朱益[1]2004年在《前列腺素A对血小板活化的抑制作用及其机制研究》文中研究说明目的：研究环戊烯酮类前列腺素PGA对血小板功能的影响，并阐明其抗血小板功能机制，为其治疗缺血性脑中风的作用机制提供新的解释。方法：用比浊法测定血小板聚集率，用放射性核苷掺入法测定血小板黏附率，荧光分光光度法和放免法测定血小板内颗粒内容物5—羟色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)的释放和血栓烷B_2(Thromboxane B_2，TXB_2)的生成。用透射电镜观察PGA对于活化血小板形态变化的抑制作用。流式细胞仪检测血小板胞浆内钙离子浓度的改变。WESTERN BLOT检测PGA对血小板c-jun N末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)磷酸化的作用。结果：PGA小、中、大剂量组对于凝血酶、胶原、ADP诱导的血小板聚集有明显的抑制作用(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，并能抑制凝血酶引起的血小板和内皮细胞、基质的黏附作用(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，同时可以抑制凝血酶诱导的血小板颗粒释放5-HT和TXB_2合成；电镜下观察，经过凝血酶刺激后的血小板可见伪足生成和脱颗粒，PGA可明显抑制凝血酶引起的这些形态改变。PGA能够抑制凝血酶诱导的血小板内钙离子浓度的升高(P＜0.05)，并可抑制凝血酶诱导的血小板JNK的磷酸化。结论：PGA具有抑制血小板活化的作用，其机制与抑制钙离子的内流、TXA_2的合成及JNK的磷酸化有关。
邱培[2]2015年在《不同儿茶素对人体血小板聚集活性的影响》文中指出随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变,血栓性疾病已成为威胁人们健康的首要疾病,血小板的异常激活是此类疾病的病理基础,抗血小板药物成为了治疗相关血栓性疾病的主要手段。流行病学及许多临床研究表明,长期饮茶对于心血管疾病如动脉粥样硬化等能起到预防和治疗作用,茶叶中的茶多酚尤其是儿茶素对此发挥了重要的作用。茶叶中的儿茶素按照化学结构及空间构型的不同,分为很多种不同的种类,其中,研究最为广泛且在茶叶中含量最多的是表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate, EGCG)。本文基于前人的研究,选取包含EGCG在内的六种儿茶素,分别为儿茶素(Catechin, C),表儿茶素(Epicatechin, EC),表没食子儿茶素Epigallocatechin, EGC),儿茶素没食子酸酯(Catechin gallate, CG),表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate, ECG),从结构上了比较六种儿茶素单体对血小板功能影响的差异,并对其可能的作用机制进行了深入探索。利用血小板激活剂ADP,凝血酶,胶原及U46619诱导血小板聚集,通过添加不同浓度的儿茶素预孵育血小板,测定其对血小板的聚集活性的影响。结果表明：在0-150μM的浓度范围内,EGC、CG、ECG和EGCG呈现浓度依赖性地抑制由ADP引起的血小板聚集,其中,EGCG抑制作用最强；在由凝血酶诱导的血小板聚集中,EGCG在50μM时对血小板聚集产生抑制作用,其它五种儿茶素没有表现出显着的抑制效果；在U46619引起的血小板聚集中,CG和EGCG都能在50μM表现出对血小板的抑制作用,且作用效果CG>EGCG;用胶原诱导血小板聚集时,CG, ECG和EGCG对血小板聚集产生了明显抑制,有效抑制浓度都是50μM,抑制效果：CG>ECG>EGCG。我们研究发现,儿茶素对ADP引起的血小板聚集抑制效果较好,因此在ADP信号通路上继续研究其可能存在的抗血小板作用机制。六种儿茶素分别与阿司匹林共同作用于血小板,EGC和ECG可能和阿斯匹林具有相似的作用通路,通过作用于COX-1抑制TxA2的生成起到抗血小板的作用,而CG和EGCG则可能通过除COX途径的其它信号通路对血小板活性产生影响；同时,EGC、CG、ECG和EGCG在100μM下都能够显着抑制血小板在纤维蛋白原上的铺展,表明四个物质可以抑制血小板从外到内的信号通路(Outside-in signaling);用流式细胞仪检测PAC-1和P-选择素在血小板上的表达,结果发现,只有EGCG能显着抑制P-选择素在血小板上的表达,ECG和EGCG可以抑制PAC-1的表达,抑制作用EGCG>ECG;免疫蛋白实验对ADP的信号通路进行检测,发现EGC. CG. ECG和EGCG可以抑制Akt473/308、p38、Erk和PKC基质的部分蛋白的磷酸化；CG, ECG和EGCG可以抑制由ADP诱导的血小板cAMP的下降。本研究结果表明,所选取的六种儿茶素,含有没食子酰基的儿茶素(CG, ECG, EGCG)和不含没食子酸但是在B环含有叁羟基的ECG都具有抗血小板聚集的功效,这种特异性结构可能成为开发一种新的抗血小板药物的结构基础。
梁明露[3]2016年在《五甲基槲皮素抗血小板及抗血栓作用研究》文中进行了进一步梳理第一部分五甲基槲皮素对正常人血小板的作用及其机制研究目的：研究五甲基槲皮素(Pentamethylquercetin, PMQ)对正常人血小板功能的影响,并探索其机制。方法：采用乳酸脱氢酶细胞毒性试剂盒检测五甲基槲皮素对人洗涤血小板的细胞毒性；采用血小板聚集仪检测五甲基槲皮素对不同诱导剂(ADP、胶原、凝血酶、U46619、肾上腺素和PDBu)诱导的血小板聚集的影响,及其对不同激动剂(胶原和凝血酶)诱导的ADP释放的作用；采用流式细胞术检测五甲基槲皮素对不同激动剂(胶原和凝血酶)诱导血小板激活时P-selectin的表达；采用免疫荧光法检测五甲基槲皮素对血小板在胶原上黏附功能的影响;采用Westernblot检测五甲基槲皮素对血小板的共同信号通路蛋白表达情况的影响；采用免疫荧光法检测五甲基槲皮素对血小板在固化纤维蛋白原上扩展功能的影响；检测五甲基槲皮素对血块回缩的影响;采用、Vestern blot检测五甲基槲皮素对血小板“由外向内”信号转导的影响。结果：①五甲基槲皮素对血小板无细胞毒性作用。②五甲基槲皮素可以抑制小剂量ADP和胶原诱导的人富血小板血浆(PRP)的聚集,延长小剂量肾上腺素诱导的人PRP到达最大聚集的时间,但是不能降低在肾上腺素刺激下血小板的最大聚集率,而对大剂量的各种激动剂致PRP聚集则无明显抑制作用。③五甲基槲皮素可以抑制胶原、凝血酶、U46619和PDBu (PKC激动剂)诱导的人洗涤血小板的聚集。④五甲基槲皮素可抑制胶原和凝血酶诱导的人血小板颗粒释放。⑤五甲基槲皮素可减少血小板在胶原上的黏附。⑥免疫印迹分析显示,五甲基槲皮素抑制被不同激动剂激活的血小板共同信号通路PI3K-Akt-GSK3β, MAPK-ERK1/2和Syk-PLCγ2。⑦五甲基槲皮素可减少血小板在固化纤维蛋白原上的扩展。⑧五甲基槲皮素可以减少血块回缩。⑨五甲基槲皮素可以抑制血小板活化的重要步骤—“由外向内”信号转导。结论：五甲基槲皮素可能通过抑制PI3K-Akt-GSK3β、MAPK-ERK1/2、 Syk-PLCy2通路,从而抑制血小板“由内向外”和“由外向内”信号转导,进而抑制血小板聚集、释放、黏附和扩展,发挥抗血小板作用。第二部分五甲基槲皮素在动物体内的抗栓作用目的：研究五甲基槲皮素对动物体内血栓形成的影响。方法：应用血小板聚集仪,检测在体给予五甲基槲皮素后,大鼠血小板聚集情况的变化；建立胶原+肾上腺素诱导的小鼠急性肺栓塞模型,分析五甲基槲皮素对急性肺栓塞小鼠存活率的影响及相应肺组织病理改变情况；建立氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓模型,检测五甲基槲皮素对血栓形成的影响；采用小鼠断尾出血模型,检测五甲基槲皮素对生理止血的影响。结果：①体内使用五甲基槲皮素可以抑制胶原和凝血酶诱导的血小板聚集。②胶原+肾上腺素诱导的小鼠急性肺栓塞模型显示：五甲基槲皮素可以显着降低小鼠死亡率；肺组织病理切片显示：五甲基槲皮素可减少微血管血栓形成。③氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓形成模型显示：五甲基槲皮素可以缓解氯化铁引起的颈动脉损伤后所引起的血流量下降。④小鼠断尾出血模型显示：五甲基槲皮素对生理性止血无影响。结论：五甲基槲皮素可抑制小鼠血栓形成。
范华英[4]2012年在《丹酚酸A抗血小板及抗血栓作用的研究》文中指出血栓形成在心脑血管疾病如不稳定性心绞痛、心肌梗死、短暂性缺血发作和动脉粥样硬化等的发生和发展中起着促进作用。血小板在血管受损部位的血栓形成中扮演着重要角色，特别是动脉血栓及微血管血栓，是导致心脑血管疾病的主要原因。临床荟萃分析显示，抗血小板治疗能够有效预防高危血管闭塞事件病人严重血管危象、动脉闭塞、静脉栓塞等疾病的发生。因此，具有抗血小板及抗血栓作用的物质具有广泛治疗循环系统疾病的潜力。目前临床上应用的抗血小板药物种类较多，主要有：阿司匹林、氯吡格雷、阿昔单抗等。这些药物虽可有效抑制血小板内某一信号通路引起的血小板聚集，但不良反应较多(过敏反应、胃粘膜损伤、严重出血、造血功能障碍等)。同时，由于多数药物作用机制单一，病人服用某一类药物抑制血小板活性后，机体仍可通过其它信号通路引起血小板激活，从而，治疗效果被减弱，复发性缺血事件的发生和由此引起的死亡率仍居高不下。而部分人群对阿司匹林和氯吡格雷抵抗或反应性低，有的病人同时对两药抵抗。为此，寻找疗效显着且安全性高的抗血小板药物仍为各国研究者关注的重点。丹参为唇形科植物丹参的干燥根或根茎，是我国传统活血化瘀要药。临床使用表明：各种丹参制剂能够有效预防和治疗心血管疾病、高血脂症和脑血管疾病。丹酚酸A(salvianolic acidA, SAA)为丹参中的水溶性酚酸类化合物，有很强的保护细胞膜免受氧化应激损伤的作用。现代药理研究表明：丹酚酸A具有广泛的药理活性，它能够清除氧自由基从而对抗氧化应激引起的大鼠心脏和肝线粒体损伤、有效预防脑组织缺血损伤及减轻心肌缺血再灌注损伤，作用较其它酚酸类化合物强。有关丹酚酸A对血栓形成和血小板功能的影响至今尚未见详细报道。为此，本研究通过测定丹酚酸A对血小板功能、血栓形成、血液流变性及凝血系统的影响来评价丹酚酸A的作用，并探讨其可能的作用机制，为丹酚酸A的临床应用提供药理学基础。本研究采用以下方法评价丹酚酸A对血栓形成和血小板功能的影响：1.采用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)、凝血酶、花生四烯酸(arachidonic acid, AA)作为诱导剂，测定血小板最大聚集率及血小板中环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)含量，评价丹酚酸A体内外抗大鼠血小板聚集的作用。2.采用ADP诱导洗涤人血小板聚集，评价丹酚酸A对人血小板聚集的作用。3.建立大鼠动-静脉旁路血栓模型，通过测定血栓重量、检测血浆中血栓素B2(thromboxane B2, TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-keto prostaglandin F1α,6-keto-PGF1α)、cAMP含量，评价丹酚酸A的抗血栓活性。4.采用肾上腺素皮下注射合冷水刺激的方法建立大鼠血液瘀滞模型，通过检测大鼠血液流变参数，评价丹酚酸A对血液流变性的影响。5.为明确丹酚酸A对凝血系统的影响，大鼠连续多次静脉注射丹酚酸A，通过测定凝血参数：凝血酶原时间(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time, APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen, FIB)含量、凝血酶时间(thrombin time, TT)来评价丹酚酸A对凝血系统的影响，预测丹酚酸A的出血反应情况。本研究结果显示：1.丹酚酸A体外可有效抑制ADP和凝血酶诱导的血小板聚集，对AA诱导的血小板聚集抑制作用较弱。在人血小板聚集实验中，丹酚酸A对ADP诱导的血小板聚集具有强大的抑制作用。同时，丹酚酸A显着增加血小板中cAMP含量。2.丹酚酸A呈剂量依赖性抑制ADP诱导的大鼠血小板聚集。3.丹酚酸A显着抑制大鼠动-静脉旁路血栓形成，作用呈剂量依赖性；丹酚酸A对大鼠血浆中TXB2，6-keto-PGF1α含量及二者比值没有明显影响，但是可显著升高血浆cAMP含量。4.丹酚酸A能够改善血瘀模型大鼠血液流变性，显着降低大鼠全血粘度，血浆粘度和红细胞压积。5.丹酚酸A对凝血参数PT、APTT、FIB、TT没有直接作用。以上研究结果表明：丹酚酸A具有显着的抗血栓、抗血小板聚集和改善血液流变性的作用，并且在抗血栓和抗血小板的同时不影响凝血系统。丹酚酸A抗血栓及抗血小板作用机制可能与升高cAMP含量有关。
张立晶[5]2016年在《PCI术后氯吡格雷抵抗人群证候特点及血府逐瘀胶囊干预的临床评价》文中进行了进一步梳理抗血小板治疗在经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)后预防支架内血栓形成方面起着决定性的作用。但即使进行了充分的阿司匹林加氯吡格雷双联抗血小板治疗,还会有一定比例的支架内血栓形成及再狭窄发生。很多PCI术后患者在客观影像学证据显示血管内无明显狭窄的情况下,仍存在着不同程度的胸闷、胸痛、焦虑等一系列不适症状。研究发现不同患者对相同剂量氯吡格雷的反应性不同,甚至有部分患者对氯吡格雷无反应,即存在氯吡格雷抵抗。鉴于目前部分患者存在氯吡格雷抵抗现象,抗血小板药物的有效性尚存不足,所以从传统的活血化瘀中药中寻找高效、低副作用的抗血小板药物成为研究的热点。陈可冀院士等认为支架置入后的血管内膜损伤实际上与传统意义上的“外伤致瘀”认识基本一致。传统医学认为瘀血痹阻、血脉不畅,可导致胸闷、胸痛,以及续发的一些表现,故活血化瘀治疗会改善症状及预后。但是,目前对PCI术后氯吡格雷抵抗人群的中医证型研究较少,本研究旨在广泛收集临床PCI术后病例资料,初步探索了解PCI术后行双联抗血小板治疗患者的基线证型分布以及氯吡格雷抵抗人群的证候分布特点,并综合评价应用血府逐瘀胶囊干预氯吡格雷抵抗的临床疗效及安全性。研究目的：1.初步探索PCI术后氯吡格雷抵抗的发生率及氯吡格雷抵抗人群的中医证型分布特点,以期寻找适当的中医药治疗方法。2.综合评价活血化瘀药联合标准双联抗血小板药物的临床疗效及安全性。研究方法：1.纳入2013年1月1日至2014年12月31日在北京中医药大学东直门医院成功进行PCI治疗,并接受标准双联抗血小板治疗的冠心病患者308例。采集患者的一般资料,填写中医证候要素量表。在双联抗血小板治疗第7天留取患者静脉血进行检测,最后对采集的数据进行统计分析。2.采用随机、对照的方法,共选择出冠心病PCI术后氯吡格雷抵抗的血瘀证患者60例,随机分为活血化瘀组(活血组)和双联抗血小板组(对照组)两组。两组患者的西医常规治疗均按照治疗冠心病的相关建议和指南进行,并保持不同组别西医干预的一致性。对照组继续常规阿司匹林与氯吡格雷抗血小板治疗,活血组在标准双联抗血小板治疗的基础上,加用血府逐瘀胶囊(6粒/次,每日两次)进行干预治疗,4周为一疗程(患者30天内连续服药28±4天)。观察血脂、血瘀证计分、中医症状计分等相关疗效指标的变化,并借助血栓弹力图仪,在两个时间点对患者进行血小板活性及凝血功能的监测,即ADP诱导的血小板-纤维蛋白凝块强度(MAADP),综合分析活血化瘀疗法抗血小板治疗的临床疗效及安全性,并对比血瘀证计分等的变化,探讨PCI术后血瘀证计分与血小板活性之间的关系。结果：1.血瘀证是冠心病PCI术后的主要证候类型2.气虚血瘀证是冠心病PCI术后氯吡格雷抵抗的主要证候类型3.不同证候类型冠心病PCI术后氯吡格雷抵抗患者的血小板功能(MAADP)、血糖(GLU)存在差异,具有统计学意义(P<0.05)。4.活血组治疗后血小板活性较治疗前明显降低(MAADP值明显降低),差异有统计学意义(P<0.05)：对照组的MAADP值没有明显变化(P>0.05)。5.活血组治疗后血瘀证计分值较治疗前明显下降,有非常显着性差异(P<0.01)：对照组治疗前后无显着性差异(P>0.05)。两组间治疗后计分值比较有显着性差异(P<0.05)。6.活血组的心绞痛症状计分值治疗后较治疗前明显降低(P=0.001)；对照组的心绞痛症状计分值治疗后较治疗前也有改善(P=0.04)；但不及活血组改善明显,两组间比较有显着性差异(P<0.05)。7.两组TC、TG、LDL水平治疗后均显着降低(P<0.05)；但两组之间没有显着性差异。8.中医症状计分值,对照组治疗前后比较没有差异(P>0.05)；活血组治疗后较治疗前则有明显下降(P<0.01)；两组间治疗后计分值比较有显着性差异(P<0.05)。9.两组在观察期间凝血四项结果没有显着差异,且均未有出血事件发生。结论：1.血瘀证是冠心病PCI术后的主要证候类型2.在常规双联抗血小板治疗的基础上加用活血化瘀中药有改善氯吡格雷抵抗的作用,从而减少PCI术后近、远期支架内血栓和再狭窄的发生率,降低PCI术后近期和远期再发缺血事件的风险,且不增加出血风险。
李敬[6]2006年在《鼠尾藻多酚的抗凝血活性及其作用机制研究》文中提出本论文以鼠尾藻(Sargassum thunbeergii Kuntze)原料，通过优化提取工艺提取分离得到具有特异生理活性的物质——鼠尾藻多酚，并对其抗凝血活性和抗凝血机制进行了实验研究，得出以下实验结果：1．通过实验优化了鼠尾藻多酚的提取、纯化工艺流程。本实验将鼠尾藻多酚透析内、外液依据其分子量的不同进行优化分级，从而达到进一步纯化鼠尾藻多酚的目的。2．通过动物实验测定BT、CT、APTT、PT、TT时间检验鼠尾藻多酚的抗凝血活性。实验表明，鼠尾藻多酚各分级级分均具有良好的抗凝血效果；采取同样的测定手段对鼠尾藻多酚各分级级分的抗凝血效果进行比较后发现，鼠尾藻多酚的抗凝血效果与多酚各分级级分的分子量大小存在密切关系，即随着鼠尾藻多酚分级级分分子量的增大其抗凝血效果也显着增强。同时，通过实验测定还发现鼠尾藻多酚分级级分中分子量大于1.0×10~5的多酚分级级分具有最佳的抗凝血效果。3．通过动物实验测定鼠尾藻多酚对大鼠体内APTT、PT、TT时间的影响、对血小板聚集性的影响、对血小板MDA生成量的影响、对血浆中TXB_2和6-Keto-PGF_(1a)含量的影响和对ADP激活后血小板内钙离子浓度变化的影响后，发现鼠尾藻多酚能够显着的抑制血小板聚集；并且鼠尾藻多酚能够在降低大鼠血浆中TXB_2含量的同时升高血浆中6-Keto-PGF_(1a)的含量；另外，鼠尾藻多酚还可以显着地抑制血小板内钙离子水平的升高。通过实验数据推知鼠尾藻多酚的抗凝血作用可能与鼠尾藻多酚能够螯和血浆中游离的钙离子有关。由于血浆中钙离子浓度的下降，正常内、外源凝血途径的启动受到抑制，血小板的粘附、聚集和释放过程受阻，从而使凝血和血小板聚集时间显着延长。提示鼠尾藻多酚在防治心脑血管疾病方面具有良好的开发和应用前景。
王铭铭[7]2016年在《益气活血中药配伍联合双抗抗血小板的作用与机制研究》文中研究说明阿司匹林(Aspirin, ASA)和氯吡格雷(Clopidogrel.CLP)组成的双联抗血小板(Dual antiplatelet therapy)是急性冠脉综合症(Acute coronary syndrome,ACS)患者经皮冠状动脉介入术(Percutaneous coronary intervention, PCI)后一年内的常规治疗方案。ASA不可逆地乙酰化血小板环氧化酶-1(Cyclooxygenase-1, COX-1),减少血栓素(Thromboxane, TXA2)产生,抑制花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)诱导的血小板活化,但对凝血酶、二磷酸腺苷(Adenosinediphosphate, ADP)等其他诱导剂诱导的血小板活化的抑制作用较弱；CLP特异性地、不可逆地阻断血小板P2Y12受体,抑制其下游PI3K/Akt通路,抑制血小板聚集。与单用ASA或CLP相比,双抗具有更好的抗血小板作用,但ACS患者PCI后即使长期服用双抗,1年内血栓事件发生率仍达7.4%-16.5%；同时,仍有1.3%的患者在30天内出现消化道出血。因此,如何有效抑制血小板活化,同时又可减少双抗引起的胃粘膜损伤,是目前面临的挑战。内皮-血小板粘附是动脉血栓形成的始动环节。内皮损伤可诱导血小板粘附活化,活化的血小板又可加重内皮损伤,促进血栓形成。ASA抑制血管局部COX,可导致损伤内皮的修复延迟；CLP可抑制PI3K/Akt通路,促进内皮细胞凋亡。双抗是否会影响内皮细胞损伤诱导的血小板粘附和活化,目前尚缺乏报道。胃粘膜上皮细胞COX-1和COX-2均可介导前列腺素E2 (Prostaglandin E2, PGE2)和前列环素(Prostaglandin I2, Prostacyclin, PGI2)的合成。PGE2促进胃粘膜上皮细胞增生,增强胃粘膜上皮细胞连接,维持胃粘膜上皮细胞正常的通透性；PGI2改善局部血液循环,促进损伤胃粘膜的修复。ASA和CLP均可直接诱导胃粘膜上皮细胞凋亡和通透性升高。GTP-结合蛋白RhoA对细胞间连接蛋白的表达和细胞通透性的维持具有重要作用,PI3K/Akt通路作为RhoA的上游通路,可减轻RhoA介导的细胞通透性升高。双抗对胃粘膜上皮细胞的损伤机制是否与胃粘膜上皮细胞COX/前列腺素(Prostaglandins, PGs)通路和PI3K/Akt/RhoA通路有关,亦未见有研究报道。西洋参和叁七配伍是益气活血的常用配伍之一,被广泛应用于冠心病等血栓性疾病的治疗。既往研究证实,益气活血中药联合双抗和单用双抗相比,可显着降低PCI术后患者的血栓事件发生率,且不增加出血风险。西洋参茎叶总皂苷(Panax quinquefolium saponin, PQS)作为上市中成药,在国内用于冠心病治疗近20年,临床试验证明,PQS可显着减轻冠心病心绞痛症状和缺血心电图改变。实验研究显示,PQS可上调内皮细胞P13K/Akt通路蛋白表达,减轻内皮细胞氧化应激损伤。PQS联合双抗可以降低心肌梗死大鼠血清内皮素(Endothelin-1, ET-1)浓度,升高血清一氧化氮(Nitric oxide, NO)浓度。叁七总皂苷(Panax notoginseng saponin, PNS)可减轻内皮细胞氧化应激损伤,抑制ADP或胶原诱导的血小板活化。PNS联合双抗与单用双抗相比,可以显着降低PCI术后1年内心血管事件发生率,但目前尚缺乏关于PNS与ASA在抗血小板方面的比较研究。既往研究证实PNS可上调人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)内PI3K/Akt/GSK-3β通路蛋白表达,减轻细胞凋亡。PNS对双抗诱导的胃粘膜上皮细胞凋亡和通透性升高有何作用,其机制是否也涉及PI3K/Akt/RhoA通路和COX通路,以往尚缺乏研究。围绕以上问题,本研究提出如下假说：(1)在双抗基础上联用PQS或PNS,可进一步抑制内皮损伤诱导的血小板粘附和活化；(2)PQS联合双抗可通过调节PI3K/Akt通路发挥内皮细胞保护作用；(3)PNS可抑制内皮损伤诱导的血小板活化,机理可能涉及对内皮细胞和血小板COX通路的抑制；(4)PNS通过调节胃粘膜上皮细胞COX/PGs、PI3K/Akt/RhoA和PI3K/Akt/GSK-3β通路,减轻双抗诱导的胃粘膜上皮细胞凋亡和通透性升高。针对以上假说,本研究进行叁部分研究：实验一益气活血中药有效部位联合双抗对内皮损伤诱导血小板粘附的影响目的：观察PQS+双抗、PNS+双抗及PQS与PNS配伍联合双抗对内皮损伤诱导的血小板粘附的作用,并从PI3K/Akt、COX-2/6-keto-PGFlα和COX-1/TXB:通路探讨其机制。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),加入氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)(终浓度：80 mg/L)干预HUVEC 16h,建立HUVEC损伤模型。损伤的HUVEC随机分为模型组、双抗组(ASA15μg/ml+氯吡格雷10μg/ml)、PQS (160μg/ml)+双抗组,PNS (160μg/ml)+双抗组,PQS (160μg/ml)+PNS (160μg/ml)+双抗组及P13K特异性抑制剂(LY294002,30μg/ml)+PQS+双抗组,同时设空白组作为对照。造模16h后,HUVEC中加入静息血小板共同孵育5min。流式细胞术检测HUVEC凋亡率、血小板粘附程度和血小板CD62p表达；放免法检测HUVEC上清液中6-keto-PGFla和TXB2浓度；Western-blot检测HUVEC和血小板中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、COX-1、COX-2的蛋白表达。结果：与空白组比较,模型组HUVEC凋亡率、血小板粘附、血小板CD62p表达均升高(P<0.05),细胞培养上清液中6-keto-PGFla浓度、TXB2浓度均升高(P<0.05),HUVEC中p-Akt蛋白表达降低、COX-2蛋白表达升高(P<0.05),血小板中p-Akt蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组比较,双抗组血小板粘附、血小板CD62p表达均降低(P<0.05),HUVEC凋亡率无显着变化(P>0.05),细胞培养上清液中6-keto-PGFla浓度、TXB2浓度均降低(P<0.05),HUVEC中COX-2蛋白表达降低(P<0.05), p-Akt蛋白表达无明显变化(P>0.05),血小板中p-Akt蛋白表达降低(P<0.05)。与双抗组比较,PQS+双抗组血小板粘附、HUVEC凋亡率均降低(P<0.05),血小板CD62p表达无明显变化(P>0.05),上清液6-keto-PGFla浓度升高(P<0.05),HUVEC p-Akt蛋白表达升高(P<0.05)；加入LY294002后,HUVEC凋亡率、血小板粘附均升高(P<0.05)。与双抗组相比,PNS+双抗组血小板粘附.HUVEC凋亡率均降低(P<0.05),血小板CD62P表达无明显改变(P>0.05),上清液6-keto-PGFla浓度升高(P<0.05),HUVEC中COX-2蛋白表达升高(P<0.05),血小板COX-1蛋白表达降低(P<0.05)。与PQS+双抗组比较,PQS+PNS+双抗组内皮细胞凋亡率、血小板粘附和CD62p表达均降低(P<0.05),血小板COX-1蛋白表达降低(P<0.05)。与PNS+双抗组比较,PQS+PNS+双抗组内皮细胞凋亡率和血小板粘附均降低(P<0.05), CD62p表达无明显改变(P>0.05)。结论：PQS联合双抗或PNS联合双抗均可抑制内皮细胞凋亡和内皮损伤诱导的血小板粘附,PQS与PNS配伍联合双抗,效果更显着,其机制涉及对内皮细胞PI3K/Akt通路、C0X-2/PGL通路的促进和对血小板PI3K/Akt通路、C0X-l/TXA2通路的抑制。实验二：叁七总皂苷对内皮损伤诱导血小板粘附的作用与机制研究目的：观察PNS和ASA对ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡及凋亡内皮细胞诱导的血小板活化和粘附的作用,并从COX通路探讨其机制。方法：体外培养HUVEC,加入ox-LDL(终浓度：80 mg/L)干预HUVEC 16h建立HUVEC损伤模型。损伤的HUVEC随机分为模型组,ASA组(15μg/ml),PNS组(160μg/ml),同时设置空白组作为对照。造模16h后,HUVEC中加入静息血小板共同孵育5min。流式细胞术检测HUVEC凋亡率、血小板粘附和血小板CD62p表达,放免法检测细胞培养上清液6-keto-PGFla和TXB2水平,Western-blot检测HUVEC和血小板中COX-1、COX-2蛋白表达。结果：与空白组相比,模型组HUVEC凋亡率、血小板粘附、血小板CD62p表达均显着升高(P<0.05),细胞培养上清液6-keto-PGF1a和TXB2水平均升高(P<0.05)。与模型组比较,ASA组HUVEC凋亡率升高,血小板粘附和血小板CD62p表达均降低(P<0.05),细胞培养上清液6-keto-PGF1a和TXB：水平均降低(P<0.05)。与ASA组比较,PNS组HUVEC凋亡率和血小板粘附均显着降低(P<0.05),细胞培养上清液6-keto-PGF1a水平升高(P<0.05), TXB2水平降低(P<0.05),HUVEC中COX-2蛋白表达升高(P>0.05),血小板COX-1蛋白表达降低(P<0.05)。结论：ASA与PNS均可抑制内皮损伤诱导的血小板粘附与活化,其中与ASA相比,PNS抑制血小板粘附的作用更显着,其机制涉及PNS对血小板COX-1/TXA2通路的抑制和对内皮细胞COX-2/PGI2通路的促进作用。实验叁：叁七总皂苷对双抗引起的胃粘膜上皮细胞损伤的影响目的：观察PNS对双抗诱导的胃粘膜上皮细胞凋亡和通透性升高的影响,并从COX通路和PI3K/Akt通路探讨其作用机制。方法：体外培养人胃粘膜上皮细胞(GES-1),随机分为空白组、双抗组、PNS+双抗组.LY294002+PNS+双抗组。流式细胞术检测GES-1凋亡率,酶标仪测定GES-1细胞通透性,放免法检测GES-1细胞培养上清液PGE2、6-keto-PGFla浓度,ELISA法检测GES-1细胞培养上清液血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)浓度。Western-blot检测GES-1中COX-1、COX-2、PI3K、 p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、RhoA、GTP-RhoA蛋白表达。结果：与空白组比较,双抗组GES-1凋亡率、通透性均显着升高(P<0.05),PGE2、 6-keto-PGFla和VEGF浓度均降低(P<0.05), COX-1、p-PI3K、p-Akt蛋白表达均降低(P<0.05), COX-2、GTP-RhoA、GSK-3β蛋白表达均升高(P<0.05)。与双抗组比较,PNS+双抗组GES-1凋亡率与通透性均降低(P<0.05),PGE2、6-keto-PGF1 a和VEGF浓度均升高(P<0.05),COX-1、p-PI3K、p-Akt蛋白表达均升高(P<0.05),COX-2、GTP-RhoA、GSK-3β蛋白表达均降低(P<0.05);加入LY294002后,COX-1和COX-2蛋白表达无影响(P>0.05),GES-1凋亡率和通透性均显着升高(P<0.05),GTP-RhoA及GSK-3β蛋白表达均升高(P<0.05)。结论：PNS可以减轻双抗对胃粘膜上皮细胞中COX/PG通路的抑制,减轻双抗诱导的胃粘膜上皮细胞凋亡和通透性升高,机制涉及对胃粘膜上皮细胞PI3K/Akt/GSK-3β-VEGF-RhoA通路的调节。
程浩[8]2016年在《茶黄素对胶原引起的血小板功能的影响及其抗血栓作用研究》文中进行了进一步梳理心血管疾病,包括中风、血栓性疾病、动脉粥样硬化等,一直以来是导致死亡的主要原因之一,血小板在心血管疾病的发展过程中扮演着重要的角色,因此抗血小板治疗成为预防和治疗心血管疾病的主要手段。然而目前临床使用的抗血小板药物,如阿司匹林,存在着出血、引起胃肠道不适等副作用,寻找天然活性来源的抗血小板物质成为预防和治疗心血管疾病研究的热点之一。红茶是世界上消费量最大的饮料之一,流行病学研究表明饮用红茶具有预防心血管疾病的作用,其临床研究结果多集中在降血脂,改善血液循环等领域,在对血小板活性的影响方面较少涉及。茶黄素作为红茶的特征品质成分,具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种生物活性,在心血管健康方面也表现出保护作用。然而,显少有针对茶黄素单体在血小板活性影响以及抗血栓作用方面的研究,尤其在其作用机理的深入探讨方面研究甚少。本研究探索了红茶主要活性成分茶黄素对胶原引起血小板活性的影响以及其抗血栓作用。以茶黄素为研究对象,将从人体血液中分离出来洗涤血小板,建立不同的研究体系,利用血小板聚集仪、流式细胞仪、血栓素A2试剂盒、免疫印迹等技术进行系统性的分析,并结合体内实验,利用C57小鼠研究茶黄素的止血功能和对体内血栓形成的影响。研究结果表明,茶黄素可以明显抑制由胶原、ADP、U46619等多种刺激剂引起的人体血小板聚集,且呈现出剂量依赖效应。利用流式细胞仪进行单个血小板激活检测时发现,茶黄素对蛇毒引起的P-选择素表达和纤维蛋白原的结合有明显的抑制作用。茶黄素可以抑制血小板在纤维蛋白原上的铺展,由此证明了茶黄素对血小板从外到内的信号通路的抑制活性。免疫印迹实验表明,茶黄素抑制胶原引起的血小板内脾酪酸激酶(Syk)的磷酸化,由此推测,Syk是茶黄素抑制胶原引起的血小板活性的一个重要的作用靶点。通过应用Syk的抑制剂白杉醇(Piceatannol)进行对比和迭加实验,进一步证明了茶黄素对血小板的作用靶点是Syk,同时,Syk下游两个蛋白PLCγ2和Akt的磷酸化受到相应抑制,也在本实验中得以验证。小鼠体内活性研究中,利用断尾技术研究茶黄素的止血活性,利用叁氯化铁诱导形成体内动脉血栓模型,并采用血小板的体内荧光标记技术,研究茶黄素的抗血栓活性。茶黄素组和对照组相比,使小鼠肠系膜动脉血管形成血栓性堵塞的时间明显延长,充分证明了茶黄素对血小板功能的抑制。本文明确了茶黄素的体内外抗血栓活性,首次探明茶黄素抑制血小板活化的作用靶点,即茶黄素能够通过抑制血小板活化通路中的Syk以及PLCγ2磷酸化进而抑制由胶原引起的人体血小板活化和聚集,并能够显着抑制小鼠体内血栓的形成。作为饮食来源的天然活性成分,茶黄素表现出良好的抑制血小板活化的作用和抗血栓能力,有力地诠释了长期饮用红茶对人体心血管健康的保护作用。
潘嫦娥[9]2012年在《BF066抗血小板、抗血栓作用及其机制的研究》文中研究指明背景和目的：血管栓塞性疾病是目前世界范围内发病率和致死率最高的疾病,血小板在血栓的形成过程中发挥了极为重要的作用,因此,抗血小板药物对心脑血管栓塞的治疗具有十分重要的作用。血小板表面具有多种受体,在受到各种诱导剂刺激以后,就会被激活,进而发生聚集,引发血栓。目前,被研究的较多的受体为P2Y12受体,相应地,也有很多有效的P2Y12受体拮抗剂被开发出来,如：氯吡格雷(Clopidogrel)和普拉格雷(Prasugrel)等。我们对P2Y12受体拮抗剂AR-C69931MX的进行改造,得到了一序列新的化合物,发现其中BF066具有良好的稳定性,血小板抗性,和较低的出血副作用。我们研究了BF066在体外对血小板聚集,致密颗粒内容物的释放,PDE酶活性和血小板铺展的影响,并对其作用机制进行了初步探索。并通过与氯吡格雷作用效果的比较,探究了BF066在小动物体内的作用效果,以及BF066产生的出血副作用。方法：①体外人血血小板聚集实验,检测BF066对血小板活性的影响,以及潜在机制的初步探究；②利用虫荧光素-虫荧光素酶检测BF066对血小板聚集过程中ATP释放的影响；③LISA试剂盒测试BF066对血小板活化产生TXB2的影响；④高效液相色谱法检测BF066对磷酸二酯酶活性的影响；⑤血小板铺展实验检测BF066对血小板铺展的影响；⑥小鼠肠系膜微动脉损伤模型检测BF066对小鼠活体内血栓形成的影响；⑦小鼠体内-体外聚集实验检测BF066对小鼠血小板活性的影响；⑧断尾出血实验检测BF066的出血副作用检测。结果：①体外实验中,我们发现在经过阿司匹林处理的血小板体系中,BF066在浓度为30μM时,BF066可以对ADP诱导的血小板聚集产生约80%的抑制。在1～100μM范围内可以浓度依赖性地抑制血小板的聚集。IC50为5.23μM。100μM BF066可以完全抑制由ADP诱导的血小板ATP释放。②血小板的活化可以经由多种诱导剂刺激以后通过复杂的信号通路完成。我们在体外实验中也发现10μM BF066对不同的血小板诱导剂诱导的聚集具有不同程度的抑制作用。在未经阿司匹林处理的血小板体系中,10μM BF066可以完全抑制0.5mM花生四烯酸诱导的血小板的聚集和ATP的释放,30μM BF066可以完全抑制2ng/ml collagen诱导的血小板ATP释放,1μM U46619和100μMAYPGKF诱导的ATP释放则在BF066浓度为100μM时被完全抑制。③通过ELISA实验测量TXB2,我们还发现,BF066对ADP诱导的血小板活化产生的TXB2形成无显着影响。④在探究了BF066的作用效果之后,我们还对其作用机制进行了研究。发现BF066对血小板的抑制作用可以被Adenosine加强,而且其抑制效果还可以被Adenosine受体A2A的拮抗剂SCH58261部分逆转。⑤为探索其不能全部逆转的原因,我们通过高效液相色谱实验研究了BF066对血小板PDE酶活性的影响,并且发现BF066可以浓度依赖性地抑制PDE酶的活性,300μM BF066对PDE酶的活性产生高达80%以上的抑制,作用效果超过了PDE酶非选择性抑制剂IBMX。⑥Thrombin诱导的血小板铺展实验中,3-30μM BF066也随着浓度的升高而对血小板的铺展不断地加强。30μM BF066对血小板铺展的影响程度和PI3K的抑制剂LY294002的作用效果相似,表明BF066可能通过复杂的信号通路对血小板内PI3K磷酸化反应的影响,而达到良好的血小板抑制效果。⑦为了进一步检验BF066在小鼠活体内的作用效果,我们用共聚焦显微镜观察记录了FeC13诱导的C57BL/6小鼠肠系膜损伤模型中血栓的形成情况。实验中,我们发现,和尾静脉注射生理盐水的空白对照相比,按照29mg/kg比例尾静脉注射BF066实验组小鼠在肠系膜小动脉在受到FeC13刺激以后,第一个直径大于20μm的栓块的形成时间和稳定存在2分钟以上的栓块数都显着降低,且12分钟处无法形成稳定完全的血管栓塞。作用效果和氯吡格雷相似。⑧同样,以氯吡格雷为对照,我们还通过小鼠断尾取血试验研究了BF066对出血副作用的影响,发现BF066处理后的小鼠出血量显着低于氯吡格雷处理过的小鼠。结论： BF066是一种对血小板活性具有良好的双重抑制效果,可以通过与A2A受体和PDE酶作用发挥对血小板功能的抑制作用,且出血副作用远小于现有抗血栓药物氯吡格雷的新型化合物,具有良好的临床开发前景。
黄曼婷[10]2017年在《柚皮素通过P2Y_(12)受体信号通路抑制血小板活性和动脉血栓形成》文中指出目的:冠状动脉粥样硬化心脏病是世界范围内患病率和致死率最高的疾病之一,为我国居民疾病死亡构成的首位。血小板功能亢进或异常激活引起的血管内血栓形成是此类疾病的病理基础。冠状动脉粥样硬化斑块的破裂或表面损伤,引起循环血液中的血小板在受损血管内膜下的黏附及聚集,始动冠状动脉血栓的形成。针对血栓形成的始动环节——血小板黏附、聚集,目前抗血小板聚集药物已成为治疗动脉血栓性疾病的最主要治疗手段。目前临床上比较成功的抗血小板聚集药物主要有环氧化酶抑制剂阿司匹林、P2Y12受体拮抗剂氯吡格雷、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂西洛他唑和膜糖蛋白受体GPⅡb/Ⅲa拮抗剂阿昔单抗等。尽管目前的抗血小板药物在冠心病等动脉血栓性疾病治疗方面疗效显着,但同时出现出血、药物抵抗等不良反应影响着临床治疗。近年来,许多中药复方、有效成分及单体已被证实具有良好的抗血小板、抗血栓作用。利用传统中药多途径多靶点抗血小板聚集的优势,开发新型、安全有效的抗血小板药物用于防治冠心病等动脉血栓性疾病具有重要实践意义。化橘红为芸香科植物化州柚或柚的未成熟或近成熟的干燥外层果皮,为传统中医常用的理气化痰的要药,目前在临床上被广泛用于呼吸系统、消化系统和心血管系统疾病。化橘红富含黄酮类成分,其中,柚皮素属于二氢黄酮类化合物,是化橘红的主要有效成分,也是其“化痰”作用的有效成分之一。现代药理研究证明,柚皮素具有抗炎症、抗氧化、降血脂、抗心律失常及抗动脉粥样硬化等多种药理活性,在防治心血管疾病方面越来越受到重视,可被开发应用于医药、食品等领域。目前,有关柚皮素对血小板功能和血栓形成的影响尚未见详细报道。我们前期研究发现柚皮素能显着抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集,但是其具体抗血小板作用机制尚不明确。因此,为了深入探讨柚皮素抗血小板的潜在机制,本课题以柚皮素对P2Y12受体信号途径的影响为切入点,研究柚皮素对血小板的功能、信号和动脉血栓形成的影响,以探讨柚皮素抗血小板的潜在靶点。方法:1.柚皮素抗血小板功能研究制备大鼠富血小板血浆(PRP)或洗涤血小板,采用血小板聚集仪观察柚皮素和柚皮苷对ADP诱导的PRP或洗涤血小板聚集的影响,同时观察柚皮素对不同刺激剂(ADP、胶原和凝血酶)诱导的洗涤血小板聚集的影响;采用乳酸脱氢酶(LDH)法检测柚皮素对血小板的毒性作用;采用流式细胞术检测不同浓度柚皮素对ADP刺激的血小板P-选择素表达和纤维蛋白原结合的影响,此外,使用Fluo3-AM负载血小板,采用流式细胞术检测柚皮素对ADP诱导的血小板内游离Ca2+水平的影响;采用荧光显微镜观察不同浓度柚皮素对血小板在固化纤维蛋白原上的扩展和在固化胶原上的黏附的影响;观察柚皮素对斑块回缩的影响。2.柚皮素抗血小板作用机制研究洗涤血小板孵育柚皮素后,给予ADP(10 μM)刺激血小板活化,裂解血小板,采用 Westem blot 技术检测柚皮素对 PI23Kp110β 蛋白表达,Akt(Ser473/Thr308)、ERK1/2(Thr202/Tyr204)和GSK3β(Ser9)的磷酸化表达,以及协同给予PI3K抑制剂后血小板Akt磷酸化表达的变化,并采用血小板聚集仪观察柚皮素协同给予PI3K抑制剂后对血小板聚集的影响;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测柚皮素对ADP(10 μM)诱导的血小板内cAMP和cGMP水平的影响,并进一步测定柚皮素对静息状态下血小板内cAMP、cGMP水平的影响;通过使用高效液相色谱法检测酶反应体系中剩余底物(cAMP或cGMP)的含量,进而反映柚皮素对血小板提取的磷酸二酯酶(PDE)活性的作用;采用Western blot检测柚皮素对ADP刺激的血小板内p>VASP(Ser157)、p-VASP(Ser239)蛋白水平,以及分别给予蛋白激酶A(PKA)抑制剂H89、蛋白激酶G(PKG)抑制剂Rp-8-Br-PET-cGMPS和蛋白激酶C(PKC)抑制剂GF109203X预先孵育血小板后,再用柚皮素处理,然后给予ADP刺激,观察抑制剂是否影响柚皮素对p-VASP(Ser239)蛋白水平的作用;采用血小板聚集仪进一步观察PKA抑制剂、PKG抑制剂预先孵育血小板后,再用柚皮素处理,是否影响柚皮素抑制ADP诱导血小板聚集的作用;另外,采用血小板聚集仪观察柚皮素与P2Y1、P2Y12受体拮抗剂合用对ADP诱导的血小板聚集的影响。3.柚皮素对整体动物血栓与凝血系统的作用研究SD大鼠分别给予柚皮素高(800 mg/kg)、中(400 mg/kg)、低(200 mg/kg)剂量和氯吡格雷(7.875 mg/kg)连续灌胃7 d后,制备PRP,采用血小板聚集仪测定柚皮素体内给药对ADP诱导的大鼠血小板聚集的影响;血小板聚集反应结束后,裂解血小板并提取蛋白,采用Western blot检测柚皮素对PI3Kp110β蛋白表达,Akt(Ser473/Thr308)和ERK1/2(Thr202/Tyr204)磷酸化表达的变化;建立FeC13诱导大鼠颈动脉血栓模型,采用超声血流仪检测柚皮素对颈动脉血流阻塞时间的影响,并剪取大鼠造模动脉进行H&E染色,观察血管组织形态学改变;采用小鼠断尾出血实验考察柚皮素对出血时间的影响;通过凝血四项考察柚皮素对大鼠凝血系统的影响。结果:1.柚皮素抗血小板功能研究①在PRP中,柚皮素(100 μM～800 μM)和柚皮苷(400 μM～800 μM)能显着抑制ADP(10 μM)的血小板聚集;在洗涤血小板中,柚皮素(100 μM～800μM 和柚皮苷(100μM～800μM)能显着抑制ADP(10μM)的血小板聚集;无论在PRP或者洗涤血小板中,柚皮素抑制ADP诱导的血小板聚集活性显着高于柚皮苷,此外,与在PRP抑制血小板聚集活性比较,柚皮音和柚皮素在洗涤血小板中抑制血小板聚集的活性显着提高;柚皮素能明显的抑制ADP(10μM)、凝血酶(0.2 U/mL)和胶原(2 μg/mL)诱导的洗涤血小板聚集,在相同浓度范围内(100 μM～800 μM),柚皮素对ADP引起的血小板聚集抑制作用效果最强。②柚皮素在100 μM～1600 μM的浓度范围内并不影响血小板膜的完整性,对血小板没有毒性作用。③柚皮素能明显抑制ADP刺激的血小板P-选择素表达。④柚皮素浓度在400μM～800μM的范围内可以明显抑制由ADP(10μM)诱导的血小板内Ca2+增加。⑤柚皮素(400 μ～800 μM)能显着抑制ADP诱导的纤维蛋白原结合,证明了柚皮素能抑制整合素αⅡbβ3介导的“由内-向外”信号。⑥柚皮素能显着抑制血小板在固化纤维蛋白原上的扩展,并能抑制血小板的斑块回缩,证明了柚皮素能抑制整合素αⅡbβ3介导的“由外-向内”信号。⑦柚皮素(200 μ～800 μM)能显着抑制血小板在固化胶原上的黏附。2.柚皮素抗血小板作用机制研究①柚皮素能明显的抑制ADP刺激的血小板内PI3Kpll0β蛋白表达、Akt(Ser473/Thr308)和 ERK1/2(Thr202/Tyr204)的磷酸化,但不影响 GSK3β(Ser9)磷酸化,同时,PI3K广谱抑制剂LY294002能增强柚皮素对Akt磷酸化及血小板聚集的抑制作用。②柚皮素(100～800 μM)剂量依赖性的抑制ADP诱导的血小板cGMP下降,而并不改变cAMP水平,此外,柚皮素浓度在400 μM～800 μM的范围内可以明显增加静息血小板内cGMP的水平,而并不影响血小板内cAMP的水平。③柚皮素(200μ～800 μM)在从大鼠血小板提取的PDE酶反应体系中,可显着升高酶底物cAMP或cGMP的剩余含量,证明柚皮素有抑制血小板内PDE酶活性的作用。④柚皮素(100μM～800 μM)可明显抑制由ADP诱导的p-VASP(Ser239)降低,但不影响p-VASP(Ser157)的蛋白水平,预先孵育PKG或PKC抑制剂并不影响柚皮素对p-VASP(Ser239)蛋白水平的作用,而预先孵育PKA抑制剂后,则能降低柚皮素对p-VASP(Ser239)蛋白水平的作用。⑤PKA抑制剂能逆转柚皮素介导的抑制ADP诱导的血小板聚集,而PKG抑制剂并不影响其作用。⑥P2Yi受体拮抗剂MRS2179、P2Y12受体拮抗剂MRS2395与柚皮素合用,均表现出协同抑制ADP诱导的血小板聚集的作用。3.柚皮素对整体动物血栓与凝血系统的作用研究①柚皮素体内给药能剂量依赖性的抑制ADP诱导的大鼠血小板聚集。②Western blot结果显示,柚皮素体内给药能显着抑制ADP刺激的血小板内Akt(Ser473/T3r308)和ERK1/2(Thr202/Tyr204)的磷酸化,但不影响PI3Kp110β的蛋白表达。③柚皮素(800 mg/kg)可以显着延长FeCl3诱导的大鼠颈总动脉血栓形成时间,血管病理切片显示柚皮素可以减轻血栓形成和血管内皮损伤。④柚皮素对小鼠断尾后的正常止血没有影响。⑤柚皮素不影响大鼠的凝血系统功能,相比之下,氯吡格雷能明显降低纤维蛋白原含量和延长凝血时间,表现出强大的抗凝作用。结论:柚皮素具有显着的抗血小板、抗动脉血栓作用,且没有明显的出血副作用,其抗血血小板作用机制为抑制PI3K通路和通过升高血小板内cGMP水平和PKA依赖的信号通路来介导VASP的磷酸化,推测P2Y12受体可能是柚皮素抗血小板活性作用的靶点。我们的研究为开发柚皮素作为一种新的安全有效的抗血小板药物提供了有价值的实验依据。
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