（1.河北省中医院，河北省 石家庄050011；2.河北省人民医院，河北省 石家庄050051；3.河北医科大学第一医院，河北省 石家庄050031；）
基金项目：河北省科技厅科学技术研究与发展计划自筹经费项目。基金项目编号132777170。
第一作者：李静（1979- ），女，河北衡水人，主治医师。主要从事临床血液病的诊断及治疗。
[摘要] 目的 实时荧光定量PCR检测多发性骨髓瘤患者WT1和MDR1基因的表达水平，并探讨其临床意义。方法 构建实时荧光定量PCR检测WT1和MDR1基因表达水平技术，检测30例不同分期多发性骨髓瘤患者血清WT1和MDR1表达水平，并对其表达量进行统计学分析。结果 多发性骨髓瘤患者WT1和MDR1表达显著高于对照组（P < 0.05），且两者与患者分期显著相关，其中，WT1基因在Ⅲ期与Ⅰ期、Ⅱ期比较中具有显著性差异（P < 0.05），MDR1基因在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期两两比较中均具有显著性差异（P < 0.05）。另外，WT1和MDR1基因表达水平呈现相关性（P=0.008），且两者均与β2-微球蛋白水平呈正相关，P值分别为0.006和0.034。结论 WT1和MDR1基因表达水平可以作为多发性骨髓瘤患者疾病进程的检测指标。
[关键词] 多发性骨髓瘤；实时荧光定量PCR；WT1；MDR1
Study on the Expression Level of Serum WT1 and MDR1 Gene of Patients with Multiple Myeloma Detected through Real-time Fluorescence Quantitative PCR
[Abstract] Objective To explore the value of real-time fluorescence quantitative PCR for the detection of the expression levels WT1 and MDR1 genes in patients with multiple myeloma and to explore its clinical significance. Methods Real-time fluorescence quantitative PCR was adopted to detect the expression levels of WT1 and MDR1 genes in 30 patients with multiple myeloma of different stages, and analyze the expression quantity. Results The expression levels of WT1 and MDR1 in patients with multiple myeloma were significantly higher than those in the control group (P < 0.05), and both were correlated with the staging the disease. The expression level of WT1 gene in phase III was with significant differences with that in phase I and II (P<0.05), and the expression level of MDR1 gene showed significant difference between the three phases (P<0.05). In addition, the expression level of WT1 and MDR1 genes was correlated (P=0.008), and both were positively correlated with β2-microglobulin levels, with P being 0.006 and 0.034 respectively. Conclusion The expression of WT1 and MDR1 genes can serve as an indicator for the detection of multiple myeloma.
[Key words] Multiple Myeloma; Real-time Fluorescent Quantitative PCR; WT1; MDR1
多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）是一种恶性单克隆浆细胞病，约占所有恶性血液肿瘤的10%[1]，是老年人较为常见的恶性血液系统肿瘤。多发性骨髓瘤的特征为产生单克隆免疫球蛋白的异常浆细胞增多，并在骨髓内恶性增殖，引起骨折和骨髓功能衰竭[2]，从而导致广泛骨质破坏、反复感染、高钙血症、高黏滞综合征、贫血、肾功能不全等一系列临床症状及不良后果[3]。多发性骨髓瘤的发病机制至今尚不清楚，也没有一种较好的治疗方法。化疗是基本疗法，虽可改善症状，延长生存期，但不能治愈；异基因干细胞移植可治愈，但死亡率高；自体周围干细胞移植较为安全，但复发率高[4]。Wilms瘤基因（Wilms tumor gene，WT1）位于人类染色体11p13，分子量约为50kb，是一种与Wilms瘤发生、发展有关的抑瘤基因，调控细胞生长，抑制其过度增殖[5]。MDR1基因属于人类多药耐药（Multidrug resistance，MDR）基因家族，其被报道与白血病的多药耐药现象有关，MDR1基因编码P170糖蛋白可将进入白血病细胞的药物泵出细胞外，导致耐药的产生[6]。为深入探讨WT1和MDR1两种不同的基因在多发性骨髓瘤病程监测中的作用，应用目前准确度和特异性较好的实时荧光定量PCR检测技术，分析了30例多发性骨髓瘤患者血清中WT1和MDR1基因的表达水平，并探讨其临床意义。
1 对象和方法
1.1 研究对象
2015年5月至2017年5月本院收治的30例多发性骨髓瘤患者，男17例，女13例，年龄42岁~78岁，中位年龄58岁。每位患者均进行血常规、生化、β2-微球蛋白等检查，诊断标准参照国内多发性骨髓瘤诊断标准，并且按照1975年Durie-Salmon分期系统（DS分期）进行分期，其中Ⅰ期8例，Ⅱ期11例，Ⅲ期11例。同时，选取非恶性血液病患者10例作为对照。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取和逆转录反应
取血清500uL，采用常规Trizol法提取总RNA，紫外分光光度法进行定量，-80℃冻存。逆转录反应采用Fermentas逆转录试剂盒，反应体系25μL，包括总RNA 1μL、2mmol/L dNTP 1μL、RNasin 1μL、5*RT缓冲液5μL、MMLV 1μL 、Random primer 1μL、水 15μL；反应条件为25℃ 10min，42℃ 60min，75℃ 10min，-20℃保存待测。
1.2.2 引物的设计与合成
基因引物根据GeneBank基因序列自行设计，由上海赛百盛公司合成，选用ACTB（β-actin）作为内参。WT1上游引物为5’- CAGGCTGCAATAAGAGATATTTTAAGCT-3’，下游引物为5’-GAAGTCACACTGGTATGGTTTCTCA-3’，探针5’-AAGCTGTCCCACTTA-3’。 WT1探针5’端标记荧光报告基团VIC， 3’端标记不发光的MGB基团。MDR1上游引物为5’-CAAGATCCTCCTGCTGGATC-3’，下游引物为5’-GAACCACTGCTTCGCTTTCTG-3’，探针5’-ACGTCAGCCTTGGAC-3’。MDR1探针5’端标记荧光报告基团 FAM，3’端标记不发光的MGB基团。
1.2.3 实时荧光定量PCR反应
反应体系25 μL，包括10 μmol/L引物各1 μL，10 μmol/L探针1 μL，cDNA 2 μL，TaqMan universal PCR MasterMix 12.5 μL。反应条件为，42℃ 30min，反转录后95℃ 3min，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸60s，5个循环后95℃变性5s，60℃ 30s，30个循环。反应结束后，由软件自动计算出WT1和MDR1的拷贝数。
1.2.4 统计学方法
应用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析。多个样本均数的比较采用方差分析，多个样本均数两两比较采用LSD-t检验，非正态分布的数据采用Mann-Whitney检验，相关性分析采用Spearman相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 WT1和MDR1基因在多发性骨髓瘤患者与对照组中的表达差异
30例多发性骨髓瘤患者WT1相对表达量为1.78，而10例对照组WT1相对表达量为0.00022，两者相差4个数量级，经统计分析有显著性差异（P < 0.05，见表1）。同样，多发性骨髓瘤患者MDR1相对表达量也显著高于对照组（P < 0.05）。
2.2 WT1和MDR1基因在多发性骨髓瘤患者不同分期中的表达差异
多发性骨髓瘤患者根据DS分期划分，Ⅰ期8例，Ⅱ期11例，Ⅲ期11例，各分期WT1相对表达量分别为1.31、1.56和2.34，MDR1相对表达量分别为0.67、1.97和2.78（见表1）。统计分析结果表明，WT1基因在多发性骨髓瘤患者Ⅰ期和Ⅱ期中无显著性差异（P > 0.05），但是在Ⅰ期和Ⅲ期、以及Ⅱ期和Ⅲ期的比较中，均具有显著性差异（P < 0.05）。而MDR1基因在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期两两之间比较均有显著性差异（P < 0.05）。说明WT1和MDR1基因与多发性骨髓瘤患者的DS分期显著相关，在不同分期中呈现明显的阶段性。
多发性骨髓瘤是一种侵袭性的肿瘤，在西方国家是第二常见的血液系统恶性肿瘤。但是，由于多发性骨髓瘤的临床表现多样化，出现在全身多个系统，首诊时常常会造成误诊或漏诊，最终导致病情延误[7]。多发性骨髓瘤的发生和发展受多种因素所控制，具体机制尚不清楚。实验表明，许多基因和蛋白质都参与了这一过程，引起细胞周期变化、信号传导通路异常，进而导致细胞增殖和血管增生等异常。
大量研究表明，WT1基因与造血细胞的增殖、分化及凋亡有密切关系，白血病的发生、发展和预后都与WT1有关[8, 9]。很多文献证实80%~90%的急性白血病无论型别均过表达野生型WT1基因[10]。但是多发性骨髓瘤在这方面的研究仍然较少，其原因可能是该疾病属慢性起病，自然病程差异非常大，从数月至十几年不等，且不同患者对治疗的反应也相差很大[11]。目前已知，WT1基因是一种双向转录调节因子，可与多种蛋白质发生相互作用，共同活化或抑制基因的转录，诱导凋亡基因的表达，使细胞的生长分化受到影响，对化疗药物的敏感性改变，从而导致MDR发生[12]，因此影响多发性骨髓瘤的疾病进程。研究发现，WT1基因可与p53蛋白共同作用于MDR1的启动子，促进MDR1的转录和表达[13]。
实时荧光定量PCR技术具有准确度高、特异性强、重复性好等特点，是目前研究基因表达使用广泛的方法之一。本研究建立实时荧光定量PCR检测WT1和MDR1表达水平的方法，并检测30例不同分期的多发性骨髓瘤患者，结果表明，WT1和MDR1基因表达水平均显著高于对照组，且两者与多发性骨髓瘤患者的DS分期相关。随着临床分期的增加，WT1和MDR1的基因表达也增加，并表现出阶段性，说明WT1和MDR1基因的表达量随着多发性骨髓瘤的临床进展而逐渐升高。研究还发现，WT1和MDR1基因表达水平呈现相关性，这可能与WT1促进MDR1的转录有关。另外，β2-微球蛋白直接反应了多发性骨髓瘤患者体内肿瘤负荷，与患者的生存期密切相关，而我们的研究发现，WT1和MDR1基因表达量均与β2-微球蛋白水平呈正相关，说明在评估多发性骨髓瘤患者病情时，WT1和MDR1基因的表达水平与β2-微球蛋白水平同样具有重要的诊断价值。以上结果提示我们，WT1和MDR1基因的检测，对多发性骨髓瘤患者疾病发生、发展变化具有至关重要的意义。今后还需扩大样本量，深入探讨WT1和MDR1基因的相互关系及其调控机制，以进一步阐明多发性骨髓瘤的疾病机制。
参考文献
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论文作者:李静 李燕 肖华 李晓红 张倩倩
论文发表刊物:《医师在线》2017年7月上第13期
论文发表时间:2017/10/30
标签：基因论文; 多发性骨髓瘤论文; 患者论文; 荧光论文; 引物论文; 定量论文; 水平论文; 《医师在线》2017年7月上第13期论文;