杜育海 曹菁
【摘 要】 目的 探讨三联消石疗法对肝内胆管结石的疗效及治疗机理。方法 应用雄性豚鼠建立肝内胆管结石模型，对比观察应用三联消石疗法后，造模组豚鼠胆汁中C反应蛋白、黏蛋白及其肝脏超微结构、肝内胆管结石成石率的变化。结果 采用三联消石疗法豚鼠胆汁中C反应蛋白及黏蛋白含量明显降低（P <0.05），电镜观察发现其肝脏超微结构明显改善，肝内胆管成石率显著降低（P <0.05）。结论 三联消石疗法可降低豚鼠成石胆汁中C反应蛋白、黏蛋白的含量，并改善肝脏超微结构，逆转成石胆汁，从而起到治疗肝内胆管结石的作用。
【关键词】 三联消石疗法； 肝内胆管； 结石； 豚鼠； 电镜
肝内胆管结石主要为胆色素结石，其病因病机至今仍未阐明。目前认为，胆色素结石的形成与胆红素的过饱和沉淀、胆汁中黏蛋白及其他蛋白质比重的增多、胆道动力学异常等因素有关。胆汁中C反应蛋白及免疫机制、氧自由基等都参与胆色素结石的形成[1] 。胆汁中涉及炎症反应环节变化的C反应蛋白、黏蛋白等，与胆色素结石的形成密切相关。目前，临床对肝内胆管结石的治疗多采用手术，如肝叶或肝段切除、重建胆管通路等，或再配以溶石、碎石、取石相结合的治疗措施，然疗效欠佳。近年来，中医中药对胆道疾病的治疗优势愈发明显，可以预见，中西医结合治疗肝内胆管结石可能会成为其发展的方向[2] 。
我们在临床运用三联消石疗法（中药、针刺运动治疗、推按运经仪及部分西药）治疗肝内胆管结石取得了较好疗效的基础，并用该法肝内胆管结石豚鼠模型胆汁中C反应蛋白及黏蛋白的含量，及其肝脏超微结构、肝内胆管结石成石率进行了进一步的观察和研究，现报道如下：
材料和方法
1．实验动物
普通豚鼠60只，月龄2～3个月，体重250±20g，采用笼养方式。
2．实验药物和致石方法
中药汤剂补气养肝汤、疏肝通胆汤为山东青岛中西医结合医院的院内制剂。补气养肝汤由黄芪、党参、白术、茯苓等中药组成；疏肝通胆汤由大黄、茵陈、栀子、柴胡等重要组成。盐酸林可霉素注射液，规格：0.3 g/ ml。
3．动物分组、造模及药物处理
取豚鼠60只，随机分成3组，每组20只。每笼饲养豚鼠5只，先笼养1周以适应环境，然后进入实验状态。
3.1 正常对照组
每只每日喂适量青饲料并喂正常颗粒饲料50g ，喂养90d ，分上下午进食，并每日喂适量青饲料。
3.2 造模对照组
每只每日喂成石饲料［含正常饲料45.43 g, 致石药物4.57 g（其中酪蛋白1g，蔗糖1.5g， 纤维素1g，猪油1g，胆酸0.02 g， 胆固醇0.05 g）] 50g。喂养60d，后改用正常颗粒饲料喂养30d，并每日喂适量青饲料。
3.3 三联消石疗法对照组
每只每日喂成石饲料，共60d，后改用正常颗粒饲料加中药（前15d补气养肝汤，后15d疏肝通胆汤，分上下午）灌胃，药物剂量以成人用药剂量（60kg体质量，中药400ml/d）按实验动物体型系数换算法计算，中药1.67ml/d，中药连续给药30d。正常组与模型组均予等体积生理盐水灌胃。各组灌胃时间均为1次/d。从第61 日起，每日用固定器固定豚鼠，针刺一侧“膈俞”、“肝俞”、“阳陵泉”等穴，连接脉冲电针仪通电留针15min，以连续波、频率160 次/ min ，左右交替，每日1 次。同时，第61日起，每隔1日配合应用行推按运经法，在豚鼠最大耐受程度上按照肝内胆管走向推按，每次操作约10分钟。
4．标本采集和制备
实验结束后均禁食24 h，眼眶注射空气处死，迅速剖腹取出胆囊，观察有无结石、沉淀及絮状物，低温下切取肝脏组织，予1 %锇酸和2 %戊二醛双固定送检。
5．观察指标及方法
5.1 胆汁中C反应蛋白及黏蛋白的含量
采用Mgna FTIR-750型红外光谱仪测定豚鼠肝内胆管结石成分。采用磷钨酸沉淀-酚试剂法测定胆汁中黏蛋白的含量。采用胶乳凝集反应法-液体双相试剂法测定胆汁中C反应蛋白的含量。
5.2 肝脏超微结构
将双固定的肝、胆组织标本用树脂包埋，按电镜常规制备超薄切片，用醋酸铀与柠檬酸铅进行双染色，于日立H26002IV 型电镜观察并照相。
结 果
1．各组豚鼠肝内胆管成石情况
结果见表1。
与正常对照组比较，造模组MCP和CRP含量有显著统计学差异（△P <0.01）；与造模组比较，三联消石法组MCP和CRP含量差异有统计学意义（*P <0.05）。
4．各组豚鼠肝脏组织超微结构的变化
4.1 正常对照组
肝细胞核圆大，核膜核孔清晰。线粒体数量较多，呈长杆状或圆形，嵴多与内膜垂直排列，嵴上有小突起，基质丰富，电镜密度较高。内质网发达，呈管状或扁平囊状。粗面内质网表面附有密集的核蛋白小体，滑面内质网表面无颗粒，集结成堆，与糖原颗粒相随。胞质中糖原颗粒较多。毛细胆管清晰无胆栓，微绒毛致密细长。连接复合体紧密、完整。
4.2 造模对照组
肝细胞多变性，胞内脂滴大小不等，胞质内胆汁淤积，可见大小不等髓鞘样致密成层物质，糖原颗粒显著减少。 细胞核多不圆整，核间隙增大。线粒体肿胀，嵴结构破坏明显，基质密度下降。内质网池扩张并有脱颗粒现象。毛细胆管及微绒毛减少，毛细胆管扩张，管腔内致密颗粒物质、贮脂细胞增多，连接复合体扩张，肝血窦内枯否氏细胞增生，胞内可见细胞残、溶酶体、次级溶酶体。
4.3 三联消石疗法对照组
肝细胞结构基本正常，核圆整，核仁功能活跃。线粒体呈椭圆形，外膜平整，嵴数量增多，基质密度接近正常，稍肿胀。内质网形态正常，无扩张和脱颗粒现象。毛细胆管无扩张，未见胆栓，微绒毛数量及形正常。初级溶酶体增多，次级溶酶体较少。复合体连接紧密。肝细胞中偶见小脂滴，糖原颗粒增多。
讨 论
1．成石机制
肝脏是生成与分泌胆汁的主要器官，由大量肝细胞组成。本试验表明，由于低蛋白致石饲料对肝细胞的直接作用，导致肝细胞形态结构与功能紊乱，导致致石性病理胆汁形成和分泌，最终形成胆色素结石阻塞肝内胆管。由此可见，肝内胆管结石成石取决于肝细胞水平，同时，已形成的肝内胆管结石又能影响肝脏功能，从而加重肝实质的损害。因此，要逆转成石趋势，在治疗上必须改善肝脏代谢功能，提高肝脏的抗损害能力。
2．三联消石疗法的治疗机理
祖国医学认为，胆为中精之腑，以通为用，与肝互为表里，同主疏泄，与脾胃同属中焦，易受脾胃影响。脾主升清，胃主降浊，共为一身气机升降之枢。外受风寒、饮食不节、情志不畅，易伤脾胃而失于运化，而湿热内生，壅滞中焦，引起肝胆失于疏泄，日久化生有形之邪。同时，肝属木，脾属土，木克土，肝病易传于脾。而肝内胆管结石病人病程多较长，且反复发作，故除腹胀、腹痛、口苦、寒热往来、善太息等肝胆经病变外，常见胃脘胀满、嗳气、恶心呕吐、不欲饮食、乏力等脾胃症状。脾胃受损，易被肝胆病所掩盖，误当实证治疗，而重用通里攻下之品，致脾胃更虚。
我们根据祖国医学“正气存内，邪不可干”的理论，采用“先补脾胃，后泻肝胆”的方法，对肝内胆管结石病人先予中药补气健脾，疏肝理气，再通里攻下、清热利湿，配以现代电子技术刺激人体穴位，辅以超声直视下手法推拿，将经络学说、腧穴理论、推拿手法及电子技术相结合，刺激胆囊，使其强烈收缩，以增加胆道压力，再配以西药，使Oddi括约肌适时松弛，以助结石排出。
3．关于黏蛋白及C反应蛋白
肝内胆管结石是一种成因复杂的疾病，其形成与细菌感染、胆汁成分代谢异常、胆汁瘀滞等因素有关，涉及胆道梗阻与感染、黏蛋白、胆汁酸、氧自由基及脂蛋白代谢障碍等。C反应蛋白及黏蛋白是炎症反应及肝内胆管结石形成的重要环节，具有免疫识别及免疫调节的功能。近年研究发现，胆石病患者尤其在急性发作期血清中C反应蛋白的水平升高，且其随着炎症的减退而降低。三联消石疗法降低了肝内胆管豚鼠胆汁中黏蛋白及C反应蛋白的含量，而C反应蛋白在其成石过程的炎症环节上起一定作用，因此推断此疗法可抑制肝内胆管结石的形成，并逆转成石因素。
细菌感染是炎症形成的主因，炎症造成胆道感染，使胆道组织的抗损伤能力下降，胆管上皮不良再生，造成胆管狭窄、胆汁瘀滞，形成结石；同时，成石胆汁刺激管壁，引起管壁炎性反应，又加速了结石的形成。胆汁中的细菌产生大量β-葡萄糖醛酸苷酶，将结合性胆红素水解为游离胆红素，后者再与钙结合成为难溶的胆红素钙，沉淀形成结石。对于此过程，三联消石疗法能达到“扶正祛邪、通则不痛”的目的，成功阻遏成石胆汁的生成。
4．三联消石疗法对豚鼠肝内胆管和肝脏超微结构变化的影响
电镜观察发现，三联消石疗法组豚鼠肝内胆管、肝细胞与造模组比较：①肝内胆管上皮细胞炎症明显减轻，结构明显改善，细胞结构清晰。②肝细胞内脂滴和贮脂细胞减少，糖原颗粒增加，肝细胞损伤及变性程度减轻。③线粒体增多，基质密度接近正常，为肝细胞正常生理活动的能量来源提供了保障。④内质网恢复正常，无扩张和脱颗粒现象。光面内质网参与甾类物质的代谢，其形态与功能的正常是防止致石性病理胆汁形成的重要保障。粗面内质网和高尔基体的形态与功能的恢复，则是蛋白质及大分子物质等合成与转输的前提。⑤毛细胆管不扩张，微绒毛数量及形态恢复，保证了胆汁成分的分泌与排出，连接复合体的紧密完整，构成血胆屏障，保证了胆汁的定向流动。⑥肝细胞核圆整、核仁功能活跃，说明了肝细胞得到了较好的修复。
实验结论
1．三联消石疗法能改善肝功能水平，为肝内胆管结石的治疗打好基础。
2．三联消石疗法可降低胆汁中黏蛋白及C反应蛋白的含量，抑制肝内胆管结石的形成。
3．三联消石治疗从肝细胞水平阻断致石性病理胆汁的形成、分泌，从而起到治疗胆色素 结石形成及逆转成石趋势的作用。
参考文献
[1]关中正，唐乾利。胆色素结石形成的因素研究进展[ J ]。菏泽医学专科学校学报，2007，19 ( 1 )：68-73。
[2]张静喆。肝胆管结石的中西医结合治疗[ J ]。肝胆胰外科杂志，2006,18（3）：68-73。
论文作者:杜育海,曹菁
论文发表刊物:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年2月第4期
论文发表时间:2016/7/14
标签：胆管论文; 结石论文; 胆汁论文; 豚鼠论文; 蛋白论文; 疗法论文; 内质网论文; 《中华临床医师杂志》(电子版)2016年2月第4期论文;