排系统表达亢进是铜绿假单胞菌的耐药机制之一[4][5]。
4.讨论
铜绿假单胞菌广泛分布于自然界，可寄生于人体皮肤表面和肠道，在机体抵抗力下降时可引起内源性感染和交叉感染。因此，铜绿假单胞菌容易引起呼吸道、泌尿道等与外界环境相接触的部位的感染；体质较弱的中老年人、有基础疾病的患者由于住院时间长，机体免疫力低下，长期使用抗菌药物，成为铜绿假单胞菌的易感人群。
通过对2012-2014年在我院搜集的铜绿假单胞菌对不同抗菌药物的耐药性分析可知：铜绿假单胞菌对常用的药物氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻肟、头孢曲松、厄他培南，以及复方新诺明、氯霉素、磷霉素、甲氧苄啶和四环素类药物均天然耐药。亚胺培南为碳青霉烯类抗菌药物，是一种新型的β-内酰胺类药物，抗菌谱广，对临床上常见的各种细菌引起的感染均具有很强的抗菌活性[6][7]。但铜绿假单胞菌因其固有和获得性耐药，对亚胺培南的耐药机制比较复杂。主要有：（1）产生金属β-内酰胺酶（MBL）；（2）主动外排系统亢进等。从总体上看，铜绿假单胞菌对常用的抗菌药物的耐药率呈下降或持平的趋势，说明医院对滥用抗生素的严格监控有一定的效果。各地区各医院细菌感染的常见致病菌种类及对抗菌药物的敏感性并不相同[2][3][4]，这对选用抗菌药物具有重要的参考价值。
检测铜绿假单胞菌产生金属β-内酰胺酶的实验中，中介组中的菌株有小部分出现耐药的表现（IP/IPI≥3倍稀释度为阳性）,可能是后天因素（温度、生存环境等）的改变诱导其由中介发展为耐药。耐药组中有部分菌株出现了明显的阳性表现，表示该菌株产金属β-内酰胺酶。其次，有部分菌株虽然达到耐药水平，但未达到产MBL的标准。因此，不可排除该菌株产MBL的可能，应该对相应的病人进行跟踪监测。
监测铜绿假单胞菌主动外排系统亢进的质子实验中，羟基氢氯苯腙（CCCP）属于质子泵抑制剂，可通过抑制主动外排系统能量来源的质子浓度梯度而影响主动外排作用[8]。实验结果为阳性者，均表现为耐药；但有部分经SIEMENS公司 MicroScan WalkAway96 plus鉴定药敏分析仪鉴定确认为耐药菌株，该实验结果并不一定为阳性。由此验证，主动外排系统亢进是导致铜绿假单胞菌耐药的因素之一，但不是唯一的因素。主动外排机制不仅存在于耐药菌株，还存在于中介菌株，但对耐药菌株的影响更明显（P＜0.05）。说明主动外排泵对铜绿假单胞菌的耐药性有普遍影响，是引起铜绿假单胞菌多重耐药的重要原因之一[8][9]。
综上所诉，我院铜绿假单胞菌对目前临床常用的抗菌药物的耐药率较高，其中，多重耐药铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率中等，因此，临床上须注重预防滥用抗生素导致的铜绿假单胞菌耐药率升高。产金属β-内酰胺酶（MBL）和主动外排系统亢进分别是铜绿假单胞菌的耐药机制之一，并在对以亚胺培南为代表的碳青霉烯类抗生素的耐药方面起重要作用。实验表明，外排泵抑制剂在多重耐药铜绿假单胞菌的耐药方面有明显的抑制作用，所以，外排泵抑制剂在治疗方面有一定的应用前景。
5.参考文献
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论文作者:黄凡华 廖小倩 梁家隐
论文发表刊物:《医师在线》2016年8月第15期
论文发表时间:2016/10/24
标签：铜绿论文; 胞菌论文; 菌株论文; 耐药性论文; 亚胺论文; 主动论文; 药物论文; 《医师在线》2016年8月第15期论文;