（2第三军医大学大坪医院病理科 重庆 400042）
【摘要】目的：本文通过两种方法，即直接测序法与扩增突变阻滞系统（ARMS）法，对表皮生长因子受体（EGFR）基因突变检测进行对比。方法：收集2011年7月—2012年11月在第三军医大学附属大坪医院病理科通过病理标本活检确诊为非小细胞肺癌的患者127例，采用ARMS法和直接测序法检测该人群EGFR基因的突变情况。结果：综合两种方法，最终确定有突变的患者为64例，ARMS法检出60例，敏感性为93.75%，测序法检出33例，敏感性为51.56%。ARMS法的检测突变率为47.2%，而直接测序法检测突变率为26.0%.通过两种方法四格表的，得出两种方法的差别具有统计学意义。结论：ARMS法的突变检出率要明显高于测序法（P＜0.05），可见ARMS法是更适合临床应用的方法。
【关键词】 非小细胞肺癌；表皮生长因子；基因突变；测序法；扩增突变阻滞系统
【中图分类号】R730.4 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）18-0040-02
Comparing analysis ARMS and sequencing in detecting 127 NSCLC EGFR mutation
Li Hui1,Wang Qiushi2, Li Zengpeng2, Chen Weixian1(Correspondence author).
1 Clinical laboratory of second hospital of Chongqing medical university, Chongqing , 400000,China;
2 Department of Pathology of daping hospital, Chongqing, 400042,China
【Abstract】Objective This article aims to explore the accurate ,sensitive and convenient method for clinical use in China by compairing direct sequencing and amplification refractory mutation systerm(ARMS),helping to screen out a proper trerapeutic regimen for people. Methods ARMS and Sequencing. Results Soothe two detection metheds are to some extent coincident(K=0.53,P<0.05).Integrating detection results by two metheds,there are 64 cases identified as mutated EGFR.The sensitivity of ARMS is 93.75%,whereas the sensitivity of direct sequencing is 51.56% . The mutation detection rate of ARMS is significantly higher than that of direct sequencing (47.2% vs 26.0%,P<0.05). Conclusion ARMS methed is more sensitive and higher mutantion rate.
【Key words】Non-small-cell lung cancer; Epidermal growth factor receptor;Gene mutation;Direct sequencing;Amplification refractory mutation systerm
EGFR基因位于第七号染色体短臂上（7p12），长约118 kb，由28个外显子组成。其编码的蛋白具有酪氨酸激酶（tyrosine kinase,TK）活性，是NSCLC最常见的驱动基因，据统计，中国NSCLC患者中EGFR突变率约为35%～40%[1]。EGFR诱导癌症至少通过3种机制：EGFR配体的过表达、EGFR的扩增或EGFR的突变活化，其中以EGFR 的突变活化为主要机制。已经检测到的突变数量最多的是非小细胞肺癌[2-3]。测序法是传统广泛应用的方法，在检测EGFR突变中使用较多，但由于其灵敏度有限、检测过程时间长，对技术设备条件要求严格等，在临床应用受到一定限制。而ARMS法由于其灵敏度较高、耗时少、易操作等特点，在各种标本类型中甚至在外周血循环肿瘤细胞DNA中检测EGFR突变也有一定的意义。因此本文通过ARMS法和直接测序法两种检测的对比，来选择更加敏感，准确的EGFR基因检测方法。
1.资料与方法
1.1 标本来源
对2012年7月—2013年11月在第三军医大学附属大坪医院病理科接受EGFR突变检测的NSCLC病人标本进行研究，其中非小细胞肺癌的患者127例，其中：男性76例、女性51例、年龄26～83岁，平均年龄54.5岁。
1.2 仪器与试剂
ARMS试剂盒内含内参基因特异性引物，探针，EGFR基因突变型，内控基因特异性引物，dNTP的溶液，TaqDNA聚合酶，阳性质控品，PCR管，荧光PCR管。
1.3 检测步骤
待测样本进行DNA提取后，使用微量紫外分光光度计(NanoDrop1000)测定DNA浓度及纯度，取10ulDNA样本稀释至100ng∕ul待用。将纯化后的DNA用荧光PCR方法进行检测，得到突变基因的反应曲线。测序法则上测序仪进行检测，结果与EGFR序列进行比对。
1.4 实验结果成功与否判定
NC1-7管的FAM信号应该无曲线升起，PC应有扩增（成典型的S型曲线），切Ct值≦28，则可继续分析；若内参基因（IR）有扩增且19≤Ct值≤25，则可继续分析；若Ct值较小，则可认为DNA样品浓度过高；若其Ct值较大或无扩增，则认为DNA样品浓度过低、发生降解，或含有PCR抑制剂。若内控基因检测（HEX通道）有扩增且Ct≤25，则可继续分析；若其Ct值较大或无扩增，但突变位点检测（FAM通道）有扩增且Ct值≤38，则可继续分析；若其Ct值较大或无扩增，而突变位点检测（FAM通道）无扩增或有扩增但Ct值＞38，则无法继续分析；若样品中某基因突变位点检测（FAM通道）有扩增且Ct值≤35，则判定该样本突变结果阳性；若Ct值＞38或无扩增，则判定该突变结果为阴性；若35＜Ct值≤38，可重复实验，若Ct值仍在此范围内，则判定该样本突变结果为疑似阳性（可能由于突变含量低造成Ct值波动）。而测序法测出的DNA序列则直接与EGFR基因序列进行比对。
1.5 统计学处理
由于是两个率的比较，且又符合四格表资料的卡方检验条件（样本含量）40，理论频数不小于5），故采用四格表资料的卡方检验来比较两个率的差别是否具有统计学意义（P＜0.05）。
2.结果
2.1 在127例两种检测的病人中，两种方法均检测到突变29例，均无突变者63例，AMRS法检测出而测序法未测出者31例，反之4例。
根据上述四格表的分析，通过对计数资料的kappa一致性检验，得出两种方法有一定的一致性（k=0.53，P＜0.05）。综合两种方法，最终确定有突变的患者为64例，ARMS法检出60例，敏感性为93.75%，测序法检出33例，敏感性为51.56%。ARMS法的检测突变率为47.2%，而直接测序法检测突变率为26.0%，通过四格表资料卡方检验对两种方法检出突变率的比较，ARMS法的突变检出率要明显高于测序法（P＜0.05）。
2.2 两种检测方法结果
在127例检测标本中，ARMS共检测到60例突变，突变率为47.2%，有34例21外显子突变（其中32例L858R突变，2个L861Q替换）,占所有突变的56.7%，23例19外显子缺失突变，占所有突变的38.3%，2例18外显子G719C突变，1例20外显子插入突变；直接测序法共检测出33例突变，突变率为26%，其中13例21外显子点突变，17例19外显子缺失突变，2例20外显子插入突变，1例18外显子点突变。
3.讨论
非小细胞肺癌（NSCLC）是一种严重危害人类健康的常见的恶性肿瘤，表皮生长因子受体（EGFR）的基因突变状态是预测表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）疗效的重要指标，所以寻求一个灵敏，快速，准确的检测EGFR基因突变方法是必要的。
测序法是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式，目的是确定重组DNA的方向与结构对突变进行定位和鉴定比较研究，是检测基因突变的金标准。PCR结果判断标准是根据测序峰中是否出现了突变波，其高低影响结果的判断。当突变的肿瘤细胞含量少，导致突变峰低或不能测出时，测序法就可能会出现假阴性的结果。ARMS法由于只扩增突变序列，所以灵敏度会提高，但由于只能测出包含在试剂盒里的已知突变位点，故假阴性也会发生。
测序法需特殊且昂贵设备，条件要求高，反应耗时长（每检测一批样本，前后总耗时超过3天），且存在着操作繁琐，对标本所含肿瘤组织的要求比较高，敏感性不低于30%突变拷贝数。[10]判读结果复杂，对环境和操作者有危害等诸多缺点，因而该方法仅适用于少数技术装备精良的实验室开展，各级医院很少能独立开展，使得其运用受限。而ARMS法是实时荧光定量PCR的一种，具有较高的灵敏度。赵婧雅等[11]的研究表明，对于活检小标本而言ARMS法较直接测序法拥有更高的突变检出率；而对于手术标本无统计学差异由检测结果得知，最终确定有突变的患者为64例，ARMS法检出60例，敏感性为93.75%，测序法检出33例，敏感性为51.56%。ARMS法的检测突变率为47.2%，而直接测序法检测突变率为26.0%。通过四格表资料卡方检验对两种方法检出突变率的比较，ARMS法的突变检出率要明显高于测序法（P＜0.05）。
综上所述，ARMS法比测序法有更高的灵敏度和突变检出率，而且ARMS法简单、快速，适合在临床推广。
【参考文献】
[1]刘标，周晓军.非小细胞肺癌个体化治疗的靶向分子检测[J].临床与实验病理学杂志，2012,28（8）；831-7.
[2]宿杰阿克苏，候英勇，等.PCR直接测序法与ARMS检测非小细胞肺癌EGFR基因突变[J].临床与实验病理学杂志，2014,30（3）：331.
[3]王向迎，刘友如，牛艳洁，等.非小细胞肺癌EGFR基因突变检测技术进展[J].国际呼吸杂志，2012,32（10）：797.
论文作者:李慧1,王秋实2,李增鹏2,陈维贤1(通讯作者)
论文发表刊物:《医药前沿》2018年6月第18期
论文发表时间:2018/7/5
标签：突变论文; 检出论文; 两种论文; 方法论文; 肺癌论文; 基因论文; 细胞论文; 《医药前沿》2018年6月第18期论文;