（重庆市肿瘤研究所/医院/癌症中心 重庆 400030）
【摘要】目的：观察不同氧浓度对人造血干细胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）凋亡情况的影响，及HSCs诱导分化为人软骨细胞（Human chondrocyte）的情况。方法：将HSCs分别在不同氧浓度下培养分为4个组：3％氧气浓度组、5％氧气浓度组、15％氧气浓度组、20％氧气浓度组(作为对照组)。分别培养6小时、12小时、24小时，观察HSCs细胞凋亡情况，并成功将HSCs体外诱导分化为软骨细胞。结果：HSCs培养6小时，5％氧气浓度组的HSCs凋亡率最低，3%和5％氧气浓度组较对照组比较差异有统计学意义（P﹤0.05）；HSCs培养12小时，5％氧气浓度组的HSCs凋亡率最低，5%和15％氧气浓度组较对照组比较差异均有统计学意义（P﹤0.05）；HSCs培养24小时，5％氧气浓度组的HSCs凋亡率最低，3%和5％氧气浓度组较对照组比较差异有统计学意义（P﹤0.05）。培养6小时、12小时、24小时，氧浓度变化与流式细胞仪检测HSCs凋亡率均具有相关性（P﹤0.01）。HSCs在体外成功诱导分化为软骨细胞。结论：不同氧浓度对HSCs的凋亡有影响。5%氧浓度能抑制HSCs的凋亡。在特定条件下，HSCs在体外可定向诱导分化为软骨细胞。
【关键词】人造血干细胞；氧浓度；凋亡；人软骨细胞
【中图分类号】R551 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）24-0115-03
Experimental studies in apoptosis of Hematopoietic stem cells in different oxygen concentration and the chondrogenic differentiation of it in vitro Zhou Xiaohong, Yang Xin.
Chongqing Cancer Institute & Hospital & Cancer,Chongqing 400030,P.R.China
【Abstract】Objective To observe the apoptosis of Hematopoietic stem cells (HSCs) in different oxygen concentration and time, and the chondrogenic differentiation of Hematopoietic stem cells. Methods HSCs were randomly divided into four groups cultured in oxygen concentration of 3%,5%,15%,20%,the group in oxygen concentration of 20% is the control group. To observe the percent of apoptotic about HSCs cultured in different time(6h,12h,24h), and divided HSCs into human chondrocyte in vitro. Results After 6 hours, the percent of apoptotic about HSCs of 5% group was the lowest, 3% group and 5% group showed statistical significance, compared with control group(P﹤0.05); after 12 hours, the percent of apoptotic about HSCs of 5% group was the(P﹤0.05); after 24 hours, the percent of apoptotic about HSCs of 5% group was the lowest, 3% lowest, 5% group and 15% group showed statistical significance, compared with control group(Pgroup and 5% group showed statistical significance, compared with control group(P﹤0.05). It showed correlation between the differention of oxygen concentration and the apoptotic of HSCs(P﹤0.01)in the 6h,12h,24h. HSCs was divided into human chondrocyte in vitro. Conclusion The differention of oxygen concentration have the effect to HSCs in the apoptosis. Cultured in the oxygen concentration of five percent can restrain the apoptosis of HSCs. The HSCs have chondrogenic potentiality in spell cultural method in vitro.
【Key words】Hematopoietic stem cells;Oxygen concentration; Apoptosis; Human chondrocyte
人造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）是一种能够自我更新并分化为各种血细胞前体细胞，它能最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板等，同时HSCs也可以分化成各种其他细胞。Till和McCulloch在1961年通过“脾集落形成试验”，首先描述了造血干细胞的特性。威斯康星大学的Thomson[1]等人在1988年成功的建立了胚胎干细胞系。此后HSCs被进一步的分化为神经细胞、造血细胞、肌肉细胞、胰岛细胞、骨细胞、软骨细胞等[2,3]。HSCs良好的分化增殖能力对病人损坏的骨组织、软骨组织的修复具有重要意义,使得干细胞能更加广泛的应用于临床。氧浓度在干细胞的培养条件中至关重要，Christine等的研究发现低氧环境对干细胞的生长有影响[4]。因此本研究以氧浓度做为干预条件，观察不同氧浓度下体外培养HSCs的细胞凋亡情况，同时成功的将HSCs诱导分化为软骨细胞。为进一步科研和临床应用提供理论依据。
1.材料与方法
1.1 一般资料
HSCs细胞株由上海拜沃生物科技有限公司提供。
1.2 仪器与试剂
RPMI1640培养液（上海元龙生物技术有限公司）；IMDM培养基(GIBCO公司)； Annextin V(美国Becton,Dickinson and Company)；二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司)；微氧手套箱(COY Laboratory Products公司)；CKC-TR-2W型倒置显微镜（Olympus，Japan）；YJ-875型超净化工作台(苏州安泰净化设备厂)；6孔培养板(北中杉金桥生物技术有限公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京碧波生物科技有限公司）；BD-CAN7型流式细胞仪（美国 Becton,Dickinson and Company）；高糖DMEM(GIBCO公司)；TGF-β（美国PeproTecH 公司）；PBS（上海佳和生物科技有限公司）；甲苯胺蓝染色剂（北京索莱宝科技有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 HSCs细胞培养 HSCs用10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，见图1。
1.3.2不同氧浓度的细胞培养处理 将HSCs分成实验组和对照组。实验组细胞在微氧手套箱中培养的氧浓度分别设定为：3%、5%、15%；对照组细胞在微氧手套箱中培养的氧浓度设定为20%。
1.3.3流式细胞仪检测HSCs凋亡率 采用10%胎牛血清的RPMI1640培养基，0.9ml培养基加入0.1ml的细胞悬液（细胞密度2×109个/L），用IMDM补充为1mL，将HSCs在不同氧浓度下分别培养6小时、12小时、24小时，使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，通过流式细胞仪检测HSCs凋亡率，见表1。
1.3.4相关性分析 氧气浓度3%、5%、15%、20%分别记为3、5、15、20。培养6小时、12小时、24小时，研究不同氧浓度和流式细胞仪检测HSCs凋亡率的相关性分析。相关分析采用Pearson 分析，P＜0.01为具有相关性。
1.3.5 HSCs诱导分化为软骨细胞 用软骨诱导培养基(高糖DMEM，维生素C 50ug/mL，地塞米松10～7mol/L，胰岛索6.25ug/mL，转铁蛋白6.2ug/mL，丙酮酸钠1nmoll/L，亚油酸5.35ug/mL，牛血清白蛋白1.25ug/mL)培养HSCs，再加入10ng/mL TGF-β。培养7d细胞形态变化明显，细胞聚集，有明显钙结节形成，见图2。
1.3.6人软骨细胞甲苯胺蓝染色鉴定 由HSCs诱导分化成的人软骨细胞用PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定于6孔板中1h后PBS冲洗，1%甲苯胺蓝染色2h，用90%酒精进行分色，晾干，中性树胶封片。见图3。
1.4 统计学处理
数据以（x-±s）表示 ,不同时间、不同氧浓度组间的数据比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。相关分析采用Pearson分析。用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计学分析。
2.结果
2.1 人造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）HE染色（图1）
人造血干细胞经HE染色，染色结果阳性，镜下观察可见细胞呈现出梭形、纺锤形，细胞成集落生长。
图1 人造血干细胞（HE ×400）
Fig.1 Hematopoietic stem cells（HE ×400）
2.2 流式细胞仪检测HSCs凋亡率 见（表1）。
培养6小时，5%组HSCs凋亡率最低，3%组、5%组较对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；培养12小时，5%组HSCs凋亡率最低，5%组、15%组较对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；培养24小时，5%组HSCs凋亡率最低，3%组、5%组较对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.3 分别培养6小时、12小时、24小时，不同氧浓度和流式细胞仪检测HSCs凋亡率的相关性分析
培养6小时后氧浓度变化与流式细胞仪检测HSCs凋亡率具有相关性（rs=0.743，P＜0.01）；培养12小时后氧浓度变化与流式细胞仪检测HSCs凋亡率具有相关性（rs=0.785，P＜0.01）；培养24小时后氧浓度变化与流式细胞仪检测HSCs凋亡率具有相关性（rs=0.773，P＜0.01）。
2.4 人软骨细胞（图2）
由HSCs诱导分化出的人软骨细胞，镜下观察细胞呈多角形、类圆形、短梭形等形态，多角形细胞聚集成团，并可见较大的细胞结节。
图3 人软骨细胞（甲苯胺蓝染色 ×400）
Fig.3 Human chondrocyte（Toluidine blue staining ×400）
3.讨论
HSCs维持生命和代谢的重要元素是氧气，HSCs生物学行为也会根据细胞周围环境中氧气浓度的差异而表现不同。在人体内HSCs生存适宜的环境为低氧环境[5，6]，人体内普遍存在低氧状态的生理现象，低氧环境也促成了胚胎发育和多种病变的发展[7]。但目前国内外对于HSCs的培养多采用常氧条件，这与其在体内存在环境有着较大不同，因此本研究采用不同氧浓度培养HSCs可更加真实的模拟其体内的生长环境。
HSCs作为前体细胞，其特点是具有高度自我更新、自我修复和多向分化的能力。周围各种环境因素影响着HSCs的复制、增殖、多向分化、归巢后重建造血、凋亡等生物功能。HSCs主要生存于骨髓的低氧区[8，9]，高氧环境不利于HSCs正常的增值分化[10]，低氧的环境相对适合于HSCs生物功能完整性及良好的长期保存[11-13]。骨髓、静脉血、动脉血中平均氧气浓度分别为5%、12%～15%、20%。HSCs的体外培养中，氧浓度发挥的重要作用[14]。本实验研究将体外培养HSC是的氧气浓度条件设定为3%、5%、15%、20%，正是为了模拟HSCs在体内不同条件下的生长、凋亡情况，这方面的研究国内外报道较少。软骨组织是组织工程修复的重要材料[15，16]，本研究成功的将HSCs诱导分化为软骨，为手术后组织缺损重建提供了重要的临床实验基础。
本实验研究发现HSCs培养6小时、12小时、24小时，5%氧气浓度组HSCs凋亡率最低。由此我们推论，不同氧浓度对HSCs的凋亡有影响，5%氧浓度能抑制HSCs的凋亡。在特定条件下，HSCs在体外可定向诱导分化为软骨细胞。为今后的临床实验研究提供了依据。
【参考文献】
[1] Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Scisnce,1998;282:1145-1147.
[2] Turnpenny L,Spalluto CM,Perrett RM,et al.Evaluating human embryonic germ cells:concord and conflict as pluripotent stem cells[J].Stem Cells,2006;24(2):212-220.
[3]游宏声.外周血干细胞及其动员研究进展[J].现代医药卫生，2008，24(22):3409-3411.
[4] Jobin C,Cloutier M,Simard C,et al.Helerogeneity of invitro-cultured CD34+ cells isolated from peripheral blood[J].Cytotherapy,2015,17(10):1472-1484.
[5]Mohyeldin A,Garzon-Muvdi T,Quinones-Hinojosa A.Oxygen in stem cell biology:a critical component of the stem call niche[J].Cell Stem Cell,2010,7(2):150-161.
[6] Jing D,Wobus M,Poitz DM,et al.Oxygen tension plays a critical role in the hematopoietic microenvironment in vitro [J].Haematologica,2012,97(3): 331-339.
[7]龚启梅.低氧对成体干细胞增值和分化的影响[J].国际口腔医学杂志，2011，38(6):696-699. [8]Zhang X,Li J,Sejas DP,Pang Q,et al.Hypoxia-reoxygenation induces premature senescence in FA bone marrow hematopoietic cells[J].Blood,2005,106(1):75-85.
[9] Parmar K,Mauch P,Vergilio JA,et al.Distribution of hematopotetic stem cells in the bone marrow according to regional hypoxia[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007;104(13):5431-5436.
[10] Eliasson P,J?nsson JI.The hematoppietic stem cell niche:low in Oxygen but a Nice place to be[J].J Cell Physiol,2010,222(1):17-22.
[11] Jang YY,Sharkis SJ.A low level of reactive oxygen species selects for primitive hematopoietic stem cslls that may reside in the low-oxygenic niche[J].Blood,2007,110(8):3056-3063.
[12] Fan J,Cai H,Tan WS.Role of the plasma memebrane ROS-generating NADPH oxidase in CD34+ progenitor cells preservation by hypoxia[J].J Biotechnol,2007,130(4):455-462.
[13] Alenze FQ,Alenazi BQ,Ahmad SY,et al.The haemopoietic stem cell:between apoptosis and self renewal[J].Yale J Biol med,2009,82(1):7-18.
[14] Je M,Ro man P,Lvanovié Z,et al.Concise review:the role of Oxygen in hematopoietic stem cell physiology[J].J Cell Physiol,2015,230(9):1999-2005.
[15] Chung C,Burdick JA,Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis[J].Tissue Eng Part A,2009,15(2):243-254.
[16] Nesic D,Whiteside R,Britterg M,et al.Cartilage tissue engineering for degenerative joint disease[J].Adv Drug Deliv Rev,2006,58(2):300-322.
论文作者:周晓红,杨鑫（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2017年8月第24期
论文发表时间:2017/9/5
标签：浓度论文; 细胞论文; 软骨论文; 凋亡论文; 小时论文; 氧气论文; 干细胞论文; 《医药前沿》2017年8月第24期论文;