周峻[1]2000年在《细胞周期相关蛋白在舌癌中的表达及正反义cyclin A基因转染对舌癌细胞Tca8113的生物学效应》文中研究指明细胞周期蛋白(cyclin)是调节细胞周期活动的重要蛋白质，在细胞的增殖，肿瘤的发生中具有重要作用。细胞周期是连续分裂的细胞从一次分裂结束到下一次分裂完成所经历的整个连续过程，在此过程中细胞遗传物质复制、各种组分加倍，然后平均分配到两个子细胞中，细胞在细胞周期中顺序经过G_1、S、G_2和M期而完成其增殖。近年来对细胞周期调控的分子机制的研究有突破性进展，人们已经认识到细胞的正常生长周期由一系列细胞自身存在的蛋白来控制，已证实哺乳动物的cyclin有8种，它的表达量随细胞周期各个时相的转换而改变，作为调节亚基与相应的Cdk形成复合物并正调节Cdk的活性，不同的cyclin在不同的时相通过相应的Cdk起到促进细胞完成周期的作用，其中cyclin A／Cdk2是S期和G_2期所必需的。cyclin的过度表达和错误调控均有可能导致恶性转化，有人提出细胞周期蛋白的分子可能是原癌基因。已知细胞由G1→S→G2→M期的转换过程中存在着几个限制点，其中G2／S限制点是调控细胞周期进程的关键，cyclin A的合成在细胞周期由G_1→S期时明显增加，证明cyclin A为S期的特征性细胞周期蛋白，它存在于细胞核中具有有丝分裂作用，在G_1→M期转换中与cyclin B起协同作用。 舌癌是常见的口腔颌面部恶性肿瘤，治疗的主要手段仍是传统的手术、放疗、化疗等综合疗法，但随着对舌癌遗传学研究的深入及分子生物学技术
杨连甲, 周峻[2]2001年在《细胞周期相关蛋白在舌癌中的表达及正反义cyclinA基因转染舌癌细胞Tca8113的生物学效应》文中进行了进一步梳理细胞周期蛋白 (cyclin)是调节细胞周期活动的重要蛋白质 ,在细胞的增殖 ,肿瘤的发生中具有重要作用。已证实哺乳动物的 cyclin有 8种 ,作为调节亚基与相应的 Cdk形成复合物并正调节 Cdk的活性。不同的 cyclin在不同的时相通过相应的
刘文书[3]2004年在《人p27kiplcDNA克隆及其对人舌癌细胞系Tca8113细胞生物学作用的研究》文中研究指明目的：舌鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，它生长快，浸润强，早期常有淋巴结转移，治疗效果不够理想。近年来，随着分子生物学的快速发展，基因治疗在肿瘤治疗中表现出不可估量的作用。本实验以体外培养的人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113为研究对象。将克隆的人p27kip1基因连接到pcDNA3载体上，通过脂质体介导转染Tca8113细胞。探讨其对人舌癌细胞系Tca8113细胞的生物学作用。方法：从正常肝组织中，提取组织中的总RNA。应用RT-PCR将RNA逆转录为cDNA。参照Gene Bank中人p27kip1 cDNA序列，设计2个引物，应用PCR扩增p27kip1 cDNA。将PCR产物行TA克隆进行测序。测序后选择真核表达载体pcDNA3构建重组表达质粒。将pcDNA3-p27kip1和pcDNA3质粒DNA分别用脂质体包裹转染培养细胞，而后通过G418培养液进行筛选，应用PCR法鉴定p27kip1基因转染的Tca8113细胞株。采用流式细胞术检测p27kip1蛋白的表达；凋亡相关蛋白Bcl-2的表达；细胞周期及细胞凋亡。用MTT法检测p27kip1基因转染对Tca8113细胞生长的影响；检测化疗药物对p27kip1基因转染的Tca8113细胞生长的影响。结果：1.经测序我们所获得的p27kip1cDNA与Gene Bank登录的序列一致为具有完整阅读框架的p27kip1基因。成功地构建了pcDNA3-p27kip1重组表达质粒，pcDNA3-p27kip1重组表达质粒经酶切鉴定正确。筛选出了抗G418阳性细胞克隆，建立二个新的细胞株。分别命名为：转染质粒pcDNA3-p27kip1的细胞株为Tca-P27；转染空载体pcDNA3的细胞株为Tca-P3。应用PCR鉴定，pcDNA3-p27kip1质粒转染的Tca8113细胞基因组DNA出现p27kip1cDNA扩增带，Tca8113细胞和转染空载体pcDNA3的Tca-P3细胞基因组DNA的PCR产物为阴性。证明了pcDNA3-p27kip1质粒成功地转染入Tca8113细胞。2.流式细胞术检测p27kip1蛋白的表达结果以p27kip1蛋白表达的阳性细胞百分数表示。Tca-P27细胞p27kip1蛋白表达的阳性细胞百分数明显高于Tca-P3、Tca8113细胞，差异显著（P<0.05）。Tca8113与Tca-P3细胞p27kip1蛋白阳性细胞百分数无显著性差异（P>0.05）。显示转染p27kip1基因的<WP=91>Tca8113细胞获得了p27kip1蛋白的高表达。3.MTT法检测Tca8113细胞、Tca-P3细胞、Tca-P27细胞24h(小时)、48h、72h、96h OD值，以OD值代表细胞相对数量，结果Tca-P27细胞增殖速度明显低于Tca8113细胞和Tca-P3细胞。24h、48h，Tca-P27细胞比Tca8113、Tca-P3细胞增殖速度慢，72h、96h时，Tca-P27细胞出现增殖下降。而Tca8113、Tca-P3细胞在24h、48h、72h、96h呈持续增殖状态，三者增殖速度差异显著（P<0.05）。显示转染p27kip1基因后抑制了Tca8113细胞生长。4.流式细胞术检测细胞周期 结果Tca-P27细胞G0/G1期占细胞百分数明显高于Tca-P3和Tca8113细胞G0/G1期细胞百分数，显著差异（P<0.05）。Tca-P27细胞出现了G0/G1期阻滞。表明转染外源性p27kip1基因在Tca8113细胞中的高表达抑制了细胞周期向S期过渡，使细胞阻滞于G0/G1期，抑制了细胞的增殖。G2/M和S期所占细胞百分数Tca-P27细胞明显低于Tca8113细胞和Tca-P3细胞所占的细胞百分数（P<0.05）。通过计算细胞的增殖指数，Tca-P27细胞增殖指数明显低于Tca-P3细胞和Tca8113细胞的增殖指数。三者增殖指数比较差异显著（P<0.05）。显示了转染外源性p27kip1基因，使Tca8113细胞出现G0/G1期阻滞，细胞增殖下降，抑制了细胞生长。5.流式细胞术检测凋亡结果 在G1期前Tca-P27细胞出现了凋亡峰，表明Tca-P27细胞出现了凋亡。Tca8113细胞没有明显凋亡峰出现；Tca-P3细胞也没有明显凋亡峰出现，Tca-P27细胞凋亡指数明显高于Tca8113细胞和Tca-P3细胞的凋亡指数，差异显著（P<0.05）。显示了转染p27kip1基因由于p27kip1基因的高表达，诱导了Tca8113细胞出现了凋亡。6.流式细胞术检测Bcl-2蛋白的表达结果以Bcl-2蛋白表达阳性细胞百分数表示，Tca-P27细胞阳性细胞百分数明显低于Tca8113细胞和Tca-P3细胞阳性细胞百分数，差异显著（P<0.05）。Tca8113细胞与Tca-P3细胞阳性细胞百分数比较无显著差异（P>.05）。显示了转染p27kip1基因由于p27kip1基因的高表达，引起了凋亡相关蛋白Bcl-2的表达的下调。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，推测转染外源p27kip1基因诱导了Tca8113细胞的凋亡，可能与Bcl-2蛋白表达下调有关。7.用MTT法对8种化疗药作用Tca-P27细胞、Tca-P3细胞、Tca8113细胞，24h、48h测OD值计算化疗药对三组细胞的生长抑制率。结果顺铂、丝裂霉素、氟尿嘧啶对三组细胞都有明显的抑制作用。平阳 霉素对三组细胞有一定的抑制作用，但以上化疗药对三组细胞的抑制率比较无显著差异（P>0.05）均未显示出转染p27kip1基因有提高以上化疗药对Tca8113细胞的生长抑制作用。环磷酰胺、甲氨蝶呤、阿霉素对三组细胞无明显抑制作用。长春新碱对Tca-P27细胞抑制率明显高于Tca8113细胞和Tca-P3细胞，差异显著（P<0.05）。随时间的增加，细胞抑制率增高（P<0.05）。显示出转染p27kip1基因提高了长春新碱对Tca8113细胞的生长抑制作用。长春新碱使<WP=92>转染外源p27kip1基因的Tca8113细胞抑制率增加，推测可能因长春新碱作用于M期及其干扰细胞肌醇磷脂代谢而影响细胞增殖。同
叶学红[4]2007年在《一氧化氮与舌鳞状细胞癌放化疗敏感性研究》文中研究指明口腔鳞状细胞癌发病率居于恶性肿瘤第十位,居口腔颌面部恶性肿瘤死亡率首位,且其发病率和死亡率均有明显上升趋势。虽然在过去的数十年里,口腔癌的诊断和治疗取得了很大成就,但平均5年生存率仍然只有50%。为了保存器官的完整性以及减少术后外观及功能影响,美国癌症联合会(AJCC)已经将单纯放射治疗列为Ⅰ期和Ⅱ期肿瘤最佳治疗方法之一。放疗及化疗是头颈部鳞状细胞癌综合序列治疗的重要治疗手段,尤其是术前放化疗,不但能缩小原发肿瘤的体积,降低肿瘤浸润程度,而且可以降低癌旁淋巴结的受侵率,从而增加外科手术的切除率和肿瘤的控制率。尽管如此,口腔颌面部鳞状细胞癌具有中等程度的放射抗性,在根治性放疗剂量6000-7000cGy照射后,仍有部分肿瘤细胞不能被杀死,因此,积极探讨化、放疗增敏的新方法成为研究热点之一。而化学治疗在进一步提高恶性肿瘤患者生存率方面有巨大发展前景,能找到一种对肿瘤化疗敏感且不良反应小的药物,对于提高化疗效果起着决定性作用。一氧化氮(Nitric oxide,NO)作为一种重要的生物活性分子,其抗肿瘤特性已经越来越得到重视。NO参与体内一系列生理和病理条件下的生物过程,调节循环、神经、免疫等一系列生理活动,如血管扩张、血管通透性、血小板粘附和聚集、神经信号传递、宿主防御反应等,同时也参与包括肿瘤在内的病理过程,在肿瘤生物学上的作用错综复杂。综合而言,NO具有几个方面的量效效应:生理情况下,对正常细胞来说,适量水平的NO在信号转导、机体防御和抗基因突变方面有重要的生理功能,对细胞有保护作用;而在病理状态下,依赖于NO生成的浓度、时间和效应部位,不同条件下在体内具有促瘤或抗瘤两种作用。持续低浓度的NO损伤DNA,导致基因突变,诱发癌变,并通过促进肿瘤血管生长等效应促进肿瘤的生长和转移;高浓度的NO则通过产生细胞毒性和诱导细胞凋亡等途径产生抗瘤效应。内源性NO主要由一氧化氮合酶(NOS)催化生成,而诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是催化精氨酸合成NO的关键酶。iNOS在肿瘤的发生、发展、转移及治疗等各个方面都起到调节作用。人类肿瘤中的iNOS表达升高主要与肿瘤的生长与转移有关,因为肿瘤组织中产生的NO水平比NO发挥细胞毒作用和凋亡诱导效应所需的NO水平至少要低1～2个数量级。从口腔粘膜癌前病变发展到鳞状细胞癌过程中,iNOS表达呈上升趋势,表明高水平NO是口腔鳞癌生长的早期条件,它作为iNOS的催化产物,通过生成有毒代谢产物介导DNA损伤;同时促进前列腺素PGE_2的合成,促进肿瘤血管生成、增加血管通透性。重度异常增生中iNOS的高表达和强染色可能是其发展为侵袭性癌的促进因素。利用NO的抗肿瘤特性来提高放疗与化疗的疗效,是肿瘤治疗的重要途径。本课题以人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113为研究对象,第一部分采用NO供体硝普钠(SNP,Sodium nitroprusside),研究不同作用浓度下外源性NO的放射增敏及凋亡诱导作用。结果表明,SNP的细胞增殖抑制作用呈时间及剂量依赖性,对Tca8113细胞有明显的放射增敏作用,并能够使细胞周期产生G_2/M期阻滞。SNP的细胞增殖抑制作用及放疗增敏作用通过细胞凋亡而实现,可能与Caspase细胞凋亡通路有关。但采用NO供体药物,模拟体内高浓度NO的研究手段仅限于体外实验,随着NO浓度的增加,对机体的损伤也逐渐加大,可能导致严重的低血压,甚至危及生命,而且存在耐药性、全身不良反应等毒副作用,甚至可能增加肿瘤血供和供氧,有潜在的促进肿瘤生长的危险,使其应用受到一定限制。在第一部分研究工作的基础上,第二部分课题采用脂质体介导的方法将携带诱导性一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因的质粒导入人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113中,提供既增加NO产量,又避免发生全身毒副反应的NO供体方法,研究细胞转染方法的有效性及转染前后对细胞增殖能力的影响。研究结果显示,iNOS基因转染使Tca8113细胞稳定且高表达iNOS,增加NO含量,促进了肿瘤细胞增殖,并使细胞周期产生G_2/M期阻滞。第三部分在前两部分工作基础上进一步探讨iNOS基因成功转染后,Tca8113细胞化疗及放疗敏感性的改变及初步机理。第一部分硝普钠联合直线加速器协同诱导舌癌细胞凋亡的实验研究研究外源性一氧化氮供体SNP对人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113细胞的增殖抑制作用,以及联合直线加速器放疗的凋亡诱导作用。采用MTT法观察不同浓度和不同作用时间的SNP对Tca8113细胞的增殖抑制作用,并进行不同SNP作用浓度下的细胞周期分析。同时,对比研究单纯应用SNP,单纯放疗及两者联合应用对Tca8113细胞的凋亡诱导作用;HE染色光学显微镜下观察细胞形态学变化,Hoechest33258染色荧光显微镜观察细胞核形态学变化,DNA凝胶电泳及Annexin-V/PI双标记等分析细胞凋亡。Western blot检测Caspase—3蛋白的表达,同时采用流式细胞仪分析活性Caspase—3的表达情况。结果显示:不同浓度(0.1,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mmol/L)的SNP对Tca8113细胞均有抑制作用,但0.1mmol/L的小剂量作用12h,24h后,虽然细胞的存活率有所下降,分别为96.61%和89.64%,但和同一时间段对照组Tca8113细胞比较无显著性差异(P＞0.05)。随着浓度升高及作用时间延长,细胞存活率明显下降,大剂量的5mmol/L即使只作用12h,细胞的存活率也只有19.53%,作用24h的IC_(50)约为2mmol/L。不同剂量SNP使用后,在各个放射剂量下,细胞存活率与对照组比较均明显下降,而且呈浓度依赖性。0.5mmol/L和1mmol/L SNP剂量作用下,和对照组比较,放射敏感性分别增加了2.56和4.97倍(用IC_(50)计算)。对照组Tca8113细胞单纯采用直线加速器放疗后,其细胞存活率随放射剂量的增加而逐步降低,2Gy时为89.67%,5Gy时还有80.70%的存活率,在8～12Gy的较高剂量下,细胞存活率才开始出现明显下降,IC_(50)为9.44Gy,表现为对放射治疗相对不敏感。而2mmol/LSNP因为药物剂量较大,在单独使用下细胞存活率就已经约为50%,联合放射治疗下其细胞存活率随放射剂量的增加呈指数下降,2Gy时细胞存活率只有37.52%,而Tca8113对照组存活率达89.67%,两者之间比较有显著性差异(P＜0.001),同样表现为较强的增敏效应。不同浓度SNP作用24h后,细胞周期发生显著变化,出现明显的G_2/M期比例增多现象,各浓度SNP作用后的G_2/M期比例与Tca8113对照组比较均有显著性差异(P＜0.05),但各个SNP组之间G_2/M期比例比较未见明显差异(P＞0.05),说明G_2/M期阻滞无浓度依赖性。AnnexinV/PI双标记染色实验结果显示,SNP各个浓度作用组以及SNP1mmol/L联合2Gy直线加速器放疗组早期细胞凋亡百分率与Tca8113对照组比较均有显著差异(p＜0.05)。SNP作用下,随着浓度增加,细胞早期凋亡百分率缓慢上升,各个浓度之间比较有显著性差异(p＜0.05),表现为浓度依赖性;而SNP1mmol/L联合2Gy直线加速器放疗组早期细胞凋亡百分率最高,达到44.67%±3.50,与其它各组比较均有显著性差异(p＜0.05),形态学观察结果及DNA琼脂糖凝胶电泳的DNA片断化均证实细胞发生凋亡。Western blot检测结果发现,Tca8113细胞没有出现Caspase-3蛋白条带,而SNP各个浓度组及SNP 1mmol/L联合2Gy直线加速器放疗组均有32KDa的Caspase-3条带,SNP 0.5mmol/L组蛋白表达较其它几组低。而流式细胞仪活性Caspase-3测定结果表明:Tca8113细胞基础Caspase-3活性很低,只有3.0%±1.83,而SNP1mmol/L组、SNP2mmol/L组及SNP1mmol/L联合2Gy直线加速器放疗组细胞的Caspase-3活性明显升高,分别达到18.91%±2.59、80.4%±5.96和92.8%±3.87,三组分别与Tca8113对照组比较,均有显著性差异(P＜0.001),而三组之间比较也有显著性差异(P＜0.05)。实验结果提示:SNP在体外对Tca8113细胞具有明显的细胞增殖抑制效应,其细胞毒性作用表现为浓度依赖性和时间依赖性;SNP能够使细胞周期发生变化,产生G_2/M期阻滞;SNP对Tca8113细胞有放射增敏作用;其细胞毒性效应用及放疗增敏作用通过细胞凋亡而实现,与Caspase细胞凋亡通路有关。第二部分诱导性一氧化氮合酶基因转染对人舌鳞状细胞癌增殖的影响第一部分实验结果表明,外源性NO供体SNP具有细胞增殖抑制作用,对Tca8113细胞有明显的放射增敏作用。利用iNOS基因能上调iNOS蛋白的表达而且增加NO生成的原理,第二部分采用脂质体介导的转染方法将真核表达载体pCMV—iNOS转染入舌癌细胞系Tca8113,得到高表达iNOS的细胞系pCMV-iNOS-Tca,转染空白质粒的细胞系pCMV-Tca,用正常的Tca8113细胞作为对照,以Western blot方法鉴定转染效果;Griess法测定NO浓度,以鉴定iNOS基因的功能状态;倒置显微镜及HE染色进行转染前后细胞形态学观察;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析iNOS基因转染对Tca8113细胞增殖的影响并绘制生长曲线;流式细胞仪检测转染前后对细胞周期的影响及计算增殖指数。Western blot检测结果表明,pCMV-Tca组和Tca8113对照组iNOS蛋白均有表达,但基础水平较低,两者表达量近似。pCMV-iNOS-Tca组iNOS蛋白表达明显上调,说明转染iNOS基因后细胞获得正常表达iNOS蛋白的功能;Griess法转染前后培养不同时间,细胞培养上清液的NO含量检测结果表明,三组细胞NO含量随着培养时间的延长都逐步升高,但pCMV-iNOS-Tca组在培养12h时NO含量就明显升高,达153.45±26.23μmol/L,而Tca8113组和pCMV-Tca分别只有28.18±7.44和34.45±9.67μmol/L,各个检测时间段都明显低于iNOS转染组,统计学检验有显著性差异(P＜0.001),而Tca8113组和pCMV-Tca组之间各个时间段比较都无显著性差异(P＞0.05)。细胞培养上清液中NO含量增高,证明iNOS基因有分泌一氧化氮的功能,转染有效。MTT法检测细胞生长速度,结果表明:pCMV-iNOS-Tca组细胞的生长速度快于pCMV-Tca组和Tca8113组,但第1d及第2d三组之间并无显著性差异(P＞0.05);从第3d起,pcMV-iNOS-Tca组细胞生长速度加快,与后两组比较有显著性差异(P＜0.05)。而pCMV-Tca组和Tca8113组两组细胞的生长速度相近,两组各个时间段的吸光度值比较均无显著性差异(P＞0.05)。细胞形态学观察结果显示转染前后形态学无明显改变;细胞周期检测结果表明,pcMV-iNOS-Tca组细胞与对照组Tca8113及pcMV-Tca组细胞相比较,细胞周期中G_2/M期比例显著增加,G_2/M期比例与后两组比较有显著统计学差别(P＜0.001),说明iNOS基因能够使肿瘤细胞阻滞于G_2╱M期。而Tca8113与pCMV-Tca组细胞比较,G_2/M期比例无显著性差别。根据细胞周期分布计算出的增殖指数(PI)表明,PCMV-iNOS-Tca组细胞增殖指数明显大于后两组细胞,为78.71%,而后两组分别为54.29%和39.18%。以上结果说明,iNOS基因转染使Tca8113细胞稳定且高表达iNOS蛋白,增加NO分泌量,促进了细胞增殖,并使细胞周期产生G_2/M期阻滞。第三部分iNOS基因转染对Tca8113细胞体外化放疗增敏作用及其机制研究在前两部分研究工作的基础上,进一步探讨iNOS基因对人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113化放疗增敏作用及初步机理。实验分三组:转染iNOS基因的pCMV-iNOS-Tca组,转染空白质粒的pCMV-Tca组以及空白对照Tca8113组。采用MTT法测定转染iNOS基因前后,Tca8113细胞对顺铂、氟脲嘧啶和博莱霉素等化疗药物及直线加速器放疗的敏感性改变,Western blot检测P53蛋白、P21蛋白的表达情况。顺铂、氟脲嘧啶和博莱霉素三种化疗药物对pCMV-iNOS-Tca,pCMV-Tca和Tca8113三组细胞MTT的作用结果显示:pCMV-iNOS-Tca组在顺铂浓度为12.5μmol/ml时就显示了较强的杀伤作用,OD值明显下降,细胞存活率为66.63%,而pCMV-Tca和Tca8113组分别为81.5%和83.51%;随着药物作用浓度提高,其细胞杀伤效应更加明显,至100μmol/ml时细胞存活率只有33.47%,而pCMV-Tca和Tca8113组分别为50.79%和53.21%;pcMV-iNOS-Tca在各个浓度顺铂作用下的OD值,与另外两组比较均有显著性差异(P＜0.05),而Tca8113对照组和空白质粒转染的pCMV-Tca组之间各个顺铂浓度下的OD值比较均无显著性差异(P＞0.05)。而氟脲嘧啶的作用效应与顺铂完全不同:各个作用浓度下,其OD值与对照组比较均无显著性差异,至80μmol╱ml的较大剂量时,pCMV-iNOS-Tca,pCMV-Tca和Tca8113组的细胞存活率分别还有57.33%、55.77%和56.61%,表现为各组对氟脲嘧啶的细胞敏感性无显著性差异。博莱霉素在小剂量的1μmol/ml作用下,三组细胞的OD值无显著性差异(P＞0.05),而随着剂量加大,在5,10,20μmol/ml的作用浓度下,pCMV-iNOS-Tca组的OD值与同一浓度另外两组比较有显著性差异(P＜0.05),至20μmol/ml的较大剂量时,pCMV-iNOS-Tca,pCMV-Tca和Tca8113组的细胞存活率分别只有35.74%、57.04%和57.81%,而pCMV-Tca和Tca8113组之间在各个平阳霉素作用浓度下的OD值比较均无显著性差异(P＞0.05)。与空白对照细胞和空白质粒转染细胞比较,转染iNOS细胞对顺铂、博莱霉素敏感性分别提高了(用IC_(50)比较)4.2倍和超过1.7倍,而iNOS基因转染对氟脲嘧啶敏感性无改变。直线加速器放疗的MTT检测结果显示:pcMV-iNOS-Tca组在2,5,8 Gy放射剂量下其细胞杀伤作用与同一放射剂量下的另外两组比较有显著性差异(P＜0.05),但在12Gy大剂量作用下,pCMV-iNOS-Tca,pCMV-Tca和Tca8113三组细胞的存活率分别只有27.02%、30.01%和28.77%,三组OD值之间比较并无显著性差异(P＞0.05)。三组细胞的IC_(50)分别为5.66Gy、9.11Gy和9.05Gy,pCMV-iNOS-Tca组的放射敏感性明显提高,为pCMV-Tca和Tca8113的1.6倍。Western blot结果显示:转染iNOS基因前,Tca8113细胞无p53蛋白表达,而转染后的pCMV-iNOS-Tca组有极少量p53表达;顺铂及2Gy放射治疗后,两组细胞的p53蛋白表达均明显升高;但各组在药物及放射治疗前后均未出现p21蛋白表达。iNOS基因转染可以使Tca8113细胞对顺铂、博莱霉素的敏感性提高,但不能改变氟脲嘧啶的敏感性;iNOS基因转染还能够使Tca8113细胞对直线加速器放疗的敏感性增加。iNOS的增敏作用是通过调节细胞周期,引起G_2/M期阻滞,以及增加p53的表达而实现的。
彭勇泉[5]2008年在《塞来昔布单药及顺铂、羟基喜树碱联合用药对舌癌细胞株Tca8113作用的研究》文中指出目的:探索塞来昔布单药及塞来昔布与顺铂、羟基喜树碱联合用药对舌癌细胞株Tca8113增殖的抑制效果及其诱导该细胞凋亡的效应,以探索其抗肿瘤机制。方法:采用细胞形态观察法、MTT法、流式细胞术法、DNA电泳法观察检测塞来昔布单药及与顺铂、羟基喜树碱联合用药对舌癌细胞株Tca8113的作用效果,数据处理采用软件spss13.0里的一般线性模型处理方案。结果:镜下可见塞来昔布作用组的Tca8113出现凋亡细胞的形态学改变。MTT法发现塞来昔布抑制该细胞增殖的效果较好,且具有明显的时间-效应、剂量-效应;不同时间段、不同浓度组之间差异显著(P＜0.05),具有统计学意义;塞来昔布具有诱导细胞凋亡的作用,随药物浓度的增加,塞来昔布使细胞的凋亡率增加,并使细胞处于G0/G1期的比例增加,使S期的比例减少,塞来昔布能将Tca8113的细胞阻滞在G0/G1。低浓度的塞来昔布即具有增强顺铂、羟基喜树碱的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的效果,能降低两药的半抑制浓度(IC50),在抗舌癌细胞株Tca8113上表现出较强的联合作用。结论:塞来昔布具有较好的抑制舌癌细胞株Tca8113增殖和诱导该细胞凋亡的作用;塞来昔布能将Tca8113的细胞阻滞在G0/G1期。塞来昔布与顺铂、羟基喜树碱也有较好的联合作用,并且联合作用的大小与联合用药的浓度及作用时间均相关,塞来昔布与羟基喜树碱的联用效果表现为协同作用,而塞来昔布与顺铂的联用效果表现为相加作用。
高振南[6]2002年在《人肿瘤坏死因子-a基因转染对舌癌细胞生物学行为影响的实验研究》文中认为目的:①鉴定、提取和纯化含人肿瘤坏死因子-α(human tumor necrsis factor-α, hTNF-α)基因的pSV23SHTNF 穿梭质粒。②探索利用阳离子脂质体介导pSV23SHTNF穿梭质粒转染Tca8113 舌癌细胞的最佳方法。③探讨hTNF-α基因转染对舌癌细胞生长的影响及其机理。④探讨干扰素-γ(IFN-γ)与hTNF-α基因转染联合应用对舌癌细胞生长的影响。⑤观察人胚成肌细胞转染hTNF-α基因后hTNF-α的表达水平。方法:①Western blot 分析检测hTNF-α克隆化基因在E. coli K12 MC 1061 大肠杆菌中是否有表达。②采用碱裂解提取法及改进的纯化方法获取高纯度的含hTNF-α基因的pSV23SHTNF 穿梭质粒。③用DOSPER 阳离子脂质体介导pSV23SHTNF 穿梭质粒转染Tca8113舌癌细胞后,用免疫细胞化学染色观察hTNF-α基因表达。④用DOSPER阳离子脂质体介导pSV23SHTNF穿梭质粒转染Tca8113舌癌细胞,对照组只给予等量的脂质体,不加入质粒,转染基因24、48、72、92 h 后用ELISA 法检测细胞培养上清液中hTNF-α的浓度,用MTT 法检测舌癌细胞的存活率,并用流式细胞计数分析hTNF-α基因转染抑瘤的机理。⑤将培养细胞分为2 组,其中一组转染hTNF-α基因,另一组不转染。再将每一组又分为5 个小组,每一小组分别加入IFN-γ,使其终浓度分别为0、1、10、100、1000 U/ml,培养48 h后,用MTT法测定Tca8113细胞的存活率。⑥用DOSPER 阳离子脂质体介导pSV23SHTNF 穿梭质粒转染人胚成肌细胞,对照组只给予等量的脂质体,不加入质粒,转染基因24、48、72、92 h 后用ELISA 法检测细胞培养上清液中hTNF-α的浓度,用免疫细胞化学染色观察hTNF-α基因表达。结果:①E. coli K12 MC 1061大肠杆菌表达hTNF-α蛋白,所表达的hTNF-α
陈谦明, 李秉琦, 彭文珍, 傅继梁[7]1996年在《Tca8113细胞株电穿孔法p53基因转染及G418体外筛选条件的研究》文中研究说明通过体外细胞培养方法，研究了进行舌鳞癌细胞株Ｔｃａ８１１３ｐ５３基因电穿孔法转染的最佳实验条件。结果显示在细胞培养至３６ｈ、电场强度为６２５Ｖ／ｃｍ时转染效果最佳，转染后选择剂Ｇ４１８的最佳浓度为３００μｇ／ｍｌ。按此条件已成功地进行了ｐ５３基因的体外转染。
徐秀英[8]2012年在《低糖基化E-钙粘蛋白对舌癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响》文中进行了进一步梳理目的：通过改变E-钙粘蛋白的N-糖基化以增强肿瘤细胞粘附连接和紧密连接的稳定性来抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移可能是一种新的肿瘤基因治疗方法。本实验将研究低糖基化的E-钙粘蛋白质粒转染Tca8113舌癌细胞对舌癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法：1、以Tca8113舌癌细胞系作为研究样本,应用含低糖基化的E-钙粘蛋白(V13)基因的质粒和含野生型E-钙粘蛋白(E-cadherin)基因的质粒分别转染Tca8113舌癌细胞,G418筛选出转染成功的细胞进行细胞培养,并且通过western blot实验检测转染基因的稳定表达。2、通过MTT法绘制细胞生长曲线,观察细胞的增殖能力；3、运用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期,以了解细胞的增殖活性；4、应用BrdU掺入试验测定各组细胞BrdU阳性的比率,以观察各组细胞DNA复制的差异；综合上述三项实验的结果判定低糖基化的E-钙粘蛋白(V13)基因的质粒转染Tca8113舌癌细胞对细胞增殖活性的影响；5、通过Transwell小室体外细胞侵袭实验观察相同条件下各实验组细胞穿膜细胞数的差异,以观察低糖基化的E-钙粘蛋白(V13)基因的质粒转染Tca8113舌癌细胞对细胞侵袭性能的影响；6、通过体外细胞划痕实验计算比较各组细胞间划痕愈合的差异,以得出低糖基化的E-钙粘蛋白(V13)基因的质粒转染Tca8113舌癌细胞对细胞迁移能力的影响。结果：1. Western blot结果显示：低糖基化E-钙粘蛋白(V13)基因质粒和野生型E-钙粘蛋白基因质粒转染舌癌细胞后均稳定表达,以flag抗体作为一抗的western印迹实验结果显示,减少翻译后N-糖基化修饰的低糖基化E-钙粘蛋白(V13)的分子量小于野生型E-钙粘蛋白的分子量,低糖基化E-钙粘蛋白基因转染的舌癌细胞表达的低糖基化E-钙粘蛋白的分子量为120KD,野生型E-钙粘蛋白基因转染表达的野生型E-钙粘蛋白的分子量为150KD,而空白对照细胞无flag标记的蛋白表达。2.MTT结果显示：相对于Tca8113空白对照细胞,低糖基化E-钙粘蛋白(V13)基因转染Tca8113细胞的增殖活性有明显降低,自48小时后V13转染细胞的OD比值显著低于空白对照细胞,而野生型E-钙粘蛋白转染的Tca8113细胞的增殖活性则改变不明显；3.流式细胞术结果显示：相对于Tca8113空白对照细胞,低糖基化E-钙粘蛋白(V13)基因转染Tca8113细胞的S期比率有明显降低(下调了约18.42%),而野生型E-钙粘蛋白转染的Tca8113细胞的S期细胞比率则无显著变化；4. BrdU掺入实验结果显示：Tca8113空白对照细胞Brdu阳性细胞的比率为最高,野生型E-钙粘蛋白转染的Tca8113细胞的Brdu阳性率稍低,两者相比无显著差异(P>0.05),而低糖基化E-钙粘蛋白(V13)基因转染的Tca8113细胞Brdu阳性率则显著降低,与Tca8113对照细胞之间差异显著(P<0.01)即低糖基化E-钙粘蛋白(V13)基因转染的Tca8113细胞合成DNA的能力明显减弱；5. Transwell小室体外细胞侵袭实验结果显示：相对于Tca8113空白对照细胞,低糖基化E-钙粘蛋白(V13)基因转染Tca8113细胞侵袭能力明显降低,而野生型E-钙粘蛋白转染的Tca8113细胞侵袭能力则无明显改变；6.细胞划痕试验结果显示：相对于Tca8113空白对照细胞,低糖基化E-钙粘蛋白(V13)基因转染Tca8113细胞的迁移能力明显降低,而野生型E-钙粘蛋白转染的Tca8113细胞迁移能力则无显著变化；结论：低糖基化E-钙粘蛋白(V13)基因转染比野生型E-钙粘蛋白基因转染Tca8113舌癌细胞能更显著地抑制舌癌细胞的体外增殖、侵袭性和迁移性。本研究为抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移提供了一种合理、可行的新思路、新途径,为用低糖基化E-钙粘蛋白基因转染抑制肿瘤增殖、侵袭和迁移奠定了实验和理论基础。
姜娟[9]2012年在《BMP-2/Noggin相互作用对舌癌细胞增殖活性的影响及机制研究》文中认为舌癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,占口腔颌面部恶性肿瘤的45.9%。舌癌病因至今不明,普遍认为是“癌瘤病因综合作用的”结果。因此,研究舌癌发生发展的机制及治疗方法具有重要意义。随着近年来分子生物学研究的进展,国内外学者认为舌癌的发生是一个由多个基因和细胞因子参与介导的过程,近年研究发现骨形成蛋白及其信号通路在舌癌的发生及发展中发挥重要的作用。骨形成蛋白2(Bone morphogenetic protein-2, BMP-2)是调节骨形成的重要的因子,它在骨骼的胚胎发育、再生修复中起着重要作用。近年研究发现,BMP-2影响不同恶性肿瘤细胞增殖、形成和转移,具有调节恶性肿瘤的生物学行为的作用。Noggin基因对体内骨骼、神经等多个系统的发育和／或重塑起着重要的调控作用。Noggin蛋白是一种BMP-2的细胞外拮抗剂,它可以与BMP-2特异性地结合,阻止BMP-2与其细胞表面的受体结合,从而抑制BMP-2生物学功能的发挥。Noggin和BMP-2的相互调节在多种疾病的发生、发展过程中具有重要作用,通过调节Noggin和BMP-2的相互作用治疗相关疾病,成为现在研究的一个方向。本课题旨在研究外源性BMP-2、BMP-2/Noggin相互作用对舌癌细胞的增殖的影响,并探讨其可能的机制,从而为表达BMP-2肿瘤的临床治疗提供新的实验依据。目的研究外源性BMP-2及BMP-2/Noggin相互作用对舌癌细胞增殖的影响及BMP/Smad信号转导通路变化。方法1、舌癌细胞培养：‘体外培养舌癌细胞系Tca8113细胞,倒置显微镜观察细胞的形态及增殖活性。2、外源性BMP-2对舌癌细胞增殖活性及BMP/Smad信号通路的影响：用不同浓度的BMP-2蛋白(0,20,40,60,80,100ng/ml)作用于体外培养的舌癌细胞,利用倒置显微镜观察细胞生长和形态的变化情况,分别于培养后1,2,3,4,5,6d用甲基偶氮唑盐(MTT)法检测BMP-2对舌癌细胞增殖活性的影响以及其与剂量和时间的关系。Western blot分别检测2d,4d时不同BMP-2浓度(40,80ng/ml)下BMPRⅡ、Smad4蛋白的变化。3、Noggin蛋白对舌癌细胞增殖活性及BMP/Smad信号通路的影响：将传代后细胞加入含40ng/mlBMP-2的培养液中,细胞贴壁24h后,分别加入Noggin蛋白,使培养液的Noggin蛋白浓度分别为0,100,200,300,400,500ng/ml,分别于培养后1,2,3,4,5,6d用MTT法检测Noggin和BMP-2的相互作用对舌癌细胞增殖活性的影响。Western Blot分别检测2d,4d不同Noggin蛋白浓度(200,400ng/ml)下BMPRⅡ、Smad4蛋白的变化。结果1、舌癌细胞培养：舌癌细胞Tca8113细胞生长良好,单个细胞呈三角形或长梭形,立体感不强。集落性生长,增殖较快,约第2天开始进入对数生长期,第4天进入平台期。2、外源性BMP-2对舌癌细胞增殖活性及BMP/Smad信号通路的影响：BMP-2蛋白抑制舌癌细胞的增殖,随浓度增加抑制作用逐渐增强,80ng/ml时抑制作用较强,100ng/ml时趋于稳定。随BMP-2蛋白浓度和时间的增加,BMPRⅡ、Smad4蛋白的表达逐渐增强。3、Noggin蛋白对舌癌细胞增殖活性及BMP/Smad信号通路的影响：Noggin蛋白促进舌癌细胞的增殖,随浓度增加促进作用逐渐增强,400ng/ml时促进作用较强,500ng/ml时趋于稳定。随Noggin蛋白浓度和时间的增加,BMPRⅡ、Smad4蛋白的表达逐渐减弱。结论1、MTT检测显示外源性BMP-2蛋白抑制舌癌细胞的增殖,此抑制作用有时间和剂量依赖性,通过Western Blot检测发现BMP-2对舌癌细胞抑制作用越强,BMP/Smad信号转导通路表达也越强。说明BMP-2可能通过BMP/Smad信号转导通路调控舌癌细胞的增殖。2、通过MTT检测发现BMP-2蛋白拮抗剂Noggin蛋白可促进舌癌细胞的增殖,其机制可能是Noggin拮抗BMP-2蛋白的功能,从而影响其抑制舌癌细胞增殖作用的发挥。Western Blot检测发现Noggin蛋白浓度越高,BMP/Smad信号转导通路的表达越弱。进一步说明BMP-2可能是通过BMP/Smad信号转导通路发挥抑制舌癌细胞增殖的作用。
张茜, 张君, 王旭霞, 薛立伟, 姜娟[10]2012年在《骨形态发生蛋白2基因转染对舌鳞癌细胞体内外生物学行为的影响》文中研究指明目的探讨骨形态发生蛋白2(BMP2)基因转染对体外舌鳞癌细胞的作用及机制,并观察体内转染BMP2基因对严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下移植瘤生长与转移的影响。方法体外培养舌癌Tca8113细胞,将重组腺病毒介导的BMP2(Ad-BMP2)基因分别按0、50、100感染复数(MOI)转染Tca8113细胞后,采用Western blot检测Ad-BMP2组和PBS组细胞中BMP2、Smad1和Smad5表达的差异。建立SCID鼠肿瘤模型并瘤内注射Ad-BMP2基因,观察肿瘤体积的变化及肿瘤转移情况。结果 Ad-BMP2基因成功转染至Tca8113细胞,MOI为100时转染效率较高,Ad-BMP2组和PBS组细胞中BMP2、Smad1和Smad5的表达差异有统计学意义,P<0.05,Ad-BMP2组Smad1和Smad5的表达量与BMP2的浓度呈正比。SCID鼠皮下移植瘤的体积在2周后平均增大0.6 cm3,瘤内注射Ad-BMP2基因后,明显抑制移植瘤的生长。肝、脾、肾、大网膜等脏器均未查见肿瘤转移。结论以腺病毒为载体的BMP2在Tca8113细胞中有效表达,Smad1和Smad5蛋白的表达也显著提高。基因转染BMP2显著抑制SCID鼠舌癌移植瘤的生长。
参考文献：
[1]. 细胞周期相关蛋白在舌癌中的表达及正反义cyclin A基因转染对舌癌细胞Tca8113的生物学效应[D]. 周峻. 第四军医大学. 2000
[2]. 细胞周期相关蛋白在舌癌中的表达及正反义cyclinA基因转染舌癌细胞Tca8113的生物学效应[J]. 杨连甲, 周峻. 口腔颌面外科杂志. 2001
[3]. 人p27kiplcDNA克隆及其对人舌癌细胞系Tca8113细胞生物学作用的研究[D]. 刘文书. 吉林大学. 2004
[4]. 一氧化氮与舌鳞状细胞癌放化疗敏感性研究[D]. 叶学红. 浙江大学. 2007
[5]. 塞来昔布单药及顺铂、羟基喜树碱联合用药对舌癌细胞株Tca8113作用的研究[D]. 彭勇泉. 广西医科大学. 2008
[6]. 人肿瘤坏死因子-a基因转染对舌癌细胞生物学行为影响的实验研究[D]. 高振南. 四川大学. 2002
[7]. Tca8113细胞株电穿孔法p53基因转染及G418体外筛选条件的研究[J]. 陈谦明, 李秉琦, 彭文珍, 傅继梁. 华西口腔医学杂志. 1996
[8]. 低糖基化E-钙粘蛋白对舌癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响[D]. 徐秀英. 山东大学. 2012
[9]. BMP-2/Noggin相互作用对舌癌细胞增殖活性的影响及机制研究[D]. 姜娟. 山东大学. 2012
[10]. 骨形态发生蛋白2基因转染对舌鳞癌细胞体内外生物学行为的影响[J]. 张茜, 张君, 王旭霞, 薛立伟, 姜娟. 山东大学学报(医学版). 2012
标签：肿瘤学论文; 口腔科学论文; 细胞周期论文; 舌癌论文; 显著性差异论文; 细胞增殖论文; 基因合成论文; 细胞转染论文; 质粒载体论文; 肿瘤论文; 癌症治疗论文; 显著性论文;